免疫学实验：NK细胞毒检测
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免疫学检测技术及应用
划痕法
细胞因子的检测技术
一、 生物学检测技术 二、 免疫学检测技术 三、分子生物学检测技术
依赖细胞株测定法 ELISA法
分子杂交、PCR 等检测mRNA
细胞因子检测的特点
• 样品含量低 •样品具有时效性 •生物效应特异性差
Figure 14-12
细胞因子的功能
Cell activation
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
•3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA 合成含量。灵敏度高，具有放射性。 •四甲基偶氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性 MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使 其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性 差。
NK细胞毒活性-LDH释放法
1只/组
2. YAC-1 1*105 * 2ml 3. 培养液（1640) 无FCS
5ml/ 组
3. 培养液(1640) 3%FCS
10ml/组
3. LDH底物
3ml/组
4. 柠檬酸（终止液）1ml/组
·3·
原理
免疫学实验
➢ NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞， 为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细 胞并列的第三类群淋巴细胞。 ➢ NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性 既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无 MHC限制。 ➢YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV) 感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测 NK细胞的杀伤活性。
·8·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，
不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内 释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮 酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶 (NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还 原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形 成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利 用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值 最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
·7·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)， 即可计算出NK细胞活性。
免疫学实验方法
可通过以下三种方法检测。
1）形态计数法
2）3H-TdR或125I-UdR掺入法
放射性元素 wash
Stimulate
Assay
3）MTT（噻唑蓝）比色法 MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被
活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素
还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此
甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速
三. 制备SDS－PAGE胶
四. 转移电泳及免疫印迹
五. 结果分析-用Western Blot 图片灰度分析软件
imageJ或Quantity One
免疫学三大工具比较
• 免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧 光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行
定位、定性及定量的研究（主要是定位）。样本是细胞或组
• 免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只 是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上 有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度 非常高。 • Western Boltting 先要进行SDS-PAGE，然后 将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载 体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测 样品，可以用于定性和半定量。
假阴性结果。
• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大
分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单
价抗原，因其不能形成两位点夹心 。
间接法测抗体
☆ 间接法是检测抗体最常用的方法。 ☆ 原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的
受检抗体，故称为间接法。
☆ 操作步骤：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，
用于临床检验的ELISA主要有以下几 夹心法 双抗原夹心法测抗体 • 间接法测抗体（常用）
1）形态计数法
2）3H-TdR或125I-UdR掺入法
放射性元素 wash
Stimulate
Assay
3）MTT（噻唑蓝）比色法 MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被
活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素
还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此
甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速
三. 制备SDS－PAGE胶
四. 转移电泳及免疫印迹
五. 结果分析-用Western Blot 图片灰度分析软件
imageJ或Quantity One
免疫学三大工具比较
• 免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧 光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行
定位、定性及定量的研究（主要是定位）。样本是细胞或组
• 免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只 是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上 有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度 非常高。 • Western Boltting 先要进行SDS-PAGE，然后 将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载 体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测 样品，可以用于定性和半定量。
假阴性结果。
• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大
分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单
价抗原，因其不能形成两位点夹心 。
间接法测抗体
☆ 间接法是检测抗体最常用的方法。 ☆ 原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的
受检抗体，故称为间接法。
☆ 操作步骤：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，
用于临床检验的ELISA主要有以下几 夹心法 双抗原夹心法测抗体 • 间接法测抗体（常用）
实验诊断-一院检验-免疫学检测
病毒感染 应用免疫抑制剂 (2) 估计疾病疗效及预后
（三） T细胞分化抗原测定
【原理】 流式细胞术
【参考值】
CD3+: 61--85％ ;
CD3+CD8+ (Ts): 19--48％;
CD3+CD4+ (Th):28--58％ ; CD4+CD8+ (Th/Ts): 0.9--2.0;
【临床意义】 （1）T细胞总数的变化（CD3）
肝癌的疗效观察、预后判断；
【临床意义】
生殖腺胚胎癌，胃癌，胰腺癌 病毒性肝炎，肝硬化AFP有不同程度升高，通常<300ug/L。 妇女妊娠3个月后AFP↑，7-8个月达高峰,分娩后3周正常。 AFP-L3有助于区分良恶性肝病，AFP-L3/AFP>15%为阈值。 AFU在诊断肝癌中敏感性好，阳性率高，对AFP阴性病例及
AFU是溶酶体酸性水解酶，广泛存在于人体各组织细胞溶酶 体和体液中。
【参考范围】 AFP＜25μg/L；AFP-L3＜10%；AFU:234-414 μmol/L；
【临床意义】
原发性肝癌的普查与早期筛选； 原发性肝细胞癌的早期诊断指标之一；
1）血清阈值>400ug/L，持续4W； 2）400ug/L>血清阈值>200 ug/L，持续8W； 3）AFP在50～200ug/L，随访AFP上升可能为“亚临床”；
升高见于各种消化道肿瘤、卵巢癌 对于胃癌如与CA153同时检测，对于胃癌如与CEA 同时检测可提高阳性率。
(3) CA199
CA19-9为消化道癌相关抗原，主要是胰腺癌和结、直肠癌 的标志物。 【参考值】 血清内正常值＜3.7万U／L 【临床意义】
（三） T细胞分化抗原测定
【原理】 流式细胞术
【参考值】
CD3+: 61--85％ ;
CD3+CD8+ (Ts): 19--48％;
CD3+CD4+ (Th):28--58％ ; CD4+CD8+ (Th/Ts): 0.9--2.0;
【临床意义】 （1）T细胞总数的变化（CD3）
肝癌的疗效观察、预后判断；
【临床意义】
生殖腺胚胎癌，胃癌，胰腺癌 病毒性肝炎，肝硬化AFP有不同程度升高，通常<300ug/L。 妇女妊娠3个月后AFP↑，7-8个月达高峰,分娩后3周正常。 AFP-L3有助于区分良恶性肝病，AFP-L3/AFP>15%为阈值。 AFU在诊断肝癌中敏感性好，阳性率高，对AFP阴性病例及
AFU是溶酶体酸性水解酶，广泛存在于人体各组织细胞溶酶 体和体液中。
【参考范围】 AFP＜25μg/L；AFP-L3＜10%；AFU:234-414 μmol/L；
【临床意义】
原发性肝癌的普查与早期筛选； 原发性肝细胞癌的早期诊断指标之一；
1）血清阈值>400ug/L，持续4W； 2）400ug/L>血清阈值>200 ug/L，持续8W； 3）AFP在50～200ug/L，随访AFP上升可能为“亚临床”；
升高见于各种消化道肿瘤、卵巢癌 对于胃癌如与CA153同时检测，对于胃癌如与CEA 同时检测可提高阳性率。
(3) CA199
CA19-9为消化道癌相关抗原，主要是胰腺癌和结、直肠癌 的标志物。 【参考值】 血清内正常值＜3.7万U／L 【临床意义】
实验诊断学：临床常用免疫学检测
（CH50）。 增高见于急性炎症和某些恶性肿瘤等；减低见于
各种免疫复合物性疾病等。
二、补体C3 、C4检测
C3：含量最高，是补体系统经典激活途径与旁路激活途径的 汇合点和关键物质，为急性时相反应蛋白。
C4：参与经典途径，多种生物学功能。 临床意义： （1）增高：急性炎症、传染病早期、组织损伤、移植排斥反应
(一)正常血清免疫球蛋白（五大类） ：有抗体活性
IgG---含量最多、比例最高、唯一通过胎盘的主力抗体。 IgA---分泌型IgA（SIgA）主控黏膜局部免疫，存在于外
分泌液中（如唾液、泪液、母乳等）。 IgM---分子量最大、凝集和溶解力最强。 IgD---含量很低功能不祥。 IgE---含量最低、亲细胞、参与变态反应（如寄生虫感染、
NK细胞活性：减低见于血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺 陷病、艾滋病和某些病毒感染等；升高见于宿主抗移植 物反应。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒（ADCC）:由细胞表面的抗 体Fc受体介导。
四、细胞因子（cytokine,CK）检测
概念：细胞因子是一类由免疫细胞和相关细胞产生的调节细胞功能的 高活性、多功能、低分子的分泌性蛋白质，属于微量免疫调节因子。
参考值：形态学法的转化百分率为（60.1±7.6）%。 临床意义：同前，但Down综合征时明显升高。
（三）T细胞分化抗原（CD）测定
1.T细胞分化抗原主要类别： CD3+ —代表总T细胞、 CD4+ —代表T辅助性 细胞（Th）、 CD8+ —代表T抑制性细胞（Ts）。
2.临床意义： CD3+降低：自身免疫性疾病（AID），如SLE、RA等。 CD4+降低：恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、 AIDS、应用免疫抑制剂者
各种免疫复合物性疾病等。
二、补体C3 、C4检测
C3：含量最高，是补体系统经典激活途径与旁路激活途径的 汇合点和关键物质，为急性时相反应蛋白。
C4：参与经典途径，多种生物学功能。 临床意义： （1）增高：急性炎症、传染病早期、组织损伤、移植排斥反应
(一)正常血清免疫球蛋白（五大类） ：有抗体活性
IgG---含量最多、比例最高、唯一通过胎盘的主力抗体。 IgA---分泌型IgA（SIgA）主控黏膜局部免疫，存在于外
分泌液中（如唾液、泪液、母乳等）。 IgM---分子量最大、凝集和溶解力最强。 IgD---含量很低功能不祥。 IgE---含量最低、亲细胞、参与变态反应（如寄生虫感染、
NK细胞活性：减低见于血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺 陷病、艾滋病和某些病毒感染等；升高见于宿主抗移植 物反应。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒（ADCC）:由细胞表面的抗 体Fc受体介导。
四、细胞因子（cytokine,CK）检测
概念：细胞因子是一类由免疫细胞和相关细胞产生的调节细胞功能的 高活性、多功能、低分子的分泌性蛋白质，属于微量免疫调节因子。
参考值：形态学法的转化百分率为（60.1±7.6）%。 临床意义：同前，但Down综合征时明显升高。
（三）T细胞分化抗原（CD）测定
1.T细胞分化抗原主要类别： CD3+ —代表总T细胞、 CD4+ —代表T辅助性 细胞（Th）、 CD8+ —代表T抑制性细胞（Ts）。
2.临床意义： CD3+降低：自身免疫性疾病（AID），如SLE、RA等。 CD4+降低：恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、 AIDS、应用免疫抑制剂者
临床免疫学检验.
所有抗体都是免疫球蛋白，
但免疫球蛋白不都是抗体。
临床检测的血清免疫球蛋白
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgA1 IgA2 IgD IgE 重链 1 2 3 4 1 2 主要存在形式 单体 单体 单体 单体 五聚体 单体、双体 单体 单体 经典途径活化补体 ++ + +++ +++ 穿过胎盘 +++ + ++ 结合吞噬细胞 +++ +++ + + + 结合肥大细胞和嗜 +++ 碱粒细胞 与 SPA 结合 + + + NK 细 胞 介 导 的 ++ ++ ADCC 免疫作用 抗感染、自身抗体 早期防 粘膜局部 B 细 I 型 胞成 御作用 免疫 超敏 熟标 反应 志
新生儿、婴幼儿由于体液免疫功能尚不成 熟，免疫球蛋白的含量较成人低，需按年 龄组进行分析与判断。 关于血清IgE和IgD的测定： 血清总IgE为0.13～0.92mg/L; 血清总IgD为0.6～2.0mg/L; IgE值升高多见于超敏反应性疾病,骨髓瘤 IgD值升高多见于骨髓瘤等。
异常免疫球蛋白检测：
临床免疫学检验 (clinical immunological test)
范畴(category)：
1、感染性疾病(infection disease) 2、自身免疫性疾病(autoimmune ～) 3、超敏反应性疾病 (hypersensitivity ～ ) 4、免疫缺陷/增殖性疾病
但免疫球蛋白不都是抗体。
临床检测的血清免疫球蛋白
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgA1 IgA2 IgD IgE 重链 1 2 3 4 1 2 主要存在形式 单体 单体 单体 单体 五聚体 单体、双体 单体 单体 经典途径活化补体 ++ + +++ +++ 穿过胎盘 +++ + ++ 结合吞噬细胞 +++ +++ + + + 结合肥大细胞和嗜 +++ 碱粒细胞 与 SPA 结合 + + + NK 细 胞 介 导 的 ++ ++ ADCC 免疫作用 抗感染、自身抗体 早期防 粘膜局部 B 细 I 型 胞成 御作用 免疫 超敏 熟标 反应 志
新生儿、婴幼儿由于体液免疫功能尚不成 熟，免疫球蛋白的含量较成人低，需按年 龄组进行分析与判断。 关于血清IgE和IgD的测定： 血清总IgE为0.13～0.92mg/L; 血清总IgD为0.6～2.0mg/L; IgE值升高多见于超敏反应性疾病,骨髓瘤 IgD值升高多见于骨髓瘤等。
异常免疫球蛋白检测：
临床免疫学检验 (clinical immunological test)
范畴(category)：
1、感染性疾病(infection disease) 2、自身免疫性疾病(autoimmune ～) 3、超敏反应性疾病 (hypersensitivity ～ ) 4、免疫缺陷/增殖性疾病
细胞免疫学检测临床分析
细胞免疫学检测临床分析1.1 细胞引起的靶细胞杀伤大致分三种情况，一是CTLs细胞毒作用，是特异抗原激发的，受MHC分子限制的细胞杀伤；二是自然杀伤细胞发挥的细胞毒作用，所谓自然杀伤即细胞不需MHC参与，亦不借助抗体，而对靶细胞(如异体细胞、瘤细胞)造成杀伤；三是抗体介导的细胞毒(ADCC)作用，在ADCC中，效应细胞的特异性和功能发挥均由致敏抗体决定。
1.2 NK活性与肿瘤相关密切，一般认为，肿瘤患者的NK活性多呈降低状态，此与瘤细胞的免疫逃避有关。
通过免疫调节，增强免疫措施，体外法或体内提高NK活动，有助于肿瘤的控制。
1.3 LAK和NK的作用属于自然杀伤细胞活性，测定其活性主要有两种方法，一是乳酸脱氢酶释放法，现已少用。
二是51Cr释放法，该法测定放射核素51Cr标记的靶细胞在效应细胞的作用下的破坏，溶解程度，以51Cr释放为指标。
靶细胞多采用瘤细胞株[1]。
2 T细胞表面分化抗原测定(CD molecules)2.1 T细胞表面的CD分子T细胞表面的CD分子有十几种，应用最多的有以下几种[2]。
2.1.1 CD2分子 CD2分子即绵羊红细胞受体，是T细胞E花环试验的介导分子，在95％人外周血T细胞表达。
该CD分子参与细胞的免疫功能，对T细胞受体的抗原识别有辅助作用，同时，CD2分子还是补体C3的受体成分之一。
CD2分子并非在全部T细胞上有表达，CD2分子本身也有一个分化成熟与否的问题。
用单抗称记CD2分子阳性的细胞，有时E花环试验会呈阴性反应。
2.1.2 CD3分子 CD3分子是泛T细胞标记，在成熟胸腺细胞、所有的外周血T细胞(包括静息态和激活态)都有表达，而在粒细胞，单核细胞上不表达，是总T细胞的最重要标志。
CD3构成TCR的一部分，对T细胞活化有重要影响，抗CD3抗体可促进T细胞产生IL－2、TNFα等多种细胞因子，增强CTLs、LAK、NK细胞的瘤细胞杀伤活性。
抗CD3单克隆抗体，还可用于治疗器官移植后的排异反应，作用类似抗淋巴细胞血清。
检验科免疫室检验项目
检验科免疫室检验项目介绍免疫学是研究机体对抗感染、肿瘤和自身免疫疾病等相关免疫反应的学科。
在医学领域中，免疫学在临床诊断和治疗方面起到了重要的作用。
检验科免疫室是一种具备先进设备和技术，可以进行免疫学检验的专门实验室。
免疫学检验是通过检测机体的免疫反应、抗体和细胞因子等指标来评估机体的免疫状态和判断是否存在免疫相关的疾病。
在免疫室中，进行免疫学检验需要掌握一系列的技术和方法，以确保准确的检测结果并为临床提供可靠的依据。
检验项目分类1.免疫系统功能检测–淋巴细胞亚群分析：通过流式细胞仪等设备检测T细胞、B细胞和NK 细胞等亚群的数量和比例，评估机体免疫系统的功能状态。
–免疫球蛋白测定：检测血清中的免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM等）的水平，评估机体的免疫功能。
2.自身免疫病检测–自身抗体检测：检测血清中是否存在抗核抗体、抗磷脂抗体等，用于早期诊断和监测自身免疫疾病（如系统性红斑狼疮、抗磷脂抗体综合征等）的发展。
–自身抗原检测：通过检测血液或其他组织中的自身抗原（如RF、ANCA等）的水平，用于诊断和评估自身免疫性疾病。
3.传染病相关检测–病原体抗体检测：通过检测血清中的病原体特异性抗体，如HIV抗体、乙肝病毒抗体等，用于确认感染病原体和分析感染状态。
–免疫反应性蛋白检测：通过检测病原体特异性的免疫反应蛋白（如流感病毒抗原、白喉杆菌抗原等），用于早期诊断和监测传染病的发展。
具体检验技术1.免疫层析法–检测原理：利用抗体与抗原发生特异性结合反应，通过检测反应后的彩色条带来判断样本中抗原或抗体的存在与浓度。
–应用范围：常用于一些便携式检测仪器或试纸上，应用于快速检测一些常见的传染病等。
2.酶联免疫吸附试验（ELISA）–检测原理：利用酶标抗体或酶标抗原与待测物特异性结合，通过底物的化学反应生成染色产物，利用光密度计读取并判断待测物的浓度。
–应用范围：广泛应用于抗体和抗原的检测，如HIV抗体检测、肿瘤标志物检测等。
NK细胞杀伤活性检测
效应细胞的制备
（分离外周血单个核细胞）
采集静脉血4 ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝
分别吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中， 将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入抗凝血
离心2000rpm×20min
密度梯度离心分离淋巴细胞亚群
用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板， 再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）
实用文档
根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目， 从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断 疾病的预后，考核药物疗效等。
实用文档
实用文档
【实验方法】
淋巴细胞与SRBC按一定比例(1:10)混合 37℃ 5分钟，
4℃20分钟 取样涂片瑞氏染色、
镜检。 计数E花实用文环档 数，算出总花环
【结果观察】
据的2倍。
效-靶细胞作用
将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加 入96孔细胞培养板的孔中, 每份标本设2个复孔,
同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml RPMI-1640液)
最大释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml1％NP-40液),
1000r/min, 2min后, 置37℃、5％CO2温 箱中孵育2-4h。
实验组 12
靶细胞（100μl）
++
效应细胞（100μl） + +
RPMI1640 （100μl） - -
1%NP-40 （100μl） - -
自然释放组
3
4
+
+
-
-
+
+
-
-
免疫学检验-免疫细胞及其功能检验技术
• 所用的方法应力求操作简便、尽量保持细胞活性 兼顾细胞纯度和获得率。
一、白细胞的分离 （一）自然沉降法
加抗凝血于试管中
室温或37℃中静置 （30-60min）
分层
结果示意图
（二）高分子聚合物沉降法
抗凝血与等量3%明胶或 6%右旋糖酐溶液混匀
室温或37℃中静置 （30～60min）
分层结果与自然沉降法 类似
四、吞噬细胞的分离
•吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞 噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器 官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中 性粒细胞。 •分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。
（一）单核细胞的分离
• Percoll密度梯度分离法 • 流式细胞术分离法（常用方法） • 免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法
） • 黏附法
黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除 单核细胞。
（二）巨噬细胞的分离
• 斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞）
操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前 臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出 现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。
• 腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞）
优点：速度快、得率高 不足：白细胞黏性增加
二、外周血单个核细胞的分离
•外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）主要是指淋巴 细胞和单核细胞。 •PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群 •PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。
人外周血中各类血细胞密度
（二） Percoll分层液法
连续密度梯度分离液 （Percoll液+PBS，离
一、白细胞的分离 （一）自然沉降法
加抗凝血于试管中
室温或37℃中静置 （30-60min）
分层
结果示意图
（二）高分子聚合物沉降法
抗凝血与等量3%明胶或 6%右旋糖酐溶液混匀
室温或37℃中静置 （30～60min）
分层结果与自然沉降法 类似
四、吞噬细胞的分离
•吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞 噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器 官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中 性粒细胞。 •分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。
（一）单核细胞的分离
• Percoll密度梯度分离法 • 流式细胞术分离法（常用方法） • 免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法
） • 黏附法
黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除 单核细胞。
（二）巨噬细胞的分离
• 斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞）
操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前 臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出 现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。
• 腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞）
优点：速度快、得率高 不足：白细胞黏性增加
二、外周血单个核细胞的分离
•外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）主要是指淋巴 细胞和单核细胞。 •PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群 •PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。
人外周血中各类血细胞密度
（二） Percoll分层液法
连续密度梯度分离液 （Percoll液+PBS，离
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同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数(cpm)， 即可计算出NK细胞毒活性。
·13·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
·14·
乳酸脱氢酶释放法
免疫学实验
靶细胞 NK YAC-1 杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH 释放到细胞外
无色底物
LDH底物 还 原
测OD570值
有色物质
实验值-自发释放值
杀伤率( %)= Max- S自发
×100
最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值
·2·
主要内容
❖实验分组及材料 ❖实验原理 ❖检测方法 ❖主要操作步骤 ❖结果判定
免疫学实验
·3·
实验分组及材料
免疫学实验
❖ 器材
1. 75%酒精
若干
2. 5ml注射器
1个/组
3. 100ml烧杯
1个/组
4. 无菌纱网
1块/组
5. 无菌平皿
1块/组
6. 无菌吸头（大、中、小）3盒/room
7. 无菌96孔培养板
❖同位素释放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR
❖乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用)
·11·
同位素释放法
免疫学实验
G0
G1
S
New DNA
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值 最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 ❖ 细胞计数：
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中， 混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀 后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
＋10%FBS 1640培养液
调细胞浓度
1×106/ml
加板(三复孔)
(加法见附图)
5%CO2 37℃培养 2小时
离心，取100ul上清移入新 孔， 37℃孵育10min
加入底物 100ul/well
室温避光孵育15min ·16·
实验步骤
免疫学实验
❖ 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡消毒2-3分钟。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有5ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网包裹住脾组织，将脾剪成小块，用5ml注射器塞轻压使脾细胞透过纱 网。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中， 再分别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离 心管中，剩余3ml培养液备用。
·5·
NK细胞功能：清除异常细胞
免疫学实验
❖通过杀伤激活受体（KAR）直接识别
❖通过抗体间接识别：ADCC
❖分泌杀伤介质： perforin granzyme
TNF IFN
❖清除异常细胞
❖（肿瘤、病原体感染）
免疫学实验
通过杀伤激活受体（KAR）直接识别
通过抗体间接识别：ADCC
免疫学实验
实验原理
❖NK细胞+靶细胞
免疫学实验
❖靶细胞破裂,释放内容物
❖胞浆内酶类 ❖LDH酶活性
❖胞浆内蛋白
❖放射性铬酸钠 ❖51Cr标记
❖DNA ❖3H-TdR掺入
NK细胞分离方法
❖密度梯度离心 ❖Ficoll 密度梯度离心 ❖Percoll密度梯度离心
❖磁化细胞分离器分离法
免疫学实验
·10·
Hale Waihona Puke 常用的检测方法免疫学实验
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不
能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至 培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中， 使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过 递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝 (INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在 570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细 胞毒活性。
2. 调脾细胞浓度至1×108/ml，每组所需总量为1ml 3. 调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml
免疫学实验
NK细胞毒检测
·1·
NK细胞活性检测
免疫学实验
❖自然杀伤细胞（NK）介导天然免疫应答，它不 依赖抗体和补体，即能直接杀伤靶细胞，如肿瘤细 胞或被病毒感染的细胞等；此外，尚有免疫调节功 能，也参与移植排斥反应和某些自身免疫病的发生 发展。 ❖NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感 染的指标之一。例如在血液系统肿瘤、实体瘤、免 疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性 减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。
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操作流程
无菌取脾
研磨成单细胞悬液+2ml 1640 （无FBS)
细胞计数 【?/ml】 混匀取后2取0u出l细2胞0u+l细98胞0u+l2的10W1u6l台40盼蓝
30l /孔 1mol/L柠檬酸
酶标仪测吸光度值： OD570nm
结果判定：
调细胞浓度
1×107 /ml
免疫学实验
培养YAC－1细胞
1. 小鼠 (NS,OVA)
1只/组
2. YAC-1
1*106 * 2ml
3. 培养液（DMEM) 无FCS 10ml/组
4. 培养液(DMEM)10%FCS
10ml/组
3. LDH底物
3ml/组
4. 柠檬酸（终止液） 1ml/组
·4·
原理
免疫学实验
➢ NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机 体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的 第三类群淋巴细胞。 ➢ NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既 不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 ➢YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染 的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的 杀伤活性。
1块/组
8. 无菌离心筒
1个/组
9. 可调微量加样器
1套/组
10. 细胞计数板
1套/组
11. 显微镜
1台/组
12. EP管
若干
13. 眼科剪、小镊子
1套/ 组
14. 细胞培养箱
1台/room
15. 酶标仪 16. 离心机
1台 2个/room
17. 超净台
1台/组
分组： 每组4人 1只小鼠
❖ 动物、细胞及试剂