2022年生物分离实验案例
《2024年鞘氨醇单胞菌等3株内蒙古草原土壤新菌的分离鉴定》范文
《鞘氨醇单胞菌等3株内蒙古草原土壤新菌的分离鉴定》篇一鞘氨醇单胞菌等三株内蒙古草原土壤新菌的分离鉴定一、引言土壤是生物多样性的宝库，蕴藏着丰富的微生物资源。
近年来，随着对微生物生态学研究的深入，越来越多的新菌种从不同的土壤环境中被分离出来。
本篇论文主要报道了从内蒙古草原土壤中成功分离并鉴定的三株新菌，其中以鞘氨醇单胞菌为主，对其余两株新菌也进行了详细的描述。
二、材料与方法1. 采样地点与时间实验于内蒙古草原进行，采集土壤样品的时间为春秋季节，以获取最丰富的微生物资源。
2. 样品处理与培养采集的土壤样品经过适当处理后，采用不同的培养基进行培养，以分离出不同类型的微生物。
3. 菌种鉴定采用形态学观察、生理生化试验及分子生物学技术（如16S rRNA基因序列分析）等方法，对新菌进行鉴定。
三、结果与分析1. 新菌的分离与纯化通过不同的培养条件和培养基，成功从内蒙古草原土壤中分离出三株新菌。
经过纯化后，这些菌株均表现出独特的形态特征。
2. 形态学观察这三株新菌在显微镜下表现出各自独特的形态特征。
例如，鞘氨醇单胞菌呈杆状，具有明显的鞭毛。
3. 生理生化特性分析通过对这三株新菌的生理生化特性进行分析，发现它们具有不同的代谢途径和酶活性。
这为后续的分类和功能研究提供了重要依据。
4. 分子生物学鉴定利用16S rRNA基因序列分析等方法，对新菌进行分子生物学鉴定。
结果表明，这三株新菌分别属于不同的菌属和种。
其中，鞘氨醇单胞菌与已知菌种具有较高的相似性，但仍存在一定的差异。
四、讨论本实验从内蒙古草原土壤中成功分离出三株新菌，这些新菌在微生物生态学、土壤学和生物多样性等领域具有重要的研究价值。
首先，这些新菌的发现丰富了微生物资源的多样性，有助于我们更全面地了解土壤微生物的生态系统和功能。
其次，这些新菌可能具有独特的代谢途径和酶活性，为生物技术、农业和环保等领域提供了新的资源。
最后，通过对这些新菌的研究，我们可以更深入地了解微生物在土壤生态系统中的功能和作用，为保护和利用土壤资源提供科学依据。
生物分离纯化案例
生物分离纯化案例
生物分离纯化是一种将目标生物分子从复杂的混合物中分离出来的技术，常用于生物医药、食品工业和环境监测等领域。
以下是一个生物分离纯化的案例：
目标：分离纯化某种特定的酶
步骤：
1. 破碎细胞：使用物理或化学方法破碎细胞，释放出细胞内的酶。
2. 离心分离：通过高速离心机将破碎的细胞残渣与酶溶液分开。
3. 过滤：使用过滤器去除未破碎的细胞和杂质。
4. 层析：使用层析技术（如凝胶层析、离子交换层析等）将酶与其他杂质分离。
5. 透析：将层析得到的酶溶液与外界溶液进行物质交换，进一步纯化酶。
6. 浓缩：使用蒸发等方法将酶溶液浓缩，便于后续处理。
7. 结晶：通过结晶方法将纯化的酶结晶化，便于储存和运输。
通过以上步骤，可以将目标酶从复杂的混合物中分离出来，并进行纯化处理。
在实际操作中，根据不同的目标和要求，可以选择不同的分离纯化方法和技术。
2022学年高考生物一轮复习高考必考教材实验七__绿叶中色素的提取和分离探究案含解析新人教版
高考必考教材实验(七)——绿叶中色素的提取和分离任务1 实验解读(1)实验原理①提取：绿叶中的色素能够溶于________而不溶于水，可用________等有机溶剂提取色素。
②分离：各种色素在________中溶解度不同，________的随层析液在滤纸上扩散得快，反之则慢，从而使各种色素相互分离。
(2)实验步骤提取色素：称取5g绿叶，剪碎，放入研钵中→加入少量________和10mL________→研磨→过滤→将滤液收集到试管内并塞严试管口↓制备滤纸条：将干燥的定性滤纸剪成略小于试管________的滤纸条，将滤纸条一端剪去________，在距离剪角一端1cm处用________画一条细的横线↓画滤液细线：用________吸取少量的滤液，沿铅笔线均匀地________，待滤液干后，再画________次↓分离色素：将适量的________倒入试管中，将滤纸条(有滤液细线的一端向下)轻轻插入________中→用________塞紧试管口，装置如右图所示观察结果：滤纸条上呈现四条颜色、宽度不同的色素带任务2 研析深化教材，析因推理归纳，提升学科素养(1)为什么需要选用新鲜绿色的叶片做实验材料？(2)研磨时为什么要迅速？研磨时为什么还要加入少量的CaCO3和SiO2?(3)盛放滤液的试管管口为什么要加棉塞？(4)滤纸为什么需预先干燥处理？在制备滤纸条时，为什么将一端的两个角剪掉？(5)为什么画滤液细线要直、细、匀，而且待滤液细线干燥后再重复画一两次？(6)在层析时，为什么不能让滤液细线触及层析液液面？(7)分析滤纸条上色素带宽窄不同的原因。
(8)如图是实验得到的色素在滤纸条上的分布图示，分析比较各种色素的含量及其在层析液中的溶解度的大小。
考向一教材实验的基础考查1．[经典高考]下列用新鲜菠菜叶进行色素提取、分离实验的叙述，正确的是( ) A．应该在研磨叶片后立即加入CaCO3，防止色素被破坏B．即使菜叶剪碎不够充分，也可以提取出4种光合作用色素C．为获得10mL提取液，研磨时一次性加入10mL乙醇研磨效果最好D．层析完毕后应迅速记录结果，否则叶绿素条带会很快随溶液挥发消失2．[经典高考改编]为研究高光强对移栽幼苗光合色素的影响，某同学用乙醇提取叶绿体中的色素，用石油醚进行纸层析，如图为滤纸层析的结果(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为色素条带)。
“生物分离工程”综合性实验设计
“生物分离工程”综合性实验设计
谢虹;张彪;陆盈盈
【期刊名称】《广东化工》
【年(卷),期】2022(49)22
【摘要】《生物分离工程》是生物工程专业的核心课程,具有综合性、工程性及实践性的特点。
为了提高《生物分离工程》的教学质量,设计了“法夫酵母中虾青素
的溶剂萃取”、“干辣椒中辣椒红素的硅胶柱色谱分离”和“甜叶菊中甜菊糖苷高效液相色谱含量测定”等3个综合性实验。
实验内容涵盖溶剂萃取、浸取、絮凝、细胞破碎、固液分离、真空浓缩、色谱分离和高效液相色谱法等课程内容。
3个综合性实验项目简便、易于操作,应用于多届生物工程专业的本科生的实验教学,激发
了学生的学习兴趣,巩固了学生所学的理论知识,提高了学生的实践操作能力,取得了良好的教学效果。
【总页数】3页(P260-261)
【作者】谢虹;张彪;陆盈盈
【作者单位】扬州大学生物科学与技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】G642;Q819
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合性实验设计4.中南大学生物医学工程研究院简介生物医学工程学是一门生命科
学与工程技术相结合的具有高度综合性的学科。
它所包含的分支领域有：基因工程、组织工程、医疗器械、生物力学、光电子学、材料学、生物信息学、计算机应用、纳米生物技术、人工器官、康复医学、医学成像技术等。
是5.一种在生物医学工
程科研中有实用价值的实验设计方法——均匀设计与正交实验设计联用的实验设
计方法
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《2024年鞘氨醇单胞菌等3株内蒙古草原土壤新菌的分离鉴定》范文
《鞘氨醇单胞菌等3株内蒙古草原土壤新菌的分离鉴定》篇一鞘氨醇单胞菌等三株内蒙古草原土壤新菌的分离鉴定一、引言土壤是生物多样性的宝库，微生物在其中扮演着重要的角色。
近年来，内蒙古草原因其独特的地理环境和气候条件，吸引了众多微生物学家的关注。
本文旨在介绍从内蒙古草原土壤中成功分离出的三株新菌，其中以鞘氨醇单胞菌为主，详细阐述其分离、鉴定过程及潜在的应用价值。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）土壤样品：采集自内蒙古草原的不同区域。
（2）培养基：采用营养丰富的土壤浸提液及各种选择性培养基。
2. 实验方法（1）样品处理：将土壤样品进行梯度稀释，制备成悬液。
（2）分离纯化：在选择性培养基上涂布悬液，进行细菌的分离纯化。
（3）形态观察：利用显微镜观察细菌的形态特征。
（4）生理生化实验：进行酶活性检测、碳源利用等生理生化实验。
（5）分子生物学鉴定：采用16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。
三、实验结果1. 分离出的新菌株经过严格的分离纯化过程，成功从内蒙古草原土壤中分离出三株新菌株，其中以鞘氨醇单胞菌为主。
2. 形态特征通过显微镜观察，发现这三株菌的形态各异，具有独特的细胞结构。
其中，鞘氨醇单胞菌呈短杆状，表面光滑。
3. 生理生化特征通过生理生化实验，发现这三株菌具有不同的酶活性及碳源利用能力。
例如，鞘氨醇单胞菌能够产生某种特定酶，并利用多种碳源。
4. 分子生物学鉴定结果通过16S rRNA基因测序，确认了这三株菌的种属关系。
其中，鞘氨醇单胞菌与已知菌种存在一定的差异，属于新种。
四、讨论1. 菌种特性分析这三株新菌在生长条件、代谢途径、酶活性及碳源利用等方面表现出独特的特性，具有较高的研究价值。
特别是鞘氨醇单胞菌，其独特的生理生化特征为其在环境修复、生物肥料等领域的应用提供了可能性。
2. 菌种鉴定方法的优势与局限性分子生物学鉴定方法如16S rRNA基因测序在菌种鉴定中具有较高的准确性和可靠性，但也可能存在序列相似度高而实际种属差异较大的情况。
《2024年鞘氨醇单胞菌等3株内蒙古草原土壤新菌的分离鉴定》范文
《鞘氨醇单胞菌等3株内蒙古草原土壤新菌的分离鉴定》篇一鞘氨醇单胞菌等三株内蒙古草原土壤新菌的分离鉴定一、引言内蒙古草原作为我国最具代表性的天然草原之一，拥有丰富的生物多样性和独特的生态环境。
土壤中的微生物是草原生态系统的重要组成部分，对于维持土壤肥力和生态平衡具有重要意义。
近年来，随着微生物学研究的深入，从内蒙古草原土壤中分离鉴定出新菌种逐渐成为研究热点。
本文以鞘氨醇单胞菌等三株内蒙古草原土壤新菌为例，探讨其分离鉴定的方法和过程。
二、材料与方法1. 样品采集本实验从内蒙古草原不同地区采集了土壤样品，经过筛选和纯化，成功分离出三株新菌。
2. 分离纯化采用梯度稀释法、涂布法等对土壤样品进行分离纯化，获得纯菌株。
3. 形态学鉴定对纯菌株进行形态学观察，包括菌落形态、菌体形态、染色特性等。
4. 生理生化鉴定通过测定菌株的酶活性、碳源利用能力、氮源利用能力等生理生化指标，对菌株进行初步鉴定。
5. 分子生物学鉴定利用16S rRNA基因序列分析技术，对菌株进行分子生物学鉴定，确定其分类地位。
三、实验结果1. 分离纯化结果经过分离纯化，成功获得三株新菌，分别命名为菌株A、菌株B和菌株C。
2. 形态学鉴定结果菌株A的菌落呈圆形，表面光滑，颜色为白色；菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性。
菌株B的菌落呈不规则形状，表面粗糙，颜色为黄色；菌体呈球形，革兰氏染色呈阴性。
菌株C的菌落呈链状排列，颜色为淡黄色，菌体呈螺旋状。
3. 生理生化鉴定结果三株新菌均具有一定的酶活性，如蛋白酶、脂肪酶等。
在碳源利用方面，各菌株对不同碳源的利用能力有所不同。
在氮源利用方面，部分菌株具有固氮能力。
4. 分子生物学鉴定结果通过16S rRNA基因序列分析，确定三株新菌分别属于鞘氨醇单胞菌属、拟杆菌属和变形杆菌属。
其中，菌株A与已知鞘氨醇单胞菌有较高的相似度，但存在一定的基因差异；而菌株B和C均为首次从内蒙古草原土壤中发现的未知种类。
四、讨论本研究成功分离出三株内蒙古草原土壤新菌，并通过形态学、生理生化及分子生物学方法对其进行了初步鉴定。
微生物分离实验报告
微生物分离实验报告实验仪器及材料土样：18号土样试剂及培养基培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基a)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等仪器锥形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培养皿（20套）、试管（20支）、移液管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等细菌的筛选，分离纯化及鉴定细菌的筛选土样处理配制生理盐水：在烧杯中配置200ml0.85％的生理盐水，用移液管各移取9ml于五支洁净试管，再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶，并放入少许玻璃珠，包好灭菌；加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡摇匀，然后放在30℃恒温培养箱中静置15min。
果胶酶菌种筛选梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液（如下图）；涂布：配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，分别写上10-1、10-3两种稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由10-3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿准确放入0.2ml，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿，用0.5％的刚果红染色15-20min 后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；菌落描述：取此菌进行菌落形态描述，就菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记录；细菌的分离纯化划线分离：制备果胶酶划线培养基，灭菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌种，第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离，划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。
高中生物细菌分离实验教案
高中生物细菌分离实验教案实验目的：通过本实验，学生将学会如何从混合菌群中分离出单一种类的细菌，并学会使用无菌技术和培养基的制备方法。
实验材料：1. 不同种类的细菌混合溶液2. 琼脂培养基3. 火焰灼烧器4. 细菌培养皿5. 培养箱6. 培养基接种环7. 酒精灯实验步骤：1. 首先，准备好所有实验所需的材料和设备，确保所有器材都经过高温消毒处理。
2. 用火焰灼烧器将细菌培养皿的口部加热杀菌，使其无菌。
3. 用培养基接种环在混合细菌溶液中采集细菌样本，然后在无菌的琼脂培养基上均匀涂抹。
4. 将接种好的琼脂培养基培养皿放入培养箱中，设置适当的温度和湿度，在培养箱内培养一段时间。
5. 定期观察培养皿的生长情况，观察细菌的形态和颜色。
6. 当发现单一种类的细菌开始生长时，使用培养基接种环将其转移到新的琼脂培养基培养皿上，继续培养。
7. 最终得到单一种类的纯种菌落。
实验注意事项：1. 实验过程中要做到无菌操作，严格控制外部环境的污染。
2. 注意实验材料和设备的消毒和清洁工作。
3. 操作过程中要注意火焰灼烧器的使用安全。
4. 注意安全防护措施，避免细菌传播及误伤。
拓展实验：1. 利用不同培养基和培养条件，观察不同种类细菌的生长情况。
2. 进行抗生素敏感性测试，比较不同细菌对抗生素的敏感性。
3. 探究细菌对环境的适应性，如对不同pH值、温度和氧气浓度的适应能力等。
实验总结：通过本实验，学生将学会分离和鉴定不同细菌种类的方法和技术，加深对细菌的了解，培养实验操作技能和实验观察分析能力。
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2022年生物分离实验案例分别测定吸光度。
空白参比操作同上，不加没食子酸丙酯。
以容量瓶中没食子酸丙酯的绝对含量mg为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，做线性回归。
C样品测定取适量样品加入容量瓶，操作同上，没食子酸丙酯含量乘以换算系数1.5，求得茶多酚。
实验二超声法和回流法提取茶多酚的比较实验仪器：超声提取器、布氏漏斗、抽滤瓶、真空泵、烧瓶、量筒、分光光度计、比色皿、容量瓶等、实验试剂茶叶、纯净水、茶多酚（没食子酸丙酯）、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等操作方法1、材料准备称取一定量的茶叶，研钵粉碎。
备用2、提取A、超声提取法称取5g粉碎后茶叶末，放入烧瓶（塑料袋密封），加入100mL水，于超声提取器，50℃提取20min，抽滤，定容至100mL，待测。
B、回流提取法称取10g粉碎后茶叶末，放入圆底烧瓶，加入100mL水，80℃提取40min，酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。
它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。
它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。
酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。
酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。
在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一个常需测定的指标。
常用于测定酪蛋白的方法是先将酪蛋白在等电点沉淀，再用凯氏定氮法测定。
本实验采用双缩脲法测定酪蛋白。
其原理为：蛋白质含肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，在540nm波长处有最大吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。
三、材料与试剂市售牛奶10mg/mL酪蛋白标准溶液（用0.1MNaOH配制）0.1MNaOH溶液、0.2MpH4.6的HAc－NaAc缓冲液双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5g，加水100mL，加热助溶；另称取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g、碘化钾5g溶于500mL水中。
两液混匀后，在搅拌下加入10%NaOH300mL，后用水稀释至1000mL，贮存于塑料瓶中。
此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。
四、操作步骤1、牛乳中酪蛋白的等电点沉淀用量筒量取25mL牛乳两份分别置于50mL烧杯中，水浴加热至40℃，在搅拌下慢慢加入到已预热至40℃的等体积的0.2MpH4.6的HAc－NaAc缓冲液中，混匀，冷却静置30min沉淀酪蛋白后，3000r/min离心15min，弃上清液，收集沉淀。
一份沉淀用于“除杂”步骤，另一份沉淀用0.1MNaOH溶液溶解并定容至100mL，用于“酪蛋白含量测定”步骤。
2、除杂将上述沉淀捣碎，加入10mL95%乙醇，搅拌制成悬浮液。
将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再用10mL乙醚－乙醇混合液（1∶1）洗涤沉淀两次，最后再用10mL乙醚洗涤沉淀两次，抽干。
将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开挥干乙醚后，置烘箱中80℃干燥过夜，称重（m1）。
3、酪蛋白含量测定（1）标准曲线的绘制分别移取酪蛋白标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于干燥试管中，不足1.0mL者用0.1MNaOH溶液补足1.0mL，然后分别加入4.0mL双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波长处吸光度。
以酪蛋白质量（mg）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
（2）酪蛋白含量测定取―步骤1‖中样品溶液1.0mL，加入4.0mL双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波长处吸光度，查标准曲线，求得酪蛋白质量。
平行测定3次，求其平均值，并计算25mL牛乳中酪蛋白的质量（m2）。
五、结果与讨论1、牛乳中酪蛋白含量的计算含量（g/mL）=2、酪蛋白提取得率的计算得率（%）=m2?100牛乳体积（25mL）m1?100%m2?100六、思考题1、为什么在等电点沉淀时需加热至40℃？2、除杂时，能否将三种溶剂的顺序颠倒？为什么？3、双缩脲法测定蛋白的原理是什么？4、比较牛乳中酪蛋白测定含量与理论含量大小，并对测定结果进行讨论。
实验二：大蒜细胞SOD酶的提取与分离一、实验目的1、掌握SOD酶的提取、分离、检测等一般步骤；2、掌握酶在提取过程中的两个重要参数：回收率和纯化倍数。
二、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种就有抗氧化，抗衰老，抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组合组织或者细胞破碎后，可用PH7.8的`磷酸缓冲液体提取。
由于SOD不溶于丙酮中，可用丙酮将其沉淀析出。
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在325nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、试剂和材料新鲜蒜瓣，市售磷酸缓冲液：0.05mol/L，pH7.8氯仿一乙醇混合溶剂：氯仿﹕无水乙醇=3﹕5（V/V）丙酮：用前冷却至4～10℃0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）10mmol/LHCl45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）四、实验步骤1、组织或细胞破碎称取5g左右大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨，使组织或细胞破碎。
2、SOD的提取将上述破碎的组织或细胞，加入2～3倍体积（10-15mL）的0.05mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000r/min下，离心15min，收集上清液得提取液。
留出1mL备用，剩余提取液准确量取体积后进行下步实验。
3、除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿一乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min 离心15min，去杂蛋白沉淀，收集上清液得粗酶液。
留出1mL备用，剩余粗酶液准确量取体积后进行下步实验。
4、SOD的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r/min离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于少量（5ml）0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液中，再加水5mL，5000r/min离心15min，收集上清液，得SOD酶液。
准确量取体积。
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力和蛋白浓度。
5、SOD活力测定参照李建武的《生物化学实验原理和方法》，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的酶活力。
邻苯三酚在碱性环境中即可迅速发生自氧化作用，在自氧化过程中产生有色中间物和O2-自由基，反应开始后溶液逐渐变成黄色，在有超氧化物歧化酶存在时，由于它能催化O2-自由基与+H结合生成02和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，降低了自氧化速率。
中间产物在325nm时有强力的光吸收，采用分光光度计即可检测。
（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：在试管中按表1加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。
以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算邻苯三酚自氧化速率k0（直线斜率）。
表1邻苯三酚自氧化测定加样表试剂0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）蒸馏水10mmol/LHCl45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）总体积加样量（mL）校零管4.54.40.1——9.0测定管4.54.4——0.19.0（2）SOD酶活的测定：在试管中按表2加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。
以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算加入SOD酶样品后的邻苯三酚自氧化速率k1（直线斜率）。
表2SOD酶活测定加样表试剂0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）蒸馏水10mmol/LHCl待测样45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）总体积加样量（mL）校零管4.54.30.10.1——9.0测定管4.54.3——0.10.19.0（3）酶活力测定酶活性单位定义为：在lml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。
按下式计算样品中SOD酶单位活力：k0-k1样品液稀释倍数?50%?反应液总体积?加入样品液体积单位体积活力（U/ml）=k0活性单位定义体积总活力（U）=单位体积活力?样品液总体积式中：反应液总体积=9mL；样品液稀释倍数=1；加入样品液体积=0.1mL；活性单位定义体积=1mLl；样品液总体积=实验中各样品实测体积。
6、样品中可溶性蛋白含量的测定从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液中分别取0.2mL、0.4mL、0.5mL，按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍进行稀释，分别测定稀释液在260nm。