副溶血性弧菌检验-检验操作程序及要点-微课件
副溶血性弧菌课件
食品中副溶血性弧菌的检验 生化鉴定操作
用接种环将测试菌株的3%氯化钠胰蛋白胨 大豆琼脂点种表面干燥的我妻氏血琼脂平板。 每个平板上可以点状环种几个菌。36℃±1 ℃ 培养不超过24h，并立即观察。阳性结果为菌 落周围呈半透明环的β溶血。
副溶血性弧菌检验培养基和试剂
3％氯化钠碱性蛋白陈水〔APW)
蛋白胨 10g 氯化钠 30g 蒸馏水 1000ml
O抗原的鉴定：
将另外一管的菌悬液转移到离心管内，121℃灭菌 1h。灭菌后4000rpm离心15min，弃去上层液体，将细 胞浆弹起制成上层清液。用蜡笔将玻片划分成相等的 间隔。在每个间隔内加入一滴菌悬液，将O群血清分 别加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐水作 自凝对照。轻微倾斜玻片，使各成分相混和，在前后 倾动玻片1min。阳性凝集反应应可立即观察到。如果 未见O群血清的凝集反应，将菌悬液121℃再次高压1h 后重新检测。如仍旧为阴性则培养物的O抗原属于未 知。
NaOH调整pH为7.0，再加水至50ml）5ml，置4℃冰箱中保存。
0NPG溶液为无色，如出现黄色，则不应再用。
（3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制
成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃
水浴5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。
混浊不透明，表面光滑，较湿润，边缘不整齐。
增菌
定性检测
1.将上述1:10稀释液于 36 ℃ 士1 ℃ 培养8h ～18h .
分离
在所有显示生长的试管或增菌液中用接种 环沾取一环，于TCBS 平板或弧菌显色培养基 平板上划线分离。一支试管划线一块平板，于 36 ℃ 士1 ℃ 培养18h--24h.
副溶血性弧菌
1范围本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。
本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。
2设备和材料设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2冰箱：2 ℃～5 ℃、7 ℃～10 ℃。
2.3恒温水浴箱：36 ℃±1 ℃。
2.4均质器或无菌乳钵。
2.5天平：感量0.1 g。
2.6无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
2.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。
2.8无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL、1000 mL。
2.9无菌培养皿：直径90 mm。
2.10全自动微生物生化鉴定系统。
2.11无菌手术剪、镊子。
3培养基和试剂3.13％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。
3.2硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录A中A.2。
3.33％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.3。
3.43％氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.4。
3.5嗜盐性试验培养基：见附录A中A.5。
3.63％氯化钠甘露醇试验培养基：见附录A中A.6。
3.73％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。
3.83％氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。
3.93％氯化钠溶液：见附录A中A.9。
3.10我妻氏血琼脂：见附录A中A.10。
3.11氧化酶试剂：见附录A中A.11。
3.12革兰氏染色液：见附录A中A.12。
3.13ONPG试剂：见附录A中A.13。
3.14Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录A中A.14。
3.15弧菌显色培养基。
3.16生化鉴定试剂盒。
4检验程序副溶血性弧菌检验程序见图1。
5操作步骤5.1样品制备5.1.1非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2℃～5℃不超过18 h解冻。
副溶血性弧菌 ppt课件
形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径 2mm--3 mm.
注：显色培养基成分：特殊营养物质（75.0 g/L）、混合显色剂（2.3g/L）、琼 脂（15.0g/L）。显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底 物反应显色的原理来检测微生物的新型培养基。 17 ppt课件
四、生化特性
能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉和阿 拉伯胶糖，产酸，不产气。不发酵乳糖、蔗 糖、纤维二糖等。 从患者样品中分离的致病菌株在人或家兔红 细胞的培养基中生长，能产生β溶血。 海水中及海产品中分离的菌株不溶血，这个 现象称为“神奈川现象”。能在神奈川培养 基上产生β溶血者，称为神奈川实验阳性。
ppt课件 31
3.分离
a.对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面 以下 1 cm 内沾取一环增菌液，于 TCBS 平板或弧 菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块 平板。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 b.典型的副溶血性弧菌在 TCBS 上呈圆形、半透明、 表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香 糖的质感，直径 2 mm～3 mm。从培养箱取出 TCBS 平板后，应尽快（不超过 1 h）挑取菌落或标记要 挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养 基上的特征按照产品说明进行判定。
ppt课件
30
2、增菌
（1）定性检测
将制备好的 1:10 样品匀液于 36 ℃±1℃培养 8 h～18 h。
（2）定量检测
•用无菌吸管吸取
1:10 样品匀液 1 mL，注入含有 9 mL 3% 氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备 1:100 的样品匀液。 •另取 1 mL 无菌吸管，按之前操作程序，依次制备 10 倍系 列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支 1 mL 无菌吸 管。 •根据对检样污染情况的估计，选择 3 个适宜的连续稀释度， 每个稀释度接种 3 支含 9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管， 每管接种 1 mL。置 36℃±1℃恒温箱内，培养 8 h～18 h。
副溶血性弧菌标准的检验方法
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1 副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
微生物学检验(第3版)副溶血弧菌
形态与染色
1、革兰氏阴性无芽胞多形态杆菌，单端鞭毛、两 端浓染。杆状、棒状、甚至球状、丝状等
培养特性：
1、需氧或兼性厌氧：生长最好 2、在2～３%NaCL培养基中生长最好，无盐 或食盐>10%不能生长。 3、最适温度36℃，PH7.5—7.8（7.7） 4、在专用选择性平板上，菌落呈圆形凸起， 混浊不透明，表面光滑，较湿润，边缘 不整齐。 5、血平板：可见溶血环。
6、嗜盐性试验：
将可疑培养物接种于不同盐浓度的盐胨水 中，37℃ 24小时，观查生长情况。盐含 量0、3、7、9、11% ， 在3～7 %生长良 好。
０
３
７
９
11
副溶血弧菌的生化特性
A 靛 基 液 质 B 液 葡 V葡磷 I蛋水 蔗 ＋ － ＋ －
甘 ＋
阿
肌
赖
＋/－
－/＋ ＋
赖 对
精 －
精 对
材料要注明件数、样品量、采样条件、时间、容 器灭菌及清洁方法，食物中毒发生情况及可疑原 因等。填写送检单。检验室接到检样后，要检查 样品及送检资料后签字，注明接到时间，立即进 行检验。检验人员根据检验中的发现，可进行送 检项目外的项目的检验。
标本采集－样品送检
• 细菌性食物中毒：
①致病菌检验：对中毒食物、病人排泄物、血液进 行检验，作为确定诊断的依据，对环境、设备、 工器具、包装材料等的检验，也是诊断的参考依 据，以确定污染环节、原因、条件等。 ②致病菌计数检验：有些食物中毒原因菌的检验， 需对可疑中毒食品中的活菌数做测定。 如腊样芽 胞杆菌，只有食品中含菌量≥105个/克时，才能 引起食物中毒，病原性大肠埃希氏菌也应做 “MPN”测定；产气荚膜梭菌的重点是活菌计数 及确证试验；葡萄球菌也应做菌 数检验。对国际 上尚未被公认的食物中毒病原菌如变形杆菌属， 更需要做计数检验。
副溶血性弧菌检验技术
2.6 无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm
2.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头
2.8 无菌锥形瓶：容量250mL、500mL 1000mL 2.9 无菌培养皿：直径90mm
2.10 全自动微生物生化鉴定系统
2.11 无菌手术剪、镊子
225ml 3%氯化钠碱性蛋白陈水
液体
25mL
摇匀 36±1℃ 均质
25g
样品
8~18h
固体 样品
划线分离
氧化酶 试验
革兰氏 染色
•典型的副溶血性弧菌在 TCBS上呈圆形、半透明、 表面光滑的绿色菌落，用接 种环轻触，有类似口香糖的 质感，直径2mm~3mm。
TCBS琼脂 科玛嘉显色琼脂
3％氯 化钠TSI
GB 4789.7-2013 标准解读
5 操作步骤
5.1.3 以无菌操作样品25g（mL）加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min均 质1min,或拍击式均质器拍击2min，制备成1：10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自 225mL3%氯化钠碱性蛋白水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量 稀释液冲洗乳钵中的残留样品1~2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制 备1：10的样品匀液。
食品中副溶血性弧菌检验
一、副溶血性弧菌概况
副溶血性弧菌属弧菌科，是一种生活在近海的海洋微生物，深海一般未发现，大多 在温暖的季节水体中分离到该菌。从多种海产品中均能分离到该菌。
副溶血性弧菌引发的胃肠炎一般表现为骤发性剧烈腹痛。所有的副溶血性弧菌胃肠炎 起因均是由于进食了海产品或海产品相关的一些食物。在日本，有副溶血型弧菌引发 的胃肠炎相当普遍，约占全部胃肠炎爆发事件的50%，原因是日本人爱生吃鱼。
KJ01副溶血性弧菌检验.
典型的副溶血性弧菌在TCBSL呈圆形、半透明、 表而光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似 口香糖的质感，直径2mm--3 mm 。
纯培养
挑取三个或以上可疑菌落，划线3 ％氯化钠 胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃ 土l ℃ 培养 18h--24h.
初步鉴定
氧化酶试验 挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶 阳性。 涂片镜检 将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色．镜检观察形态。副溶血性弧 菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有 鞭毛. 3﹪氯化钠三糖铁琼脂 挑取纯培养的单个可疑菌落，接种3 ％氯化钠三糖铁凉脂斜面并 穿刺底层，35 ℃ 士1 ℃ 培养24h 观察结果。
副溶血性弧菌致病性
致病因子： 1、耐热直接溶血素TDH，肠毒素 2、耐热相关溶血素TRH，与TDH 相似。
二、生物学特性
（一）形态与染色
1、革兰氏阴性无芽胞多形态杆菌， 无芽孢单端鞭毛、两端浓染。杆状、棒状、甚
至球状、丝状等
革兰染色阴性兼性厌氧菌,无芽孢， 有鞭毛
菌体为多形态杆菌 或 稍弯曲弧菌
3 ％氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变 黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色 加深，有动力。
嗜盐性试验
挑取纯培养的单个可疑菌落．分别接种于不 同氯化钠浓度的胰胨水，36 ℃ 士1 ℃ 培养 24h 观察液体混浊清况。 副溶血性弧菌在无氯化钠和10％氯化钠的胰 胨水中不生长或微弱生长，在7 ％氯化钠的胰 胨水中生长旺盛.
检 查
副溶血性弧菌
一.副溶血性弧菌的概述
副溶血性弧菌（Bibrio Parahemolyticus）， 进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜盐 菌食物中毒，主要翻版海产品。临床上以急性 起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。 本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体 发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也 渐增多。此菌对酸敏感，在普通食醋中5分钟即 可杀死；对热的抵抗力也较弱。
副溶血性弧菌检验PPT幻灯片课件
含量。
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• 神奈川现象(Kanagawa phenomenon，
KP) --在特定条件下，某些菌株在含 高盐(7％)的人O型血球或兔血球及以D 甘露醇作为碳源的我妻琼脂平板上产 生β溶血的现象 • 神奈川现象与本菌的 致病性密切相关
11
血清分型
• O抗原（耐热的菌体抗原） O1- O13 共13种
• K抗原型（荚膜抗原） K1- K71 共65种
• H抗原（鞭毛抗原），无特异性
12
三、检测程序
食品安全国家标准 副溶血性弧菌检验 GB 4789.7 -2013
13
GB 4789.7-2013
14
1、样品制备
• 食品样品 鱼类：表面组织、肠、鳃 贝类：全部内容物（贝肉和体液） 甲壳类：动物的中心部分，包括肠、鳃 水产制品
GB 4789.7-2013 副溶血性弧菌检验
1
• 一、概述 • 二、生物学特性 • 三、检测方法
2
一、概 述
• 副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus于 1950年从日本一次暴发性食物中毒中发现。
• 该菌存在于近海海水、海底沉积物和鱼类、 贝壳等海产品中。在37℃、pH7.7、3～ 4%NaCl环境中生长最好。
18
TCBS平板上典型特征
19
科玛嘉弧菌显色平板--紫色菌落
20
4、纯培养
• 挑取3个或以上的可疑菌落，划线3％氯化 钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1 ℃培养 18 h～24h。
5、初步鉴定
• 氧化酶试验 • 涂片镜检 • 3%氯化钠三糖铁 • 嗜盐性试验
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副溶血性弧菌检验 ——检验操作程序及要点
目录页
CONTENTS PAGE
检验操作程序及要点
— 2—
副溶血性弧菌检验—检验程序及操作要点
检验程序及操作要点-1
• • • • 流程图 增菌 分离 纯培养
— 3—
检验程序及操作要点
微生物学检验
依据GB 4789.7-2013《食品安全国家标
试述副溶血性弧菌在TCBS琼脂平板上的典型菌落特征
— 11 —
智慧职教 /portal/
校本资源库 / 参考网站： /
分离 纯培养
初步鉴定
结果与报告
确定鉴定
定性 定量
— 5—
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
检验程序及操作要点流程图源自副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 6—
检验程序及操作要点
增菌
无菌操作 称量或量取 均质
液态样品，不需均质，振荡混匀即可；
鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃；
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 8—
检验程序及操作要点
纯培养
挑取 3 个或以上可疑菌落
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 9—
检验程序及操作要点
初步生化鉴定
确定生化鉴定
革兰氏染色试验 氧化酶试验 动力试验
三糖铁（TSI）试验 嗜盐性试验
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 10 —
贝类取全部内容物，包括贝肉和体液； 甲壳类取整个动物，或者动物的中心部 分，包括肠和鳃。
选择性增菌液
及时检验 副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 7—
检验程序及操作要点
分离
二级生物安全实验室 TCBS琼脂平皿 弧菌显色培养平皿 TCBS琼脂平板上呈圆形、半透 明、表面光滑的绿色菌落，用 接种环轻触，有类似口香糖的 质感，直径2 mm～3 mm。 弧菌显色培养基上的特征按照 产品说明进行判定
准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》进行
检验操作以及按照GB 29921-2013《食品安
全国家标准 食品中致病菌限量》进行评价。
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 4—
检验程序及操作要点
GB 4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》 增菌
检验准备
检验操作