新生成蛋白和修饰蛋白的检测技术综述-生物化学论文-生物学论文
蛋白质修饰检测技术及其应用
蛋白质修饰检测技术及其应用蛋白质修饰是指在翻译后修饰成熟的蛋白质分子上发生的各种化学改变。
蛋白质修饰可以调节蛋白质的结构、功能和活性，对维持细胞的正常生理功能至关重要。
因此，研究蛋白质修饰及其应用于疾病诊断、治疗和药物研发成为了当前的热点研究领域。
本文将介绍蛋白质修饰的检测技术及其在生物医学领域的应用。
一、蛋白质修饰的类型1. 磷酸化修饰：蛋白质磷酸化是目前研究最广泛的一种修饰形式。
它通过添加磷酸基团改变蛋白质的电荷和空间构型，从而影响蛋白质的功能。
常用的磷酸化修饰检测方法包括质谱分析、免疫印迹和蛋白质芯片技术。
2. 甲基化修饰：蛋白质甲基化是通过向蛋白质上的氮、氧或硫原子添加甲基基团而实现的修饰。
甲基化修饰可以调节蛋白质的稳定性、活性和亲和性。
常用的甲基化修饰检测方法有质谱分析、甲基化特异性抗体和免疫荧光染色。
3. 乙酰化修饰：蛋白质乙酰化是通过向蛋白质上的赖氨酸残基添加乙酰基团而实现的修饰。
乙酰化修饰可以调节蛋白质的稳定性、转录活性和DNA结合能力。
常用的乙酰化修饰检测方法包括质谱分析、乙酰化特异性抗体和酶活性检测。
二、蛋白质修饰检测技术1. 质谱分析：质谱分析是目前最常用的蛋白质修饰检测方法之一。
它通过测量蛋白质分子的质量和质荷比，可以鉴定和定量各种蛋白质修饰形式。
质谱分析的优点是高灵敏度和高分辨率，能够识别极低浓度的修饰产物。
2. 免疫印迹：免疫印迹是一种常用的蛋白质修饰检测技术，它利用特定抗体与目标修饰蛋白发生特异性结合，然后通过化学荧光或酶标记来检测修饰的蛋白质。
免疫印迹技术操作简便，可以同时检测多个修饰位点。
3. 蛋白质芯片技术：蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质修饰检测技术。
它将多个蛋白质修饰位点的抗体固定在芯片上，然后通过与样品中的修饰蛋白发生特异性结合来进行检测。
蛋白质芯片技术可以同时检测大量的修饰位点，适用于高通量筛查和研究。
三、蛋白质修饰的应用1. 疾病诊断：蛋白质修饰在疾病诊断中发挥着重要作用。
蛋白质合成与修饰的生物化学研究
蛋白质合成与修饰的生物化学研究蛋白质是构成生命体的重要组成部分，负责细胞内的生物化学反应和许多生理过程的调控。
蛋白质的合成和修饰是细胞生物化学研究的重要领域之一。
在本文中，我们将简要介绍蛋白质合成、转录和翻译，以及蛋白质修饰中的几种主要反应类型。
1. 蛋白质合成和转录与翻译蛋白质是由氨基酸链组成的，氨基酸是生物体内的基本单元。
对于构建蛋白质，生物体需要获取氨基酸作为材料，并将它们按照一定的顺序组合在一起，形成一个长链。
用于蛋白质合成的氨基酸包括20种不同的类型，它们的特性有所不同。
合成蛋白质需要将氨基酸按照正确的顺序组合在一起，并且进行必要的化学修饰和折叠。
在细胞内，蛋白质的合成是由DNA上特定区域的基因编码的RNA分子进行指导的，这个过程称为转录。
翻译是细胞内合成蛋白质的过程。
在翻译过程中，RNA分子将基因编码的信息转化为氨基酸链，转化的过程需要各种酶参与，并且还需要一系列具有特定特征的蛋白质参与。
2. 蛋白质修饰蛋白质合成是一个复杂的过程，还需要进行必要的修饰，以确保蛋白质能够完成其指定的功能。
蛋白质修饰包括各种磷酸化、甲基化、酰化和糖基化等反应类型。
以下是其中几种重要的类型。
磷酸化是一种由磷酸化酶和去磷酸酶催化的化学反应。
在这个过程中，磷酸基团可以添加到蛋白质上，并且可以被不同的酶去除。
磷酸化可以影响蛋白质的结构和功能以及它们在细胞中的位置。
甲基化是修饰泛素脱氨基酶的一种反应。
在这个过程中，甲基基团被添加到具有特殊序列的蛋白质上。
这种修饰可以影响蛋白质的稳定性和相互之间的相互作用，并且还可以影响它们在细胞中的位置和功能。
酰化是将一个酰基团或烯丙基团添加到蛋白质上的修饰反应。
这种修饰可以通过酰化酶或转移酶来实现。
酰化可以影响蛋白质的结构和功能以及它们在细胞中的位置。
糖基化是将糖分子添加到蛋白质上的修饰反应。
这种修饰可以通过糖基转移酶来实现。
糖基化可以影响蛋白质的结构和功能，并且可以影响它们在细胞中的位置和功能。
蛋白质修饰与生物学功能研究
蛋白质修饰与生物学功能研究生命是由无数个微小分子组成的，而其中最常见且至关重要的分子就是蛋白质。
蛋白质是生物体中最基本的大分子化合物之一，它不仅是构成生物体结构和组织的基本元素，还起着生命活动的调控与媒介作用。
而生物体内的蛋白质修饰则是一类关键而复杂的生物学反应，它对蛋白质的结构、功能和调控起着至关重要的作用。
因此，本文将探讨蛋白质修饰与生物学功能的关系。
一、蛋白质修饰是什么？蛋白质修饰就是指通过化学修饰或生物化学反应改变蛋白质的构象和物理、化学性质的过程。
具体地说，蛋白质修饰可以分为两类，即翻译后修饰和翻译前修饰。
翻译后修饰是指蛋白质合成后，在蛋白质折叠、运输、定位以及代谢等生物过程中，发生的各种化学修饰过程。
常见的翻译后修饰包括糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化等。
翻译前修饰是指蛋白质在翻译时，RNA翻译的过程中，蛋白质序列上的氨基酸通过受体酪氨酸激酶、果糖异构酶等酶的催化和调控，对蛋白质进行修饰。
翻译前修饰常见的包括磷酸化、甲基化、腺苷酸化等。
二、蛋白质修饰对生物学功能有何影响？蛋白质修饰是生物学规律的体现，它在细胞生物学、分子生物学、发育生物学、遗传学、生态学、生理学等方面表现出不同的生物学功能。
1. 细胞信号转导蛋白质修饰在细胞信号转导中发挥关键作用。
细胞信号转导是指细胞接收信号后，通过信号转导机制传递信息，调节细胞的功能、增殖、衰亡等生物学过程的过程。
而这个过程中，磷酸化、糖基化等蛋白质修饰调节信号通路的转导是非常重要的。
2. 补体系统的激活补体系统是人体免疫系统中最重要的过程之一，补体蛋白的激活是通过修饰方式实现的。
补体蛋白分子通过糖基化、脱氨基化等修饰方式，改变它们吸附受体的亲和性，从而达到调节和激活免疫系统、溶解细菌等生物学功能。
3. 调节蛋白合成和产物的稳定性蛋白质修饰可以调节蛋白质的折叠和稳定性，影响它们的状态和功能。
例如乙酰化作为一种重要的蛋白质修饰反应，对组蛋白的组装、DNA复制、转录调节、细胞周期等生物学功能，都具有非常重要的调节作用。
蛋白质修饰技术与研究
蛋白质修饰技术与研究蛋白质修饰是指通过翻译后修饰的过程，在蛋白质中引入特定的化学修饰或结构变化，从而改变蛋白质的性质和功能。
蛋白质修饰技术是分子生物学和生物化学领域中的重要研究技术之一，被广泛应用于蛋白质功能研究、药物研发和生物工程等领域。
蛋白质修饰技术的发展历程可以追溯到20世纪50年代。
最早的蛋白质修饰技术是通过化学方法引入化学修饰基团。
例如，通过对蛋白质中的氨基酸残基进行酯化、酰化、磷酸化等修饰，可以改变蛋白质的活性、稳定性和亲水性等性质。
此外，还可以通过选择性的还原和氧化反应，引入新的化学基团，从而对蛋白质进行修饰。
随着分子生物学技术的发展，基因工程技术的出现为蛋白质修饰技术的发展提供了新的途径。
遗传工程技术可以通过改变蛋白质的基因序列，在蛋白质的原生序列中引入特定的修饰靶点。
例如，通过基因工程方法可以将目标蛋白质中的氨基酸残基替换为可被磷酸化、甲基化等修饰的对应氨基酸残基。
此外，蛋白质修饰还可以通过生物学方法实现。
例如，利用细菌和酵母等重组蛋白表达系统，可以高效地产生具有特殊修饰的蛋白质。
同时，利用重组蛋白的信号肽和酶切位点等特征，可以在蛋白质中引入特定的修饰。
蛋白质修饰技术在科学研究和应用领域具有重要的意义。
首先，蛋白质修饰技术可以用于研究蛋白质功能和调控机制。
通过对蛋白质进行特定修饰，可以揭示蛋白质功能与修饰之间的关系，进一步了解蛋白质的生物学过程和信号传导机制。
其次，蛋白质修饰技术在药物研发领域具有广阔的应用前景。
许多重要的药物靶点是蛋白质，通过改变蛋白质的修饰状态，可以调节其活性和稳定性，从而开发新的药物和治疗方法。
此外，蛋白质修饰技术还在生物工程领域发挥着重要作用。
通过对蛋白质进行定向修饰，可以构建具有特定功能和特性的蛋白质工程分子。
这些蛋白质工程分子在生物医学、农业和环境保护等领域具有广泛的应用前景。
总结起来，蛋白质修饰技术在蛋白质功能研究、药物研发和生物工程等领域起着重要作用。
蛋白质修饰技术与研究
蛋白质修饰技术与研究随着生物学研究的不断深入，针对蛋白质进行修饰的技术也越来越成熟。
蛋白质修饰技术是指在生物过程中，通过一系列的修饰过程对蛋白质进行改变，从而影响其性质和功能。
这些修饰包括糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化等不同类型的化学修饰，并在生物体内的不同部位发生。
在生物质量学等领域，蛋白质修饰技术的研究也备受关注。
首先，蛋白质糖基化是指在糖类分子和蛋白质之间形成化学键。
这种修饰方式是非常常见的，因为几乎所有细胞表面都含有糖类。
根据修饰位置和方式的不同，蛋白质糖基化可以分为N-糖基化和O-糖基化两种类型。
N-糖基化是指糖类修饰蛋白质的氨基酸残基，而O-糖基化则是糖类修饰蛋白质的氢氧基。
这两种类型的蛋白质糖基化均能影响蛋白质的稳定性、生物活性和免疫反应性等性质。
其次，磷酸化是蛋白质修饰的另一种常见形式。
磷酸化通常是指酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸等残基与磷酸分子形成化学结合。
通过磷酸化，可以改变蛋白质的电性、构象和激活状态。
例如，成纤维细胞生长因子（FGF）在磷酸化之后才能与其受体形成配对，从而激发其生物功能。
此外，在肿瘤细胞的生长和扩散过程中，蛋白质磷酸化也常常起着关键作用。
除了上述两种修饰方式之外，乙酰化和甲基化是另外两种常见的蛋白质修饰方式。
乙酰化是将乙酰分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上，这可以影响蛋白质的表达水平、激活状态和紧密性。
甲基化则是指在蛋白质的赖氨酸、精氨酸、组胺酸和谷氨酸残基上加上甲基分子。
这种修饰方式通常发生在蛋白质与DNA的相互作用中，可以影响蛋白质的DNA-binding能力和转录调控。
值得注意的是，在蛋白质修饰技术研究领域，不仅仅是单一修饰的探究，而是也要关注在修饰方式复杂的情况下，可能存在的多种修饰模式。
例如，在花生四烯酸（arachidonic acid）代谢途径中，同一个蛋白质可能会经历乙酰化、磷酸化、糖基化等多种修饰方式的叠加，这对于了解生物过程的细节及其表观调控机制具有重要意义。
蛋白质修饰的分子机制与生物学意义
蛋白质修饰的分子机制与生物学意义蛋白质修饰是指在蛋白质合成之后，进一步发生的化学修饰过程。
这些修饰可以改变蛋白质的物化性质、稳定性、局域结构等，从而影响蛋白质的功能。
蛋白质修饰是生物体内最为普遍、复杂的后翻译修饰类型之一，其分子机制和生物学意义具有重要的研究价值。
一、蛋白质修饰的类别蛋白质修饰可以分为多种不同类型，常见的包括磷酸化、甲基化、酰化、氧化、硝化等。
其中，磷酸化是最常见的修饰方式之一。
它通过给蛋白质的亲水基团加上一个磷酸基团，从而改变蛋白质的电性、构象、相互作用等特性。
甲基化则是将甲基基团直接加到蛋白质的氨基酸残基上。
通过甲基化可以改变蛋白质的空间结构，在控制转录、蛋白质互作、信号传导等方面扮演着重要的角色。
二、蛋白质修饰的分子机制蛋白质的修饰是由修饰酶（或酶组）催化产生的，这些酶在生化反应中能够识别并特异性地作用于某种给定的氨基酸残基。
通常情况下，酶的催化作用过程需要一些协同因素，包括辅因子、底物配位结构变化等。
这些协同因素确保修饰酶（或酶组）在特定情况下能够精准地对蛋白质氨基酸残基进行较为规范的修饰。
蛋白质修饰通常需要消耗底物能量，如ATP、NAD等。
以磷酸化为例，其具体的反应步骤为修饰酶特异性识别氨基酸残基，并反应生成底物的磷酸酯中间体。
中间体的进一步反应需要耗费反式异构转换的能量和磷酸化底物本身的应激能。
最终，修饰酶通过识别反应物光亮的配体，来从催化反应中分离出磷酸化酶底物，完成催化模式转换。
三、蛋白质修饰的生物学意义蛋白质修饰对生命体系的调控意义极为重要。
磷酸化修饰通过调节多种信号转导的元件，影响基因转录、蛋白质翻译、细胞分化、凋亡等生物学过程。
甲基化则在基因组DNA水平上，影响DNA的信号转导、串联染色体构象和基因发育等生物学过程。
同时，蛋白质过氧化和酰基化等修饰也起到了类似的生物调控作用。
对于单一蛋白质而言，不同类型的修饰可以具有截然不同的效应。
多个修饰可以叠加，并产生叠加影响, 相互协同或竞争的作用，从而构成了复杂的生理和病理现象。
蛋白质的生成、修饰与质量控制(doc 26页)
蛋白质的生成、修饰与质量控制(doc 26页)部门： xxx时间： xxx整理范文，仅供参考，可下载自行编辑项目名称：蛋白质的生成、修饰与质量控制首席科学家：Sarah Perrett 中国科学院生物物理研究所起止年限：2012.1至2016.8依托部门：中国科学院一、关键科学问题及研究内容关键科学问题：本项目的关键科学问题是：细胞如何实现对蛋白质合成、折叠、修复、降解及修饰不同环节的质量控制；在应激条件下蛋白质质量控制体系如何调控；蛋白质异常修饰对质量控制体系的影响及其相关疾病发生发展的机制等关键科学问题。
重点研究蛋白质合成的精确控制机制；蛋白质折叠尤其是内质网和线粒体氧化折叠系统中关键蛋白的结构与功能及相互作用网络；分子伴侣在错误折叠蛋白的修复与降解中的作用；应激条件下质量控制体系中蛋白质的氧化还原修饰调控；蛋白质异常修饰在细胞及动物水平产生的影响。
通过系统研究蛋白质质量控制体系不同环节关键蛋白的功能和相互关系，获得蛋白质质量控制分子机制的全景网络。
主要研究内容：本项目深入系统研究蛋白质生物合成的质量控制、蛋白质的氧化折叠与氧化还原修饰、蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用、蛋白质的异常修饰与疾病的关系。
系统开展蛋白质质量控制关键蛋白和相互作用网络研究，分析关键蛋白质或调控因子在蛋白质质量控制过程中的功能及在生理与病理状态下的动态变化，筛选对氧化折叠和质量控制具有调控功能的小分子化合物。
探索环境因素诱导的蛋白质异常修饰与认知障碍之间的关系，开发试用于老年性痴呆症临床诊断的生物标记物。
1．蛋白质翻译的精确控制机制研究亮氨酰-tRNA合成酶（LeuRS）对特异氨基酸及其对应的特异tRNA之间相互识别匹配的机制；鉴定依赖和非依赖tRNA的转移前编校发生的位点；tRNA的氨基酸接受臂（amino acid acceptor arm）在氨基酰化活性中心和编校活性中心之间的动态转位过程； tRNA关键核苷酸在氨基酰化反应、编校反应各步和蛋白质翻译起始阶段的具体作用机理；探索LeuRS中某些特定结构域的功能；肽酰-tRNA移位相关的两个因子EF-G和LepA调控下的氨基酰-tRNA正向移位与反向移位的识别条件、作用位点、信号传递途径；研究在高等生物中反向移位的生理意义。
蛋白翻译后修饰的质谱检测方法：探索生物分子多样性的新途径
蛋白翻译后修饰的质谱检测方法：探索生物分子多样性的新途径蛋白质的翻译后修饰是一种重要的调控机制，可以改变蛋白质的功能、稳定性和相互作用。
随着科技的发展，质谱技术成为了揭示蛋白翻译后修饰的有力工具。
质谱检测方法通过分析蛋白质分子的质谱图谱，揭示其修饰位点和修饰类型，从而探索生物分子的多样性和功能调控。
本文将详细介绍蛋白翻译后修饰的质谱检测方法，探索这一新途径在生物制药领域中的应用前景。
1.质谱技术的原理。
（1）质谱基础知识：质谱技术基于对离子质量-电荷比的测量，通过质谱仪器将样品中的分子转化为离子，然后根据离子的质量和电荷比进行分离和检测。
（2）质谱仪器：常用的质谱仪器包括质谱质量分析仪（MS）、液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）和飞行时间质谱仪（TOF-MS）等，每种仪器有其特定的应用领域和技术优势。
2.蛋白翻译后修饰的质谱检测方法。
（1）磷酸化修饰的质谱检测：磷酸化修饰是蛋白质最常见的翻译后修饰方式之一，质谱检测可以通过分析肽段的质谱图谱来确定磷酸化位点。
（2）甲基化修饰的质谱检测：甲基化修饰可以通过质谱检测方法来确定修饰位点和甲基化的程度，如通过测量甲基化肽段的质谱图谱来定量甲基化修饰。
（3）糖基化修饰的质谱检测：质谱检测可以通过分析糖基化蛋白或糖基化肽段的质谱图谱来鉴定糖基化修饰类型和位置。
（4）乙酰化修饰的质谱检测：乙酰化修饰可以通过质谱检测方法来确定修饰位点和乙酰化的程度，如通过分析乙酰化肽段的质谱图谱来定量乙酰化修饰。
图1。
3.质谱检测方法的应用前景。
蛋白翻译后修饰的质谱检测方法在生物制药领域具有广阔的应用前景。
首先，这些方法可以帮助研究人员全面了解蛋白质的修饰状态，深入揭示蛋白翻译后修饰在细胞调控和信号传导中的作用机制。
其次，质谱检测方法可以用于药物研发过程中的药效评估和靶点选择，加速新药的研发和上市。
此外，质谱检测方法还可以在临床诊断中发挥重要作用，为个体化医疗和精准治疗提供新的思路和方法。
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新生成蛋白和修饰蛋白的检测技术综述-生物化学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：一价铜催化的叠氮炔基的特异性反应通常被称为点击化学反应。
点击化学反应作为一种重要的分子连接方式,能够在分子水平实现特定小分子基团之间的简单高效连接。
因其快速高效、选择性高、条件温和、副反应少等优点,在蛋白质组学分析中有广泛应用,包括新生成蛋白的鉴定和多种翻译后修饰蛋白的鉴定等方面。
因此,深入研究点击化学反应在蛋白质组学中的反应机制,对理解蛋白质的结构功能具有重要意义。
本文综述了近年来点击化学反应在蛋白质组学中的几类重要应用,并对其未来的发展趋势进行了展望。
关键词：点击化学反应; 蛋白质组学; 评述;Abstract：Cu(I)-catalyzed azide-alkyne specific reaction, popularly known as the click chemistry reaction, is defined as an important molecular connection method, which can realize simple and efficient connection between specific small molecule groups at themolecular level. Because of its advantages such as high efficiency, high selectivity, mild conditions and few side reactions, click chemistry reaction has been widely used in proteomics analysis, including the identification of newly synthesized proteins and the identification of various post-translational modified proteins. Therefore, in-depth study of the reaction mechanism of click chemistry reaction in proteomics is very important for understanding the structure and function of proteins. The goal of this review is to highlight the progress of several important applications of click chemistry in proteomics analysis in recent years, and discuss the future trends of the click chemistry in proteomics.Keyword：Click chemistry reaction; Proteomics; Review;Fund：supported by the National Nature Science Foundation of China(No.81472030); the Jilin Province Science and Technology Department Project(No.20180101267JC); the Graduate Innovation Fund of Jilin University(No.101832018C070);1 、引言蛋白质组(Proteome)源于蛋白质(Protein)与基因组(Genome)两个词的组合,这个概念最早是由澳大利亚Macquarie大学Wilkins等[1]提出。
蛋白质组学研究的主要内容包括在蛋白质水平上大规模地分析组织细胞的蛋白质表达水平、翻译后修饰、蛋白质间的相互作用等,从而揭示蛋白质的功能,已在疫苗筛选、指导治疗、临床药物开发及预后判断等领域发挥了重要作用[2,3]。
近年来,化学蛋白质组学在化学生物学领域发展迅速,其利用合成化学方法生成小分子探针,揭示蛋白质的结构和功能。
传统的蛋白标记探针主要有生物素、荧光基团等,但普遍存在降低蛋白质活性、对极性变化不够敏感等缺点[4,5]。
点击化学的出现极大地降低了因探针掺入对蛋白活性的影响。
点击化学是指通过小分子基团的拼接,简单高效地完成C-X-C杂原子化学合成的一类组合化学方法。
目前, 常用的点击化学反应主要包括铜催化的叠氮-炔基环加成反应(Copper-catalysed azide-alkyne cycloaddi-tion reaction, CuAAC)、直接促进的叠氮-炔基环加成反应(Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition, SPAAC)、逆电子需求的Diels-Alder反应(Inverse electron demand Diels-Alder reaction, IEDDA)和施陶丁格链接反应(Staudinger ligation)4类[6]。
其中, CuAAC是较为经典的点击化学反应, 该反应是指由Cu+催化叠氮化合物与炔基化合物, 生成三唑五元环化合物的共价加成反应, 如图1所示。
该方法反应效率高, 副反应少, 反应条件温和,具有很高的化学选择性且不受水氧干扰、环境污染小等优点[6]。
近年来, 点击化学反应与基于质谱法的蛋白质组学研究方法的结合在生物学领域广泛应用, 特别是为新生成蛋白[7]、棕榈酰化修饰蛋白[8]、糖基化修饰蛋白[9]及磷酸化修饰蛋白的检测提供了方法, 在蛋白质与蛋白质的相互作用[10]、microRNA生物合成[11]和microRNA前体与蛋白质相互作用[12]方面也有广泛应用。
点击化学的使用对探索蛋白质生物学起到了巨大的推动作用。
本文对基于点击化学反应在蛋白质组学研究中的几类重要生物学应用进展进行了综述。
图1 点击化学反应原理[6]Fig.1 Schematic of click chemistry reaction[6]2 、新生成蛋白的检测蛋白质的合成是一个动态过程, 在正常和病理条件下, 细胞会通过产生新生成蛋白对环境变化做出反应, 准确检测蛋白质对环境扰动所做出的反应对理解其潜在作用机制具有十分重要的意义。
新旧蛋白质共享相同的氨基酸库, 在生物学上难以区分, 因此有必要对新生成蛋白进行特殊标记以进行定性与定量分析。
传统标记方法使用稳定同位素氨基酸标记法(Stable isotope labelling by amino acids in cell culture, SILAC)[13]比较扰动前后蛋白质的表达变化。
相较于极高丰度的原有蛋白质, 新生成蛋白质常因丰度太低, 无法实现在大多数质量分析仪的定量动态范围内的检测[14], 因此SILAC对于测量蛋白质合成的短时段内变化并不是最佳的方法。
已有研究发现了两种非天然氨基酸叠氮高丙氨酸(Azidohomoalanine, AHA)和高炔丙基甘氨酸(Homopropargylglycine, HPG), 它们可以在细胞的正常蛋白质合成时掺入到该蛋白的一级结构中, 并且无明显细胞毒性[15,16]。
生物正交非天然氨基酸标记法(Bioorthogonal noncanonical amino acid tagging,BONCAT, 如图2所示[17])利用此特点, 通过代谢标记引入AHA或HPG[18,19]这种小分子基团甲硫氨酸类似物。
将被标记的细胞进行裂解后, 通过点击化学反应将带有炔或叠氮化物的亲和标签共价连接在目的蛋白上, 再经过亲和素琼脂糖凝珠对目的蛋白进行纯化富集, 最后将富集产物酶解成多肽, 利用高通量质谱进行分析检测。
该方法具有特异性强、灵敏度高等优点[20,21], 可以选择性富集新生成蛋白, 实现对新生成蛋白更深入的分析, 从而促进细胞间相互作用的生物学的研究发展。
图2 使用BONCAT方法对新生成蛋白进行标记、检测和鉴定[17]、Fig.2 Bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT) strategy for labeling, detection and identification of newly synthesized proteins[17]该方法自建立以来, 在动态蛋白质组学的分析中得到广泛应用。
Shen等[22]采用Bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT)与MS联用技术对哺乳动物细胞进行了研究, 发现了数百个新生成蛋白在视觉条件时视神经支配区急剧增加; 作者进一步发现, Rab3家族成员中的突触蛋白Rab3a、Rab3b和Rab3c受到视觉神经的差异调节, 在视觉刺激的顶盖脑中Rab3b和Rab3c的表达量显着增加, 而Rab3a显着减少, 说明Rab3家族成员可能在体内介导视觉依赖的行为可塑性中扮演不同的角色。
Howden等[23]利用AHA标记并结合了SILAC的方法(Quantitative non-canonical amino acid tagging, QuaNCAT), 只需要标记细胞数小时或喂食/注入动物1～4天, 即可实现对低丰度新生成蛋白的定量分析。
在该研究中, 利用重同位素标记的氨基酸对T细胞刺激后分泌的新生成蛋白进行标记, 随后通过亲和素微珠对目的蛋白进行富集, 最后利用MS对新生成蛋白进行了定量检测。
Ma等[24]的方法更简单直接, 使用重同位素标记的AHA(Heavy isotope-labeled azidohomoalanine quantification, HILAQ)进行新生成蛋白的标记, 再通过点击反应添加生物素, 接着对标记的蛋白进行沉淀洗涤和消化。
该研究组对HT22细胞氧化模型的新生成蛋白进行了定量检测, 发现226种蛋白质的丰度发生了两倍的变化, 108种蛋白质在细胞途径中得到富集, 证明了HT22细胞作为一种分子工具, 在研究神经退行性疾病涉及的细胞凋亡的过程中十分有效。
他们还将HILAQ 法与QuaNCAT法进行比较发现, HILAQ使用肽水平富集, 已被证明是比QuaNCAT中使用蛋白质水平富集的更灵敏的方法, 且HILAQ法定量的新生成蛋白是QuaNCAT法定量的3.5倍以上。