血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验
血清蛋白质 清蛋白
α1－球蛋白 α2－球蛋白 β－球蛋白 γ－球蛋白
等电点 4.64 5.00 5.06 5.12 6.85～7.3
分子量 69,000 200,000 300,000 90,000～150,000 156,000～950,000
占总蛋白的％ 57～72 2～5 4～9 6.5～12 12～20
正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1．为清蛋白，2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6为点样 原点
注意事项
1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。
2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜 吸水量以不干不湿为宜。
3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜 或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
3.点样：
点样前，将薄膜粗糙面朝上，距一边1.5cm 处用铅笔划一条平行线作为点样标志区。
点样时，用点样器毛吸取血清，在薄膜粗糙 面上轻而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴 极端1.5cm（见图）。此步是实验的关键。
1.5cm
6.5cm
点样区
醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线处为点样位置）
4.电 泳
汇报结束 谢谢观看！ 欢迎提出您的宝贵意见！
• 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色
实验操作
1. 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 将醋酸纤维素薄膜浸于缓冲液中约30min后，取醋酸
纤维素薄膜放在滤纸中并吸干表面液体。整条薄膜颜色 一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择 质地均匀的膜)。 2. 电泳槽的准备
电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不 同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一 根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入 缓冲液中，形成滤纸桥。
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳【原理】由于不同的蛋白分子在同一环境中解离情况不同、分子大小不同等差异，电泳时可将其分离。
醋酸纤维素薄膜电泳具有分离速度快，区带清晰，操作简便等优点。
血清含多种蛋白质，用醋酸纤维素薄膜电泳可分为五个区带，经固定染色后不仅可看到清晰的色带，而且可定量测定，计算出各种蛋白质的百分含量，其正常值如下：A(白蛋白) 57～72%α1球蛋白 2～5%α2球蛋白 4～9%β球蛋白 6.5～12%γ球蛋白 10～20%某些肝、肾疾病上述蛋白含量发生改变。
【仪器】电泳仪 721型分光光度计染液盘漂洗盘镊子(或竹夹子)【试剂】1．巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.06)：巴比妥纳12.7g，巴比妥1.66g，先加水少量，小心加热溶解，最后用蒸馏水定容为1 000ml，4℃保存。
2．氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5g，甲醇50ml，冰醋酸1.0ml，蒸馏水40ml，混匀。
3．漂洗液：95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，按比例混匀。
4．0.4N NaOH溶液。
【操作】1. 点样：将醋酸纤维薄膜切成8cm×2cm条状，浸于巴比妥缓冲液，待完全浸透后，取出置于滤纸上，轻轻吸去多余的缓冲液，再于薄膜的无光泽面的一端2.5cm处，用小玻片蘸取少许血清，垂直印于膜上，待样品浸入膜后，将薄膜有样品的一面向下(以防蒸发干)贴在电泳槽架上，两端用数层浸湿的滤纸（或纱布）作盐桥贴紧。
（其他样品同样处理，若需标记，只能用铅笔书写于有光泽面的两端。
）2．通电：一般电压用90～120V，电流约0.4～0.6mA／cm，通电45至60分钟，待电泳区带展开约25～35mm后关闭电源。
3．染色：通电完毕，将薄膜直接浸于染色液中，3～5分钟后取出放入另一盘中，用漂洗液浸洗数次,每次3分钟，至脱色使背景无色为止。
染色完毕，将染色液倒回原瓶，漂洗液注入回收瓶。
4．定量：将漂洗完毕的薄膜吸干，剪下每种蛋白质色带，另于空白处剪一窄条薄膜，分别放入有4m1 0.4N NaOH的中试管内，振摇数次，使染料色泽浸出，30分钟后，分别于650nm处读吸光度(空白薄膜条浸出液作空白对照)。
实验一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳(doc)
实验一血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳(doc)一、实验目的：了解蛋白质在醋酸纤维素薄膜电泳中的电泳特性，掌握电泳操作技能。
二、实验原理：血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳是一种基于电场作用对蛋白质进行分离的方法。
它是将样品蛋白质通过电泳方式在薄膜上进行分离，通过比较蛋白质的电泳迁移率来判断不同蛋白质的分子量大小。
血清蛋白质主要是血清白蛋白、球蛋白和纤维蛋白，分子量范围从14 kDa到850 kDa 不等。
在醋酸纤维素薄膜电泳中，蛋白质受到电场力的作用下，向电极方向迁移，带电的蛋白质分子在电场力和阻力的作用下进行不断运动，大分子运动缓慢，小分子运动快，不同分子量的蛋白质在电泳中迁移率不同，可以根据迁移率区分出不同的蛋白质成分并计算其分子量。
三、实验步骤：1.制备0.9%琼脂糖凝胶电泳缓冲液：取700ml去离子水，加入1.68g粉末琼脂糖，微弱的加热搅拌至完全溶解后添加1ml 1M Tris-HCl（pH6.8），0.2ml 10%（w/v）SDS，0.1 ml 10%（w/v）溴酚蓝溶液，搅拌均匀，得到电泳缓冲液。
2.制备凝胶：取0.9%琼脂糖凝胶电泳缓冲液120ml，加入3ml 10%（w/v）APS和0.2ml TEMED，充分混合，倒入成型板中，插入2个酯化的平板梳子，待凝胶完全固化后去除梳子。
3.制备血清样品：血清样品先离心5min，将上清离心液保存备用，调整浓度至3mg/ml，加入适量的样品缓冲液，并加入0.1%（w/v）溴酚蓝染料，离心去除蛋白质沉淀，取上清液。
4.醋酸纤维素薄膜电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液至凝胶表面，将样品用枪头均匀加到凝胶的对侧。
将电泳槽封好，接上电源，电压保持在120 V，电泳时间约为1.5小时。
电泳完成后取出凝胶。
5.染色：将凝胶放入染色液中，室温下摇晃染色1h，去除染色液，在清水中冲洗几次，静置清水中至少30min。
6.成像：将凝胶放在扫描仪上进行成像，选择合适的波长进行成像。
实验三_醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白
实验三_醋酸纤维素薄膜电泳法分离⾎清蛋⽩⼭东⼤学实验报告2011年3⽉27⽇姓名张⾏润系年级2009级⽣科4班学号200900140177 同组者于潜科⽬⽣物化学实验题⽬醋酸纤维素薄膜电泳法分离⾎清蛋⽩仪器编号105⼀、实验⽬的掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离⾎清蛋⽩的原理和⽅法。
⼆、实验原理蛋⽩质是两性电解质。
在pH值⼩于其等电点的溶液中，蛋⽩质为正离⼦，在电场中向阴极移动；在pH值⼤于其等电点的溶液中，蛋⽩质为负离⼦，在电场中向阳极移动。
⾎清中含有数种蛋⽩质，它们所具有的可解离基团不同，在同⼀pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利⽤电泳法将它们分离。
⾎清中含有清蛋⽩、α-球蛋⽩、β-球蛋⽩、γ-球蛋⽩等，各种蛋⽩质由于氨基酸祖坟、⽴体构象、相对分⼦质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。
由表可知，⾎清中5种蛋⽩质的等电点⼤部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离⼦，在电场中向阳极移动。
在⼀定范围内，蛋⽩质的含量与结合的燃染料量成正⽐，故可将蛋⽩质区带剪下，分别⽤0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进⾏⽐⾊，测定其相对含量。
也可以将染⾊后的薄膜直接⽤光密度计扫描，测定其相对含量。
肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性⾻髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使⽩蛋⽩下降。
肾病时α1、α2、β球蛋⽩升⾼，γ-球蛋⽩降低。
肝硬化时α2、β-球蛋⽩降低，⽽α1、γ-球蛋⽩升⾼。
三、实验器材1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120µm）2、⼈⾎清；3、烧杯及培养⽫数只；4、点样器；5、⽵镊⼦；6、玻璃棒；7、电吹风；8、试管六只；9、恒温⽔浴锅；10、电泳槽；11、直流稳压电泳仪；12、剪⼑实验试剂1.电极缓冲液2.染⾊液（可重复使⽤，使⽤后回收）3.漂洗液（100ml每组）：95%⼄醇45ml，冰醋酸5ml，⽔50ml。
4.透明液（20ml每组）：⽆⽔⼄醇：冰醋酸=7：3。
生化试验教材实验二：血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳
实验误差分析和注意事项
误差来源
实验误差可能来源于电泳操作、染色操作、读数等方面。
注意事项
实验过程中应注意保持操作规范，避免交叉污染，同时注意观察实验现象，及 时处理异常情况。
05 实验结论
总结实验结果
实验结果显示，血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳可以将血清蛋 白分为白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白等区 带，分离效果良好。
α1球蛋白增加常见于慢性肝炎、 肝硬化或肝癌等疾病。
β球蛋白增加
β球蛋白增加可能与急性感染、 组织损伤或免疫系统疾病等有 关。
白蛋白减少
白蛋白减少可能提示肝功能异 常、营养不良或肾病综合征等。
α2球蛋白增加
α2球蛋白增加可能提示骨髓瘤、 巨球蛋白血症或妊娠等。
γ球蛋白增加
γ球蛋白增加常见于慢性肝炎、 肝硬化或自身免疫性疾病等。
和疾病状态。
通过醋酸纤维素薄膜电泳分离血 清蛋白质，可以对不同蛋白质成 分进行分析和鉴定，有助于临床
诊断和治疗。
02 实验原理
血清蛋白质的组成和性质
血清蛋白质是由多种蛋白质组成的混合物，包括白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、 β-球蛋白和γ-球蛋白等。这些蛋白质具有不同的电荷和分子量，是电泳分离的基础。
通过实验，我们观察到了不同蛋白质的迁移率和分布情况， 为后续的蛋白质分析和鉴定提供了基础数据。
实验结论与实际应用的联系
本实验所采用的醋酸纤维素薄膜电泳技术在实际应用中具 有广泛的应用价值，例如在临床医学中用于检测和诊断某 些疾病，如肝病、肾病等。
通过本实验，我们了解了醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理 和操作方法，为今后在相关领域的研究和应用奠定了基础 。
03 实验步骤
实验一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳(共享)
实验一血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳(共享)一、实验目的本实验旨在掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作的技能，通过血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳分析，了解蛋白质电泳分析中常用的方法和技术，并且能够初步理解血清蛋白质电泳图谱的含义和影响因素。
二、实验原理1. 蛋白质分离原理蛋白质分离是利用蛋白质之间在电场中的运动迁移率的不同分离的。
蛋白质在电场中的运动迁移率取决于蛋白质分子的大小、形状、电荷性质等的不同。
2. 醋酸纤维素薄膜电泳原理醋酸纤维素薄膜电泳是一种以醋酸纤维素膜为电泳区间的蛋白质电泳方法。
其原理为，蛋白质在正常向电场中发生运动，随着蛋白质运动迁移，逐渐进入膜孔中，受到膜孔的限制，蛋白质停止迁移。
大分子的蛋白质分子无法进入膜孔，小分子的蛋白质可以进入膜孔，分子大小的差异导致了蛋白质的分离。
醋酸纤维素膜孔的大小通常小于3纳米，蛋白质要进入膜孔需要满足一定的条件，如形状、电荷、大小等，因此通过醋酸纤维素膜孔的筛选效果，可以将蛋白质分离出不同性质和大小的蛋白质组分。
三、实验步骤1. 操作前准备：① 气泡清除：取适量蒸馏水，通入空气，将水搅动形成气泡，并将其排出，重复多次，以去除气泡。
② 涂膜：取新的醋酸纤维素膜，利用毛刷刷上适量真空脱泡机中的真空润湿液，边刷边使薄膜平铺，直至全部涂膜结束。
2. 样品制备① 取0.5 mL 的实验样品，放入1.5 mL 的离心管中，室温下放置5 min，使蛋白质沉淀和分散。
② 在超净工作台或洁净室内操作，将样品香磨匀，取样板，向上转移液体吸头轻轻吸取一下，将液体加入样品槽中。
3. 电泳操作① 将准备好的醋酸纤维素膜，贴在电泳仪的隔板上，并将隔板安装在电泳槽内。
② 将电泳槽中的电泳缓冲液（TGE）加热并耗尽气泡之后，轻轻将样品槽放入电泳槽中，注意不能与电泳膜接触，最后慢慢加入样品针头的样品。
③ 大致运行5-10min 后，可观察到样品在膜上积累。
④ 电泳完成后，将电泳槽内的醋酸纤维素膜取出，将其在甲醇以及蒸馏水中洗涤3次，最后在蒸馏水中洗涤一次。
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验一．实验原理1、电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。
在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。
2、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。
3、影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。
4、采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。
醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。
5、醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。
该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。
6、本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。
血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。
各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。
以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。
其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。
二．实验仪器和试剂✧器材醋酸纤维素薄膜（3×8cm），培养皿，载玻片，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子✧材料新鲜血清（未溶血）✧试剂1、巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）：巴比妥1.66g, 巴比妥钠12.76g，加水至1000ml。
置4℃冰箱保存，备用。
（已配置）2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混匀。
3、漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。
4、NaOH溶液：称取NaOH 16g，定容至1000ml。
试验九血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
实验九血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳一、原理醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法。
醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。
将它溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。
该膜具有均一的泡沫状结构，有强渗透性，对分子移动无阻力，厚度为120um。
本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。
血清中含有清蛋白、a-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。
各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。
分子量小、等电点低，在相同碱性pH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。
例如，以醋酸纤维薄膜为支持物，正常人血清在pH8．6的缓冲体系中电泳1 h左右，染色后可显示5条区带。
清蛋白泳动最快，其余依次为α1-、α2-、β-、γ-球蛋白。
这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描，自动绘出区带吸收峰及相对百分比，临床医学常用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。
二、操作(一)仪器与薄膜的准备1．醋酸纤维素薄膜的润湿与选择。
2．电泳槽的准备在两个电极槽中，各倒人等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。
当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。
滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。
3．电极槽的平衡(二)点样用竹夹子取出薄膜，将无光泽面向上平放在滤纸上。
点样区距阴极端1.5 cm 处，点样时，先用玻璃棒取血清，均匀涂在点样器表面(该点样器是由载玻片一端磨成具有斜面而成}，再将点样器轻轻印在点样区内，如图所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。
此步是实验的关键，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节。
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注意事项
1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。
2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜 吸水量以不干不湿为宜。
3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜 或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
• 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色
3.点样：
点样前，将薄膜粗糙面朝上，距一边1.5cm处用 铅笔划一条平行线作为点样标志区。
点样时，用点样器毛吸取血清，在薄膜粗糙 面上轻而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴 极端1.5cm（见图）。此步是实验的关键。
1.5cm
6.5cm
点样区
醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线处为点样位置）
4、点样应点在薄膜的粗糙面上，点样量要适量，不宜过多 或过少。
5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样 面向下。
6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太 短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进 行复染。
思考题
1.电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？
2.电泳图谱清晰的COO-
H＋
Pr
NH2
OH－
pH>pI
COO-
H＋
Pr
OH－
NH3+
pH=pI
COOH
Pr
NH3+
pH<pI
影响电泳迁移率的因素：
1、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、 蛋白的大小和形状
2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离 子强度和电渗现象
血清中几种主要蛋白组分：
实验二（P124）
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
（Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins）
实验目的
1、掌握电泳法分离蛋白质的原理
2、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的 原理和操作方法
3、学习蛋白质染色的方法
分离蛋白质的方法
分离方法
沉淀法 层析法 电泳法
盐析法 有机溶剂沉淀法
薄膜电泳 等电聚焦电泳 聚丙烯酰胺电泳
离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析
实验原理
电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相
反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不
同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的 电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它 们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。
血清蛋白质 清蛋白
α1－球蛋白 α2－球蛋白 β－球蛋白 γ－球蛋白
等电点 4.64 5.00 5.06 5.12 6.85～7.3
分子量 69,000 200,000 300,000 90,000～150,000 156,000～950,000
占总蛋白的％ 57～72 2～5 4～9 6.5～12 12～20
❖ 缓冲液pH=8.6
❖ pI＜pH
血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动
醋酸纤维薄膜电泳
• 醋酸纤维薄膜作为支持介质
• 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯， 溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度 为0.1～0.15mm
染色剂
• 一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽 春红
• 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂
4.电 泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点 样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴 滤纸桥并绷直，中间不能下垂。
连接好电泳仪。在室温下电泳，恒压110V，打开电 源开关，电泳时间60 min。电泳后，调节旋钮使电压为零， 关闭电泳仪切断电源。
5.染色：
电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑 10B染色液的培养皿中浸泡5min，染色时 可置于摇床，均匀摇晃。
6.漂洗：
将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂 洗3次，每次5 min,直至背景蓝色脱尽，条 带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，用吹 风机冷风吹干或者自然晾干。
8.记录和分析实验结果
透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大 小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后的 薄膜可作扫描或照相。
小知识：血清蛋白电泳结果的临床意义
可能相关疾病 骨髓瘤 肾病综合症 肾炎 肝硬化 急性肝坏死 传染性肝炎 急性感染初期 慢性炎症/感染后期 低球蛋白血症
清蛋白 α1球蛋白
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α2球蛋白
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β球蛋白
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γ球蛋白
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