小鼠脾细胞悬液制备复习过程
小鼠脾细胞悬液制备
小鼠脾细胞悬液制备
一、小鼠眼球取血（眼静脉取血）
二、小鼠脾细胞悬液的制备：
1．小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；
2．在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；
3．在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；
4．A：梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较
大的组织块，离心沉淀细胞；
B：钢网研磨法：将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液；
C：酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400 u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
5、脾脏研磨：轻轻研压（顺同一方向），用吸管吸取脾细胞悬液，放入试管中。
6、镜下细胞计数：40倍镜头，观察脾细胞。
7、试取胸腺
注：一般6-8周龄小鼠，根据品系不同，可得5-20×107细胞/只。
2．手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。
脾细胞分离 红细胞裂解液配制
1.小鼠脾细胞的制备：
Balb/c小鼠摘眼球放血，处死，75％浸泡消毒2~3min
↓
超净台内解剖、取脾，剪碎
↓
于200目筛网中研磨过筛，小平皿收集（小皿放约5ml 20%血清的1640）
↓
移至离心管中，800rpm，离心5min，弃上清
↓
加入5ml红细胞裂解液，吹打均匀，静置3～4min
↓
1000rpm离心5min，弃上清，少量RPMI 1640洗涤2～3遍
↓
加入2ml RPMI 1640（含10％FBS），吹打均匀，计数
红细胞裂解液配方：
NH4Cl: 0.747g
Tris：0.26g
定容100ml
PH=7.4
0.22um的滤膜抽滤除菌。
注：红细胞裂解液可以从冰箱拿直接出来用，预冷的红细胞裂解液加到细胞中后可以在冰上放置1min左右，裂解更充分些。
我做实验时，一般红细胞裂解液加完离心后，只用1640洗一次，一只小鼠的脾脏细胞最后悬浮于3ml 1640中，稀释50倍计数，即：100ul台盼蓝+880ul 1640（或PBS）+20ul 细胞。
那个问题等师兄过来了帮你问一下。
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。
小鼠脾细胞培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数崔文强201300140012 2015.4.7 【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
单抗制备步骤及注意事项
单抗制备步骤及注意事项脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：•免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：•常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
•骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
•骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
•一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
•一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
•保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
脾细胞提取实验报告
一、实验目的1. 学习掌握脾细胞提取的基本原理和方法。
2. 熟悉无菌操作流程，提高实验操作技能。
3. 了解脾细胞在免疫学研究中的应用。
二、实验原理脾脏是人体重要的免疫器官，其中含有丰富的免疫细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等。
脾细胞提取实验旨在从脾脏中获取这些免疫细胞，为后续的免疫学研究和实验提供材料。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：成年小鼠、胰蛋白酶、Hanks平衡盐溶液（HBSS）、FBS、离心管、吸管、解剖显微镜、手术刀、镊子、剪刀、无菌操作台等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、低温离心机、细胞计数仪、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠麻醉与解剖- 将小鼠置于解剖显微镜下，用麻醉剂将其麻醉。
- 小心切开小鼠腹部皮肤，暴露脾脏。
- 使用手术刀将脾脏从体内取出。
2. 脾细胞制备- 将脾脏置于Hanks平衡盐溶液中，轻轻漂洗去除杂质。
- 使用剪刀将脾脏剪成小块，放入装有胰蛋白酶的离心管中。
- 将离心管置于37℃水浴中消化10-15分钟，期间轻轻摇动。
- 停止消化后，用吸管将消化后的脾细胞悬液转移至新的离心管中。
- 1000g离心5分钟，弃去上清液。
- 加入适量的FBS，重悬细胞，制成脾细胞悬液。
3. 细胞计数与纯度鉴定- 使用细胞计数仪对脾细胞悬液进行计数，计算细胞总数。
- 取少量脾细胞悬液，进行染色（如台盼蓝染色），在显微镜下观察细胞活力和纯度。
4. 细胞培养- 将脾细胞悬液接种于细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。
- 定期观察细胞生长情况，记录细胞生长曲线。
五、实验结果1. 脾细胞悬液经离心后，上清液清亮，细胞沉底。
2. 细胞计数仪显示细胞总数为1.5×10^7个。
3. 台盼蓝染色结果显示细胞活力约为90%。
4. 细胞培养过程中，细胞生长良好，呈典型的淋巴细胞形态。
六、实验讨论1. 脾细胞提取实验过程中，无菌操作至关重要，应严格遵循无菌操作规程。
2. 胰蛋白酶消化脾细胞时，消化时间不宜过长，以免损伤细胞。
脾脏单个核细胞的制备
脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RP MI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白; 收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 106 / 300 µl 的浓度。
《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。
加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10% 小牛血清的RPM I- 1640 培养液。
台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×1010 cells /L。
《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。
沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。
粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。
脾细胞的提取
脾细胞的提取
1、用颈椎脱臼法处死小鼠，75%的酒精浸泡2-3分钟。
2、将小鼠移入超净工作台内，无菌条件下，以仰卧位固定在解剖盘上。
3、用眼科镊子夹起腹股沟中线处皮肤，用眼科剪做一横切口。
用镊子捏住切口
两端的皮肤朝着小鼠的尾部和头部纵向撕开皮肤，暴露腹腔膜壁。
4、剪开腹腔壁膜，用镊子夹出脾脏，并用剪子剪去与其相连的组织，将脾脏放入无菌PBS中。
5、用注射器内芯或者研棒研磨脾脏，或用2ml注射器赶出淋巴细胞，过100目
筛网，收集分离的脾细胞悬液，1200r/min离心5min，弃上清。
6、弹散细胞团，加红细胞裂解液5mL左右，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细
胞完全破碎，加大量PBS，1200r/min离心5min，弃上清。
7、加入PBS，混匀，再过100目筛网，1200r/min离心5min。
8、倒掉上清液，加入1640培养液，用吸管吹打均匀，计数，接种。
附：红细胞裂解液（ACK）的配制（500ml）
1．NH4Cl 3.735g。
2．Tris-base 1.3g。
3．用HCl调pH值至7.2。
4．过0.22 um 滤膜。
实验三小鼠脾细胞的分离制备及其活力检测
实验三小鼠脾细胞的分离制备及其活力检测
实验二小鼠脾细胞的分离制备及其
活力检测
材料
1、器材：离心机、手术剪、镊子、平皿、10ml离心管，5ml 注射器等
2、动物：昆明小鼠（25g左右，雄性）
3、试剂：碘伏、红细胞裂解液、Hank’s 液、0.4%台盼兰染液
方法
1、取小鼠一只，置于蜡盘上，颈椎脱臼处死，用碘伏消毒小鼠腹部后，打开腹腔，取出脾，去除周围的结缔组织，放入含有5ml Hank’s的平皿中。
2、用眼科剪将脾一端剪一小口后，将含有5ml Hank’s液的注射器从脾的另一端刺入脾，缓缓注入Hank’s液，即可见脾细胞悬液流入平皿，注意在注射Hank＇s液同时不断转动针头方向，直至脾变苍白为止。
3、将平皿倾斜静置10 min后，用干净吸管吸取细胞液到10ml 离心管中，平衡后，离心（1500rpm 10min），将
离心管盖子打开，快速弃上清液，往管底的细胞中加入1ml的红细胞裂解液，充分混匀20秒，立即加入9ml的Hank’s液，混匀，离心（1500rpm 10min），弃上清，将细胞定容到1ml。
4、吸取0.1ml的细胞悬液到干净的试管中，加入等量的0.4%台盼兰染液，混匀，吸取1滴的细胞液到玻片上，加上盖片，显微镜观察：死亡细胞染成蓝色，活细胞不染色。
正常情况下，活细胞数应达到95%以上。
动物细胞培养技术小鼠脾脏细胞
姓名：XX 系年级：2013级XX班学号：201300XXXXXXX实验题目:动物细胞培养同组者: XXXXX动物细胞培养技术【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率；【实验原理】（一）. 动物细胞培养技术动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟动物体内的生理坏境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存，生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。
细胞培养的意义:⑴.具有其他生物技术无可比拟的优点；⑵.培养条件易改变和控制，便于单因子分析；⑶.便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；⑷.在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用细胞培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；(2).观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；(3).细胞培养得到的产物少。
培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。
细胞培养的方法：1. 原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体外培养直至第一次传代为止。
2. 传代培养：当培养的细胞增殖达到一定密度之后，则需要再做培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比例转移到另一个容器中的扩大培养。
原代细胞培养的方法有：单层细胞培养法和组织块培养法细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞——酶消化——接种——观察悬浮生长细胞的传代：A.直接传代 B.离心传代单层培养细胞的生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期培养细胞的形态分型：A. 贴附型 B.悬浮型（二）. 细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
小鼠脾细胞悬液制备
小鼠脾细胞悬液制备
一、小鼠眼球取血（眼静脉取血）
二、小鼠脾细胞悬液的制备:
1．小鼠颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上,左腹侧朝上；
2．在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；
3．在脾脏下侧提起腹膜,剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；
4．A：梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；
B：钢网研磨法：将脾脏放置不锈钢网（100或200目)上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液；
C：酶消化法：将脾脏用镊子夹碎,加入400 u/ml 胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
5、脾脏研磨：轻轻研压（顺同一方向），用吸管吸取脾细胞悬液，放入试管中。
6、镜下细胞计数：40倍镜头，观察脾细胞。
7、试取胸腺
注：一般6—8周龄小鼠，根据品系不同，可得5-20×107细胞/只。
2．手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械,在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌,此法较为简便。