第五届 生物化学实验技能大赛实验报告

第五届生物化学实验技能大赛实验报告制备蝇蛹壳聚糖工艺改良及其理化性质研究Improved Technology of Extract Chitosan from the Pupa and Study the Physical Chemistry Character制备蝇蛹壳聚糖工艺改良及其理化性质研究郭诗静，金昂丹，梁剑云华南农业大学 生命科学学院（注：按姓名字母排序，不分先后）摘要：利用蝇蛹作为实验原料,通过改良后的酸法脱灰分,碱法脱蛋白质和脂肪制成甲壳素后,通过热浓碱法脱乙酰基处理提取壳聚糖。

改良的工艺缩短了加工的时间，但是也保证了质量。

提取过程中分别使用室温、加热、超声波三种不同的方法脱蛋白,脱色方法也一改以往用有机溶剂的方法，改用双氧水；干燥恒重法测定其水分,旋转黏度计测定其黏度,通过对成品进行这些理化性质的检测。

实验得沸水的处理效果最好,超声细胞粉碎机对提取有一定点作用,双氧水的脱色效果不错,可以进行进一步研究和推广。

关键词：蝇蛹 甲壳素 壳聚糖 水分 黏度 脱乙酰度目录1 前言 (04)1.1 甲壳素与壳聚糖及其研究状况 (04)1.2 家蝇与提取工艺 (05)1.3 超声波 (05)2 可行性分析 (06)3 实验目的 (06)4 实验原理 (06)5 实验设备 (07)5.1 仪器 (07)5.2 玻璃器具 (07)6 实验材料及试剂 (07)6.1 原材料 (07)6.2 试剂 (08)6.3 试剂的配制 (08)6.4 材料的处理 (08)7 本实验的制作流程 (11)8 制作工艺比较 (15)9 各种理化性质方法比较 (15)9.1 用干燥恒重法测定其水分 (15)9.2 用旋转黏度计测定其黏度 (16)9.3 用酸碱滴定法测定游离氨基和脱乙酰度 (17)10 结论 (18)11 注意事项 (18)12 优点 (18)参考文献 (19)英文摘要 (20)附录 (21)感想 (22)1前言1.1 甲壳素(chitin)与壳聚糖(chitosan) 及其研究状况壳聚糖(chitosan)在自然界中通常以甲壳素(chitin)的形式存在。

甲壳素又名几丁质，是一种天然高分子化合物，属于碳水化合物中的多糖。

几丁质脱去分子中55%以上的乙酰基就转变成壳聚糖，甲壳素广泛存在于蟹壳、虾壳和节肢动物。

壳聚糖又名甲壳胺、脱乙酰甲壳素，化学名称为(1,4)-2-氨基-2-2-脱氧-β-D-葡萄糖。

壳聚糖是白色或淡黄色半透明状固体，略有珍珠光泽，可溶于大多数稀酸如盐酸、醋酸、苯甲酸等溶液，且溶于酸后，分子中氨基可与质子相结合而使自身带正电荷。

但壳聚糖不溶于水和碱溶液，也不溶于硫酸和磷酸。

在稀酸中，壳聚糖的主链也会缓慢水解，溶液的黏度逐渐降低[6]。

甲壳素(chitin)是存在于自然界中唯一一种带阳离子，能生物降解高分子的材料，广泛存在于昆虫和甲壳类动物的硬壳和真菌的细胞壁中，是地球上蕴藏量最丰富的有机物之一。

也由于它可以与人体中的有害物质相结合，并能排出人体体外，使人体经常处于一种健康的生理状态，因而被誉为“人类第六生命元素”[1]。

但甲壳素溶解性能很差，直接使用的范围比较窄，而其脱乙酰产物—壳聚糖(chitosan)则广为应用，其主要质量指标是黏度及胺基含量。

壳聚糖经水解可生成壳低聚糖，壳低聚糖具有较高溶解度，所以很容易被吸收利用。

分子量低于一万的壳低聚糖更展现出其独特的优良生理活性和功能性质，可在人体肠道内活化增殖双歧杆菌，提高巨噬细胞吞噬能力，促进脾脏抗体生长，抑制肿瘤细胞生长，降低血压、血糖、血脂，吸附胆固醇，在微环境中具有较强抑菌抗菌作用和显著保湿吸湿能力等；较高聚合度壳低聚糖具有阻碍病原菌生长繁殖功能，能促进蛋白质合成，活化植物细胞，从而促进植物快速生长等[2]。

同时，已经有不少的实例：纯度很高的甲壳素可制成手术缝合线，经酶解后可被人体吸收，可生产手术隔离膜；可用来制造人造皮肤，作为创伤的覆盖材料，由壳聚糖制成的隐性眼镜不但柔软，坚韧，而且吸水性好[1]。

壳聚糖在环保、医药、食品，农业，日化等方面都有很强的应用前景，所以壳聚糖的产业化方向应该是一个比较重要的问题。

1963年，Budall根据X-衍射光谱得到的结果，提出了甲壳素存在三种晶型后，甲壳素和壳聚糖的研究逐渐增多，20世纪50年代后已有专著出版。

自1977年在美国波士顿召开首次甲壳素和壳聚糖的国际学术讨论会以来，国际社会已先后召开过9 届国际甲壳素和壳聚糖学术会议，出版了数本关于甲壳素和壳聚糖的专著。

一些发达国家争相投入大量资金对甲壳素和壳聚糖进行深入研究开发。

日本政府拨出60亿日元启动经费，委托全国13 所大学对甲壳素和壳聚糖进行系统研究开发，且在基础研究及应用开发方面已取得巨大成就。

我国早在20 世纪50 年代就对甲壳素和壳聚糖的制备及其应用进行了研究。

1958年，国内首先将乙酰化甲壳素应用于印染工业。

谢雅明和严峻分别于1983年和1984年发表有关甲壳素化学的相关文章以来，甲壳素和壳聚糖的研究开始活跃起来。

目前世界甲壳素年产量仅为5000-10000吨，国际市场上每吨销售价约1700万美元[10]，我国随着生产的发展，从事制取甲壳质生产既可减少废弃物对环境污染又是企业和养殖专业户一条新的致富之路。

1.2 家蝇与提取工艺苍蝇，是人们惯用的称呼，为科研而饲养的苍蝇只是蝇家族的一种，学名为“家蝇”。

苍蝇属节肢动物门昆虫纲双翅目,世界各地分布广泛, 苍蝇在长期恶劣环境的生态压力下，通过产生抗菌物质如溶菌酶、抗菌肤、凝集素、甲壳质等产生了特有的抗逆能力。

饲养的时候经过严格的无菌控制，与日常见到的家蝇不同的是它不带有任何的病菌，被称为“工程蝇”或“资源蝇”。

而蝇蛹是苍蝇的幼虫羽化后的外壳,从蝇蛹可提取人类所需要的抗菌肽、甲壳素、壳聚糖等有用物质。

自然界每年生物合成的甲壳素有数 10 亿吨之多，所以甲壳素是一种十分丰富的自然资源。

一般工艺在以往壳聚糖制备工艺研究中，大多数以虾、蟹为原料，同时已经出现以微生物发酵提取[4]和以蝇蛹为原料提取。

以虾、蟹壳原料的供应受到地域和季节的影响，而且虾、蟹壳含钙量高，给提取造成困难。

而以蝇蛹为原料制备壳聚糖甚少。

虾壳中含量为20%～25%，蟹壳中含量为 15%～18%[4]，甲壳素的提取量为4%，壳聚糖的提取量为3%[10]，生产原料呈现相对不足和价格不稳定的状态，而且从虾、蟹壳提取的甲壳素容易遭受海水污染以及甲壳素、壳聚糖容易吸附重金属，因此很难生产出高纯度的产品[3]。

另一方面，以微生物发酵生产壳聚糖，从经济角度讲，培养菌丝体要求高、控制严格，造成提取的壳聚糖成本过高。

抗生素厂、柠檬酸厂发酵后的废菌丝体（国内仅废弃青霉菌丝体每年就多达几十万吨）含水量高达85％，在高温条件下发酵产生难闻的气味，长期贮存菌体自溶产生大量污水，造成严重的环境污染[4]。

但是如果选择家蝇进行科学的研究，有其主要的优点：家蝇的繁殖系数高，一对家蝇能产卵1000个左右，4个月可生产2660亿，原料取之不尽，生活周期一般是7天左右就变成蛆，而且家蝇无休眠现象，可在室内大批量饲养，养殖成本低，蝇蛹（蛆）碳酸含量低，色素少，所以成本低廉，工艺简单，来源容易，容易保存，价格稳定，杂质少，纯度高，提取过程中对水、酸、碱消耗少；重金属含量低；提取得甲壳素的分子量较虾、蟹的分子量小，溶解性提高，应用范围相应扩大。

在加工工艺来说，比较简单，而且在不断的改良，而且处理用过的废碱液可以重新利用，已有实验证明其效果同样的显著，不会对环境造成很大的污染和资源的浪费[5]。

1.3 超声波超声波是物质介质中的一种机械波。

超声波的生物学效应一般包括空化效应和热效应。

声化学反应主要源于声空化——液体中空腔的形成、振荡、生长、收缩至崩溃，及其引发的物理、化学变化。

液体声空化的过程是集中声场能量并迅速释放的过程。

空化泡崩溃时极短时间在空化泡周围的极小空间内产生高温高压，并伴有强烈的冲击波和高速射流，这为一般条件难以实现或不可能实现的化学反应提供了一种新的非常特殊的物理环境，从而促使化学反应的进行[13]。

超声波的应用日渐广泛[14]，对于实现工业化，如果能充分发挥其用处，将会有这重要的影响。

一般来说，超声波不会破坏分子的内部结构使化学键断裂，但是可以增加分子的振动速率或者改变分子的构型，使其在反应的时候出现更为适合反应进行的构象，推理是有助于反应的进行的，有探索价值。

本实验以蝇蛹为原料，采用稍加改进的酸、碱等提取工艺同时也采用超声处理的条件提取维持天然特征的的壳聚糖，并对其理化性质进行了研究，从而讨论工艺的好与坏。

2可行性分析壳聚糖和甲壳素应用的广泛性，决定了壳聚糖生产工艺的实用性；原料来源容易解决而且比较低廉，有专门饲养的公司并已经联系好；加工工艺简单，试剂只需要碱和酸，仪器设备实验室已经齐备，玻璃器皿也为实验室常用器皿；使用过的废酸废碱可以循环利用，若不再使用，则进行中和反应便可以避免环境污染的问题；改良过的工艺，理论上具备速度和质量两方面的优点，（实际上也还没有找到资料有人尝试过），所以这次的实操是比较有意义的；本次实验还准备尝试用超声的方法处理材料，如果有效果，理论上可以及降低加工的时间，所以具有一定创新性；经过原材料的预处理，当天比赛操作的时间完全充足；操作安全，不会造成危险。

3 实验目的通过蝇蛹提取出甲壳素，再经脱乙酰反应将甲壳素转化为壳聚糖，最后对壳聚糖灰分、水分、脱乙酰度以及黏度进行分析，从而说明蝇蛹含有甲壳素和壳聚糖，且含量及质量都较为理想，改进了加工工艺为工业化大规模生产提供理论基础4.实验原理甲壳素是一种天然高分子聚合物，通过β-D-(1-4)糖苷连接的2一乙酸胺基一2一脱氧-D-吡喃葡糖链节的线型聚合物，其结构如下:甲壳素有α，β，γ三种晶型，其中α-甲壳素存在最丰富，也最稳定。

由于大分子之间极强的氢键作用，导致其一般不溶于水，但化学性质非常稳定，因而应用有限，通常称其为几丁质。

要获取甲壳素可以通过酸碱处理，脱去材料中的钙盐(俗称“灰分”)和蛋白质（和脂类）即可制得甲壳素。

壳聚糖又称脱乙酞甲壳素，一种阳离子型直链氨基多糖，学名聚(1—4)一2氨基脱氧一B—D一葡萄糖，结构式如下：壳聚糖的脱乙酰度是壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分数，也就是壳聚糖分子链上自由氨基的含量，是一项重要的技术指标之一。

从蝇蛹甲壳素提取的壳聚糖灰分和水分比从虾蟹提取的要低，从而更有利于保存，而且纯度增高。

壳聚糖可溶于大多数稀酸，如盐酸、乙酸、乳酸、苯甲酸、甲酸等酸溶液中，所以能用乙酸将其溶解。

测定的方法很多，如酸碱滴定法、苦味酸法、胶体滴定法、银量滴定法、电位滴定法等。

本实验采用最简单的酸碱滴定法，该法不需特殊的仪器，且重复性好。