植物多酚氧化酶、超氧化物歧化酶的测定
植物体内多酚氧化酶活性的测定
一、目的
通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。
二、原理
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。
用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。
反应式如下：
多酚氧化酶
邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O
三、材料、仪器及试剂
1. 材料：马铃薯块茎等
2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。
3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚；
20％三氯乙酸。
四、实验步骤
1. 粗酶液的制备
称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。
将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2. 活性酶的测定
在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。
五、酶活性的计算
以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。
A 酶提取液总量（ml）
酶活力（0.01A·min－1）＝———————×———————————
0.01×反应时间测定时酶液用量（ml）
A 酶提取液总量（ml）
酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)＝—————————×——————————
0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml）
公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。
植物超氧化物歧化酶活性测量
一、实验目的及要求
（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
二、实验原理
超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2. 大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，糖果组合组织或者细胞破碎后，可用Ph7.8的磷酸缓冲液提取。
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40秒-3分钟这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、实验材料、仪器设备及试剂
1、实验材料：大蒜
2、仪器：离心机
3、试剂：
(1)磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L）)(PH8.3 Tris-HCl )
（2）浓盐酸
(3)邻苯三酚（50mmol.L-1）：称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
(5) 考马斯蓝G-250：100mg 考马斯蓝G250溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%(W/V)正磷酸，用蒸馏水稀释至1L，过滤。
（6）牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 l）
四、实验方法
1、材料准备：每组30g大蒜，加入90 ml pH7.8 0.05 mol/L 磷酸缓冲液，匀
浆机匀浆，两层纱布过滤，冷冻离心（5000 rpm，20min）得清液测体积，取少量清液进行SOD活性测量。
2、将上清液置于60℃20min,使杂蛋白变性，然后5000r.min-1冷冻离心20min，取上清液测体积，并进行SOD活性测量。
3、SOD活性测定（邻苯三酚法）
采用改良的邻苯三酚自氧化法。
邻苯三酚自氧化速率为325 nm, 0.070D /min左右,以1 mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚的速率达到50%的酶量作为一个酶活力单位(U)。
（1）邻苯三酚自氧化速率的测定
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔1 min读取A 值,连续读取4 min ,取平均值。
通过微调连苯三酚的加入量控制自氧化速率在每分钟0.070±0.002。
（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
（2）SOD样液的活性测定
样品管取代自氧化管。
样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。
其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。
（3）计算
4、考马斯蓝G-250测蛋白含量：3ml 考马斯蓝加入适量的样品摇匀，2 min 后在595 nm测吸光值，并用牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 l）制标准曲线。
SOD比活力(units/mgPr)=总活力（units）/总蛋白量（mg）
（1）标准曲线制作：
分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。
然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm 处测定吸光值。
以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。
具体操作见下表。
蛋白质标准曲线测定加样
（2）蛋白样品
配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。
取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。
然后每支试管加入5.0ml 考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。
用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。
在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。
作业：
总活力U=活力单位×总体积
比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度
纯化倍数=纯化酶液中 SOD比活力/粗酶液中比活力（每步比活力除以第一步比活力）
SOD回收率=纯化酶液中 SOD活力单位 /粗酶液中 SOD活力单位（每步总活力除以第一步的总活力）
实验四十四植物体内过氧化物酶活性的测定
一、目的
过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。
故在科研上常加以测定。
二、原理
在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂
1.材料：植物叶片
2.仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。
3.试剂及配制：
0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。
反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。
四、实验步骤
1. 酶液提取
称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml
pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。
2.酶活性测定
吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。
五、酶活性计算
按下式计算酶的相对活性
△A470 ×酶提取液总量（ml）
酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ———————————————————
样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）。
植物中各种酶的提取测定
植物中各种酶的提取测定一、过氧化物酶的测定器具:分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器试剂：0.1mo1/L 过氧化氢; 0.1mo1/L磷酸缓冲液(pH7.0); 0.3%愈创木酚反应液: 100 mmo1/ L磷酸缓冲液(pH 7. 0) 100 ml于烧杯中，加入愈创木酚0.3ml，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解。
步骤:1.称取植物材料约0.2g，加入0.1mo1/L磷酸缓冲液(pH7.0) 6ml(分次加入[2ml, 2m1,2ml]最后用于洗研钵),在研钵中研磨成匀浆，过滤或以8000r/ min离心15min,上清液为酶的提取液。
2. 1ml0.3%愈创木酚反应液，加0.8ml磷酸缓仲液7.0,加2ml0. 1mo1/L过氧化氢，最后加酶液200ul (视酶活性大小而定，如酶浓度高可稀释后再测定)，摇匀，立即在分光光度计470nm下测吸光度，从加入酶液时立即开启秒表记录时间，1min 读数一次(也可2min，视材料而定)。
3.以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。
过氧化物酶活性(U)= △A470 X稀释倍数/Fw.min.0.01式中：△A470—吸光度的变化；Fw——植物鲜重/g二、淀粉酶的测定（核实方案与计算公式）1．酶液的提取：称玉米叶片0.5g，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入25mL刻度试管中，用水稀释至刻度，混匀后在温室下放置，每隔数分钟振荡一次，放置20分钟后离心，取上清液备用。
2．α－淀粉酶活性的测定：（1）取三支试管，编号注明1支为对照管，2支为测试管。
（2）于每管中各加入酶提取液1mL，在70℃恒温水浴中（水文的变化不应该超过±0.5℃），准确加热15分钟，在此期间β－淀粉酶受热钝化，取出后迅速在自来水中冷却。
（3）在试管中各加入1mLpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（4）向对照管中加入4mL0.4mol/LNaOH，摇动2－3分钟，静止2分钟，以钝化酶的活性，再加入1％淀粉2mL。
实验八、植物组织中超氧物歧化酶的提取及酶活性测定
酶活单位定义： 每毫克鲜重在1ml反应液中SOD抑制率达50% 时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。
六、注意事项
冰上充分碾磨，使细胞壁破碎
七、思考题
1、在SOD测定中为什么设暗中和照光两个对 照管？ 2、影响本实验准确性的主要因素是什么？应 如何克服？
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被
还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生
O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在
560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑
制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液
蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT） 在光照下的还原作用来确定酶活性大小。
四、 实验步骤
2.SOD酶活力的测定
取10mL试管4支，2支为测定管，另2支为对 照管，按表1加入各溶液。
表1
各溶液加入量
用量(ml) 3 2.4
试 剂（酶） 0.05mol/L磷酸缓冲液 NBT反应液
酶液（实验管）/缓冲液（对照管） 0.1 蒸馏水 总体积 0.4 6.0
混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双 层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于 4000lx日光灯下反应10min(要求各管照光 情况一致，反应温度控制在25～35℃之间， 使酶活性高低适当调整反应时间)。
四、 实验步骤
1. SOD酶的粗提 取新鲜植物叶片，冲洗干净，吸干表面水 分，去掉叶脉，称取1.0~2.0g于预冷的研钵 中， 加入1ml预冷的0.05mol／L磷酸缓冲液 (pH7.8) ，进行组织细胞破碎，使SOD充分 溶解到缓冲液中，然后加缓冲液使终体积 为5ml，在5000r／min下离心15min，得到 的上清液为粗酶液。
植物生理学实验
口试部分实验一多酚氧化酶（PPO）活性的测定实验原理：多酚氧化酶是植物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端氧化酶。
他可以把酚类物质如单酚、邻苯二酚、邻苯三酚、对苯二酚等氧化为氧化为相应的醌类物质。
醌类物质对病原微生物起抑制作用或杀伤作用，具有一定的抗病能力。
因此，在感病的植物体中，PPO 活性都具有不同程度的提高，以抵抗病原体进一步侵染健康的植物组织。
此外，PPO对食品和饮料生产也会产生重大影响，它影响其品质，特别是在制作绿茶、红茶、烤烟和水果类饮料的过程中更为突出。
所以，准确测定PPO活性，具有重要的生理和现实意义。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使酚氧化产生醌，PPO反应在3分钟内呈直线上升，其后反应速度变慢，因而在研究时，用分光光度在3分钟内于410纳米波长下测其吸光度，即可计算出PPO的活力和比活力。
思考题：1、粗酶液提取中丙酮和磷酸缓冲液的作用，提取液为什么要预冷：丙酮是有机溶剂，能提取PPO，磷酸缓冲液为了保持酶活性，预冷降低酶活。
2、为什么要先在37度下恒温，再加酶液：使酶和底物处于最适状态。
实验二硝酸还原酶（NR）活性的测定实验原理：硝酸还原酶是植物氮代谢中的关键酶，植物吸收的硝酸根，首先通过硝酸还原酶的催化，还原成亚硝酸根（NADPH+NO3-NR-NO2+NAD+H2O)。
亚硝酸根可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸发生重氮反应，生成的重氮化合物又与盐酸萘乙胺生成红色偶氮化合物，可在520纳米下比色测定。
思考题1、为什么标准液与样品液的测定要在同一条件下：亚硝酸的磺胺比色法显色速度受温度和酸度等因素影响。
2、NR活性测定时取材为什么要进行一段时间的光和作用：进行光合作用积累一定糖类，否则酶活偏低。
3、测量酶活是为什么要在暗处：光下光反应会将形成的亚硝酸根转变成铵根，影响结果。
4、如果实验材料酶活过低怎么办：可在取样的前几天，用50mmol/l硝酸钾加在培养液中，以诱导硝酸还原酶的生成。
植物生理指标测定的实验方法简介
1. 材料与方法1.1 材料处理生菜，选取整齐、质地脆嫩、颜色翠绿或深绿，且无腐烂、无虫食的作为实验试材。
适当剥去外部一些受损苞叶，使其大小整齐一致，将生菜用0.02%次氯酸钠浸泡3min,晾干水分后，五棵作为一个实验组，用塑料袋包装，分别在-4℃，0℃，4℃以及室温下贮藏。
每隔2d 测定一次贮藏生菜的生理指标，贮藏期间相对湿度为70%。
1.2实验使用的化学试剂碳酸钙粉（石英砂），80%的丙酮；1mg.ml -1葡萄糖标准液，3，5-二硝基水杨酸试剂；去离子水；0.6%的硫代巴比妥蒜（TBA ），10%的三氯乙酸（TCA ）;0.2mol/L PH=7.0的磷酸缓冲液,0.1mol/L H 202溶液; 0.05mol/L PH=7.8磷酸缓冲液, 提取介质（0.05mol/L PH=7.8磷酸缓冲液，内含质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮）,130mmol/LMet 溶液, 750umo1/L NBT 溶液, 100umol/L EDTA 溶液，20umo1/L 核黄素，蒸馏水；质量分数2% H 202溶液，pH5.5磷酸缓冲液，0.05mol/L 愈创木酚，20%的三氯乙酸（TCA ）；pH5.5磷酸缓冲液，20%的三氯乙酸（TCA ）, PVP ，0.1mol/L 儿茶酚；1.3实验的仪器设备天平，分光光度计，水浴锅，离心机，研钵，打孔器，烧杯，容量瓶，移液管，试管，漏斗，滤纸，光照箱，培养箱，冰箱，电导仪，1.4实验方法1.4.1失重率采用差量法计算。
失重率（%）=(入贮前重量一贮藏后重量)/入贮前重量×100%1.4.2叶绿素含量叶绿素含量的测定采用分光光度比色法[1]。
取0.5g 生菜叶片研磨，加少量的碳酸钙粉及80%丙酮进行研磨，匀浆过滤后用80%的丙酮定容至15ml ，以80%的丙酮作对照，在分光光度计上测定665nm,649nm, 470nm 处的光密度值。
以Amon 法公式计算叶绿素的含量。
酶活测定方法
二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。
二、基本原理多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醍类化合物，醍类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。
在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。
多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。
因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。
三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、苹果、马铃薯等。
（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（lOOmL、1000 mL）。
（三）试剂1.100 mmol/L、pH 5. 5 醋酸缓冲液母液A （200 mmol/L醋酸溶液）:量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馅水稀释至1 000 mLo母液B （200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27. 2 g三水合乙酸钠），用蒸馅水溶解、定容至1 000 mLo取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5. 5 ,加蒸/留水稀释至1 000 mL o2.提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP 和1% Triton X-100）称取340 mg PEG 6000 （聚乙二醇6000）、4 g PVPP （聚乙烯毗咯烷酮，Polyvinyl - polypyrrolidone ）,取1 mL Triton X-100 ,用100 mmol/L > pH 5.5 醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mLo3.50 mmol/L 邻苯二酚称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5. 5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mLo四、实验步骤（-）酶液制备称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4°C、12 000Xg离心30 min,收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。
实验四 超氧化物歧化酶测定
高级植物生理实验报告植物抗性生理农学院农药学东保柱20132020542013年12月27日实验1 超氧化物歧化酶（SOD ）活性和丙二醛含量的测定（操作步骤）1 试剂配制1.1 磷酸缓冲液 (PBS) 配制注：配成PBS2000ml ，其中1000ml 用于A 液配制，另1000ml 用于酶液制备。
1.2 其它溶液配制2 酶液制备称取植物材料１g ，加少许0.05mol/L 、pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨，最终定容制得10 ml 匀浆。
转移至10ml 离心试管中，在3000 rpm 下粗离心１分钟，粗提液再转移至2个5ml 离心管中，在冷冻离心机13000g 、４℃下离心20分钟，上清液即为酶液，用于SOD 活性和丙二醛含量的测定。
3 丙二醛含量测定吸取酶液２ml →加入Ｆ液２ml →沸水浴加热15分钟(呈粉红色)→快速冷却→4000rpm 下离心５分钟。
若以种子为材料，则加热后溶液混浊，需增加离心力。
以Ｆ液为参比液，分别在532nm 和600nm 处测定光密度值。
丙二醛含量（nmol ·g -1）＝式中：V/v --- 提取液总量(10ml)／测定液用量(2ml)R --- 反应液总量(４ml)Ｗ --- 植物材料鲜重或干重(g)0.155 --- 丙二醛的摩尔浓度消光系数(当[MDA]=1nmol/ml 时,OD 532-OD 600=0.155)[即( OD532—OD600) / 0.155的单位为1nmolMDA / ml ]室温下处理的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值室温下丙二醛含量（nmol·g-1）=-0.0022+0.039/0.155×4×10/2×1=4.75 nmol·g-1 冷处理下的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值冷处理下丙二醛含量（nmol·g-1）=0.077-0.026/0.155×4×10/2×1=6.58 nmol·g-14 超氧化物歧化酶活性测定4.1 操作及说明* 仪器调零液中的“酶液”0.1ml，可以取对照植株的，也可以取胁迫植株的。
多酚氧化酶的实验报告
1. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及方法。
2. 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的操作技术。
3. 通过实验，分析影响多酚氧化酶活性的因素。
二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。
在适宜的条件下，PPO催化酚类物质氧化形成醌类物质，使植物组织发生褐变。
本实验采用分光光度法测定多酚氧化酶活性，以邻苯二酚为底物，通过测定反应过程中吸光度的变化来计算酶活性。
三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜马铃薯、0.1mol/L邻苯二酚溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、NaF溶液、5%三氯乙酸溶液、硫脲、0.01mol/L间苯二酚、蒸馏水。
2. 仪器：分光光度计、匀浆机、离心机、恒温水浴、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 酶液的制备：取新鲜马铃薯150g，洗净后切块，加入150mL NaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。
取滤液50mL，于3500r/min离心5-10min，取上清液。
2. 酶活性测定：取3支试管，分别编号为A、B、C。
向A、B、C三管中加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL、pH6.8磷酸盐缓冲液2mL，向A、B管中加入酶液0.5mL，C管不加。
将三管置于恒温水浴中，在反应时间分别为0、10、20、30、40、50min时，取出A、B、C三管，分别加入5%三氯乙酸溶液1mL，摇匀后于410nm波长处测定吸光度。
3. 数据处理：以邻苯二酚为标准曲线，计算酶活性。
五、结果与分析1. 标准曲线的绘制：以邻苯二酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 酶活性计算：根据标准曲线，计算不同反应时间下的酶活性。
3. 影响酶活性的因素分析：通过实验，分析温度、pH、底物浓度、酶浓度等对酶活性的影响。
1. 成功掌握了分光光度法测定多酚氧化酶活性的原理及操作技术。
2. 通过实验，分析了影响多酚氧化酶活性的因素，为后续研究提供了依据。
七、实验讨论1. 在实验过程中，发现温度对酶活性有显著影响。
仁用杏树多酚氧化酶和超氧化物歧化酶的研究
仁 用 杏 树是 指 以 取 杏 仁 为 目的 的杏 树 。 仁 经 济 价 值 高 ， 而 仁 用 杏 的种 植 是 贫 困 山 区 人 杏 因 民群 众 脱 贫 致 富 的 途 径 之 一 ； 仁用 杏 具 有 适 应 性 强 、 逆 性 强 、 干 旱 的特 点 ， 时 又 是 绿 化 和 抗 耐 同 荒 山 造 林 的 良好 树 种 ， 年来 ， 用 杏 树 的造 林 规 模 有 不 断 扩 大 的趋 势 。本 文 通 过 对 仁 用 杏 树 近 仁
２０ ０ １年 ２月 开始 至 １ １月 结 束 。 样 分 别 取 其 叶 、 、 干 、 根 和 侧 根 ， 个 样 ３个 重 复 。 试 试 枝 树 主 每 从
验 地 取 回苗 木 ， 蒸 馏 水 清 洗 干 净 后 ， 即 分 析 酶 活 性 。 用 立
１ ２ 多 酚 氧 化 酶 活 性 测 定 ．
维普资讯
第 ２期 ２０ ０ ２年 ６月
山 西 林 业 科 技
ＳＨ Ａ Ｎ Ｘ Ｉ Ｆ（ ＲＥＳＴ ＲＹ ） ＳＣＩ Ｎ ＣＥ Ａ Ｎ Ｄ ＥＣＨ Ｎ Ｏ ＩＯ Ｇ Ｙ Ｅ Ｔ
文 章 编 号 ：０ ７７ ６ ２ ０ ） ２０ ３ ４ １ ０ — ２ Ｘ（ ０ ２ ０ — ０ ８ ０
液 充 分 混 合 均 匀 ， 加 人 ０ 】ｍｌ ０ ２ ｍｏ／ 核 黄 素 溶 液 ， 匀 ， 试 管 放 在 荧 光 灯 下 ． 强 再 ． ． ８ ｌＩ 摇 将 光 ３ ０ ｘ光 照 １ ｎ后 ． 出 试 管 在 ７ ２型 分 光 光 度 计 ５ ０ｎ 波 长 处 测 其 吸 光 度 。以未 加 酶 ０ ０Ｌ ｍｉ ０ 取 ２ ６ ｍ
作者 简介 ： 刘金 龙 （９ｏ １ ７
多酚氧化酶实验报告
一、实验目的1. 理解多酚氧化酶（PPO）在植物组织中的作用及其活性测定的原理。
2. 掌握分光光度法测定PPO活性的操作技术。
3. 分析不同条件下PPO活性的变化，如pH值、温度等。
二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。
它能够催化酚类物质与氧气反应生成醌类物质，进而引起植物组织的褐变。
本实验采用分光光度法测定PPO的活性，通过测量反应体系在特定波长下的吸光度变化来反映酶的活性。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：马铃薯、茶叶、茶叶提取物等。
2. 试剂：0.03M磷酸缓冲液（pH 6.0）、0.01mol/L邻苯二酚溶液、5%三氯乙酸溶液、0.01mol/L的间苯二酚溶液、0.01mol/L的NaF溶液、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、硫脲等。
四、实验步骤1. 酶提取：取一定量的马铃薯或茶叶，加入适量磷酸缓冲液（pH 6.0），用匀浆机充分匀浆，过滤，收集滤液。
2. 酶活性测定：取适量酶液，加入0.01mol/L邻苯二酚溶液，在410nm波长下测定吸光度。
3. 酶活性计算：根据吸光度变化计算酶活性，公式如下：\[ 酶活性 = \frac{ΔA}{Δt} \times V_{底物} \]其中，ΔA为吸光度变化，Δt为反应时间，V_{底物}为底物体积。
4. 影响因素实验：分别考察pH值、温度、底物浓度等因素对PPO活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活性测定：通过分光光度法测定，得到不同样品的酶活性数据，如表1所示。
表1 不同样品的酶活性| 样品 | 酶活性（U/mg） || -------- | -------------- || 马铃薯 | 1.23 || 茶叶 | 0.98 || 茶叶提取物 | 1.57 |从表1可以看出，茶叶提取物的酶活性最高，马铃薯次之，茶叶最低。
2. 影响因素实验：（1）pH值：在pH 4.0～7.0范围内，PPO活性随pH值升高而增加，在pH 6.0时达到最大值，随后逐渐下降。
植物酶活性实验方案
植物酶活性测定方案植物酶测定的项目有：植物羟化酶（RUBP）、植物多酚氧化酶（PPO）、植物乳酸脱氢酶（LDH）、植物厌氧多肽（ANPs）、植物厌氧代谢蛋白（ANP）、植物过氧化氢酶（CAT）、植物过氧化物酶（POD）、植物超氧化物歧化酶（SOD）、植物以纯脱氢酶（ADH）、植物脱落酸（ABA）、植物ATP酶。
一、实验前准备工作：1、实验开始前一天把离心管、枪头灭菌（灭菌锅温度122-123℃时间为20分钟）。
2、冷冻研钵和研锤（至少冷冻一天）。
3、由于样品较多把离心管编号以防混淆。
4、配制PBS缓冲液：母液的配制：0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml水中0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水中。
各种浓度PB(pH=7.4)的配制：先配0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L 的NaH2PO4，81ml 0.2mol/L 的Na2HPO4, 即可。
然后只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，0.1M PB（PH=7.4）：取500ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml 即可。
二实验步骤：1、植物组织匀浆的制备：将植物组织与PBS缓冲液制成1:9（植物组织用克、匀浆用毫升计算）制成10％匀浆，12000转离心十分钟。
取上清液放入冰箱2℃保存（最多保存48小时，不然多试验有影响）。
注：研磨时可加少许石英砂。
2、剩下实验按照试剂盒里的实验说明书进行操作：酶标包被板的第一横排为十个标准孔和一个空白孔，从第二排开始为待测样品孔（每个样品至少有三个重复）。
3、由于各个项目测定中都有温育、显色等步骤需要等很长时间，所以最好两三个项目同时进行比较快。
4、植物羟化酶（RUBP）、植物脱落酸（ABA）需要把离心好的10％植物匀浆再用PBS缓冲液稀释10倍。