目的基因导入受体细胞及重组子的筛选
高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
生物技术概论复习问答题
基因工程，又叫基因拼接技术或DNA重组技术，是指按照人们意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造后放入另一种生物，改造其遗传物质，在较短时间内改变现有物种的性能，创造出更符合人们需求的新生物类型。
•基因工程操作步骤：目的基因的获取•构建克隆载体•形成重组DNA分子，导入受体细胞•筛选含有目的基因的受体细胞，对目的基因进行检测和鉴定1.什么样的细胞可以作为受体细胞？（原核细胞、真核细胞、动植物受体细胞）2.目的基因导入受体细胞有哪些方法？外源DNA转化法1.化合物诱导转化法2.根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法3.电穿孔转化法4.微弹轰击转化法5.激光微束穿孔转化法6.超声波处理转化法7.脂质体介导转化法8.体内注射转化法9.花粉管通道转化法10.精子介导法11.低能离子束介导转化法噬菌体颗粒转导法3.筛选重组子有哪些方法？根据载体标记基因筛选转化子1.根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子2.根据载体除草剂抗性基因和相应的选择药物筛选转化子3.根据lacZ’基因互补显色试剂筛选转化子4.根据生长调节剂非依赖型筛选转化子5.根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补试剂筛选转化子4. 蓝白斑筛选的原理是什么？限制性内切酶分别以交错切和平切的方式切割DNA双链，产生几种末端型DNA分子1.植物细胞培养的理论基础包括哪些？细胞全能性，脱分化，再分化。
植物体每个正常细胞都含有该植物的全部遗传信息，在适宜的条件下能发育成完整的植株2.什么是愈伤组织？愈伤组织是原指植物体的局部受到创伤刺激后在伤口表面新生的组织，有活的薄壁细胞组成，可起源于植物体，任何器官内各种组织的活细胞。
3.植物组织培养的基本流程先从植物中取道外植体，外植体经过脱分化形成愈伤组织，然后由愈伤组织进行再分化，把它变成胚状体，然后继续培养，让这个胚状体，慢慢长成整个的植物。
4.细胞融合体现了何种生物学原理？细胞膜具有流动性5.细胞融合首先要解决什么问题，有哪些方法？细胞壁，6.体外培养动物细胞需要提供哪些物质，需要怎么样的环境条件？7.比较植物细胞培养与动物细胞培养的异同，内容包括原理，培养基成分，培养结果，培养目的等。
目的基因导入受体细胞
（6）利用遗传选择标记筛 选哺乳动物转基因细胞
• 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移 酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基 因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。
• 常用的标记基因还有： • -- 胸腺核苷激酶基因（tk）、 • -- 二氢叶酸还原酶基因（dhfr） • -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因
斑点杂交法
狭缝式点样器
斑点及狭缝印迹杂交的特点
1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量
4、菌落（或噬菌斑）原位杂交
基本原理 直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上 溶菌、变性 DNA暴露并于滤膜原位结合
第六章 目的基因导入受体细胞
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程 中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必 须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选 出期待的克隆子。
• 概念
–克隆子 –转化子 –重组子
将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的 受体细胞统称为克隆子。
把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化 子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为 转化子 ），现在这两者有通用的趋向。
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组 子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组 子。
经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得 所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
一、遗传表型直接筛选法
• （一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分 子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细 胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。
基因工程原理题库-名词解释
基因工程原理题库-名称解释1.基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
2.假基因：一种类似于基因序列，其核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成功能蛋白的失活基因。
3.重叠基因: 是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列为两个或两个以上基因的组成部分。
4.结构基因：指受调控的编码特定生物合成和代谢过程中的酶/蛋白质的基因。
5.调节基因(regulator gene): 是编码合成那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质的特异DNA序列。
6.基因家族：真核生物基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因，可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。
7.基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。
8.基因组：该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。
9.基因工程：是指在分子水平上，根据分子生物学和遗传学原理，在体外将一个生物体中有用的目的DNA(或基因)核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。
使后者获得所需的新遗传性状或表达所需产物，最终实现该技术的商业价值。
10.操纵子：是原核生物中一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。
11.mRNA (messenger RNA)：由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息并指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。
12.启动子：在DNA 转录起始时RNA聚合酶识别并与其结合的一段DNA 片段，一般不编码蛋白，具有与RNA 聚合酶结合位点，并引导转录的起始。
13.增强子：位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列。
它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
基因工程作业(引物设计)讲解
口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）一、选择原因及应用口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）在蛋白和mRNA的表达水平，揭示其与口腔鳞癌（OSCC）发生、发展的关系。
方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl 基因的表达水平，并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。
结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜（P 〈0．05），口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜（P〈0．01），MTA1蛋白和MTA1mRNA表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。
结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用，有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。
二、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1), mRNANCBI Reference Sequence: XM_004055801.1FASTA GraphicsLOCUS XM_004055801 2872 bp mRNA linear PRI 03-DEC-2012DEFINITION PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1),mRNA.ACCESSION XM_004055801VERSION XM_004055801.1 GI:426378238KEYWORDS .SOURCE Gorilla gorilla gorilla (western lowland gorilla) ORGANISM Gorilla gorilla gorillaEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;Catarrhini; Hominidae; Gorilla.COMMENT MODEL REFSEQ: This record is predicted by automated computationalanalysis. This record is derived from a genomic sequence(NW_004005914) annotated using gene prediction method: GNOMON,supported by mRNA and EST evidence.Also see:Documentation of NCBI's Annotation Process##Genome-Annotation-Data-START##Annotation Provider :: NCBIAnnotation Status :: Full annotationAnnotation Version :: Gorilla gorilla Annotation Release 100Annotation Pipeline :: NCBI eukaryotic genome annotation pipelineAnnotation Method :: Best-placed RefSeq; Gnomon Features Annotated :: Gene; mRNA; CDS; ncRNA##Genome-Annotation-Data-END##FEATURES Location/Qualifierssource 1..2872/organism="Gorilla gorilla gorilla"/mol_type="mRNA"/sub_species="gorilla"/db_xref="taxon:9595"/chromosome="14"gene 1..2872/gene="MTA1"/note="Derived by automated computational analysis usinggene prediction method: GNOMON. Supporting evidence/codon_start=1/product="metastasis-associated protein MTA1"/protein_id="XP_004055849.1"/db_xref="GI:426378239"/db_xref="GeneID:101134898"/translation="MAANMYRVGDYVYFENSSSNPYLIRRIEELNKTANGNVEAKVVC FYRRRDISSTLIALADKHATLSVCYKAGPGADNGEEGEIEEEMENPEMVDLPEKLKHQ LRHRELFLSRQLESLPATHIRGKCSVTLLNETESLKSYLEREDFFFYSLVYDPQQKTL LADKGEIRVGNRYQADITDLLKEGEEDGRDQSKLETKVWEAHNPLTDKQIDQFLVVAR SVGTFARALDCSSSVRQPSLHMSAAAASRDITLFHAMDTLHKNIYDISKAISALVPQG GPVLCRDEMEEWSASEANLFEEALEKYGKDFTDIQQDFLPWKSLTSIIEYYYMWKTTD RYVQQKRLKAAEAESKLKQVYIPNYNKPNPNQISVNNVKAGVVNGTGAPGQSPGAGRA CESCYTTQSYQWYSWGPPNMQCRLCASCWTYWKKYGGLKMPTRLDGERPGPNRSNMSP HGLPARSSGSPKFAMKTRQAFYLHTTKLTRIARRLCREILRPWHAARHPYLPINSAAI KAECTARLPEASQSPLVLKQAVRKPLEAVLRYLETHPRPPKPDPVKSVSSVLSSLTPA KVAPVINNGSPTILGKRSYEQHNGVDGNMKKRLLMPSRGLANHGQTRHMGPSRNLLLN GKSYPTKVRLIRGGSLPPVKRRRMNWIDAPDDVFYMATEETRKIRKLLSSSETKRAAR RPYKPIALRQSQALPLRPPPPAPVNDEPIVIED" ORIGIN1 tcctcctctt cctctcccgc ccgcgccgcg gccctcccgt ccctgcgcgg cctcggcggc61 ctcggcggcg gcggcggcgg cggcggcagc agcgcggccc ctttaaacgc ctgcggcgccgcgccgagcg ccgcgcccgcaacatgtaca gggtcggaga241 ctacgtctac tttgagaact cctccagcaa cccatacctg atccggagga tcgaggagct301 caacaagacg gccaatggga acgtggaggc caaagtggtg tgcttctacc ggaggcggga361 catctccagc accctcatcg ccctggccga caagcacgca accctgtcag tctgctataa421 ggccggaccg ggggcggaca acggcgagga aggggaaata gaagaggaaa tggagaatcc481 ggaaatggtg gacctgcccg agaaactaaa gcaccagctg cggcatcggg agctgttcct541 ctcccggcag ctggagtctc tgcccgccac gcacatcagg ggcaagtgca gcgtcaccct601 gctcaacgag accgagtcgc tcaagtccta cctggagcgg gaggatttct tcttctattc661 tctagtctac gacccacagc agaagaccct gctggcagat aaaggagaga ttcgagtagg721 aaaccggtac caggcagaca tcaccgactt gttaaaagaa ggcgaggagg atggccgaga781 ccagtccaag ttggagacca aggtgtggga ggcgcacaac ccactcacag acaagcagat841 cgaccagttc ctggtggtgg cccgctctgt gggcaccttc gcacgggccc tggactgcag901 cagctccgtc cgacagccca gcctgcacat gagcgccgca gctgcctccc gagacatcac961 gctgttccac gccatggata ctctccacaa gaacatctat gacatctcca aggccatctc1021 ggcactggtg ccgcagggcg ggcccgtgct ctgcagggac gagatggagg agtggtctgc1081 atcagaggcc aaccttttcg aggaagccct ggaaaaatat gggaaggatt tcacggacat1141 tcagcaagat tttctcccgt ggaagtcgct gaccagcatc attgagtact actacatgtg1201 gaagaccacc gacagatacg tgcagcagaa acgcttgaaa gcagctgaag ctgagagcaa1261 gttaaagcaa gtttatattc ccaactataa caagccaaat ccgaaccaaa tcagtgtcaa1321 caacgtcaag gccggtgtgg tgaatggcac gggggcgccg ggccagagcc ctggggctgg1381 ccgggcctgc gagagctgtt acaccacaca gtcttaccag tggtattctt ggggtccccc1441 taacatgcag tgtcgtctct gcgcatcttg ttggacatat tggaagaaat atggtggctt1501 gaaaatgcca acccggttag atggagagag gccaggacca aaccgcagta acatgagtcc1561 ccacggcctc ccagcccgga gcagcgggag ccccaagttt gccatgaaga ccaggcaggc1621 tttctatctg cacacgacga agctgacgcg gatcgcccgg cgcctgtgcc gtgagatcct1681 gcgcccgtgg cacgctgcgc ggcaccccta cctgcccatc aacagtgcgg ccatcaaggc1741 cgagtgcacg gcgcggctgc ccgaagcctc ccagagcccg ctggtgctga agcaggcggt1801 acgcaagccg ctggaagccg tgcttcggta tcttgagacc cacccccgtc cccccaagcc1861 tgaccccgtg aaaagcgtgt ccagcgtgct cagcagcctg acgcccgcca aggtggcccc1921 cgtcatcaac aacggctccc ccaccatcct gggcaagcgc agctacgagc agcacaacgg1981 ggtggacggc aacatgaaga agcgcctctt gatgcccagt aggggtctgg caaaccacgg2041 acagaccagg cacatgggac caagccggaa cctcctgctc aacgggaagt cctaccccac2101 caaagtgcgc ctgatccggg ggggctccct gcccccagtc aagcggcggc ggatgaactg2161 gatcgacgcc ccggatgacg tgttctacat ggccacagag gagaccagga agatccgcaa2221 gctgctctca tcctcggaaa ccaagcgtgc tgcccgccgg ccctacaagc ccatcgccctgcgcccgtca acgacgagccgccccccgcc cctcgcccgc2401 ccacacggcc ccttcccagc cagcccgccg cccgcccctc agtttggtag tgccccacct2461 cccgccctca cctgcagaga aacgcgctcc ttggcggaca ctgagggagg agaggaagaa2521 gcgcggctaa cttattccga gaatgccgag gagttgtcgt ttttagcttt gtgtttactt2581 tttggctgga gcggagatga ggggccaccc cgtgcccctg tgctgcgggg ccttttgccc2641 ggaggccggg ccctaaggtt ttgttgtgtt ctgttgaagg tgccgtttta aattttattt2701 ttattacttt ttttgtagat gaacttgagc tctgtaactt acacctggaa tgttaggatc2761 gtgcggccgc ggccggccga gctgcctggc ggggttggcc cttgtctttt caagtaattt2821 tcatattaaa caaaaacaaa gaaaaaaatc ttataaaaag gaaaaaaacc aa//三、表达载体的选择我所选用的原核表达载体为质粒pBR322；pBR322 是一种常用的E. coli 克隆载体（1），为4,361 bp 的环状双链DNA（2）。
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
基因工程的原理和技术
基因工程的基本原理：
让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细 胞中稳定和高效的表达。根据不同的实验目的，目 的基因可以有很多种，如抗虫基因、抗病基因、抗 除草剂基因、人胰岛素基因和人干扰素基因等。因 此表达的产物各不相同。通过基因工程的基本操作 ，就能实现目标。
二、基因操作的基本步骤
第三步：将目的基因导入受体细胞
选择的关键是分析基因工程的最终目的，按转基因的目的来选择：
基因工程的 最终目的
得到大量特 殊蛋白质
得到转基因动物 得到转基因植物
常用的受 体细胞
大肠杆菌 等微生物
受精卵 植物体细胞
导入的方法
Ca2＋处理法 显微注射法 农杆菌转化法
将目的基因导入微生物细胞
常选细菌 作受体细胞的原因：它 们繁殖力极强，生长速 度很快，短期内就会产 生大量后代，所以把目 的基因转入这些细菌， 就能在短时间内得到大 量的目的基因产物。
细菌的检测：
将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中 是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的 菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
多细胞生物的检测： 将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体， 检测这些个体是否表现出相应的性状。
例：抗虫棉检测
用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不 出现中毒症状，说明未摄入目的基 因或摄入目的基因未表达。
例：下列有关基因表达载体的构建说法正确的是( C ) A．限制性核酸内切酶的功能是切割各种DNA分子 B．基因工程中经常用到的酶只有DNA连接酶和限制性 核酸内切酶 C．将目的基因与载体结合的过程，实际上就是不同来 源的DNA重新组合的过程 D．具有粘性末端的目的基因片段插入质粒的切口处， 先形成磷酸二酯键，再形成氢键
重组子筛选
37℃培养
外源基因产物检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
如果待筛选鉴定的目标蛋白既 不能测定生物活性，又无现成的抗 体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶 电泳进行粗略的筛选
遗传学直接筛选法
抗药性 显色反应 营养缺陷型 噬菌斑形成能力等
此法简便快速，可以在大量群 体中进行筛选。但由于目的基 因插入重组分子的方向，多聚 体假阳性等原因，可靠性较差
酶切载体
蓝色菌落（自连）
白色菌落（重组子）
DNA片段
未转化的受体菌 （AmpS）
连接液 E.coli 感受态细胞
显标记主要区分 重组子 与 非重组子
LB + Amp + X-gal + IPTG 抗药性标记主要区分
转化子 与 非转化子
Amp lzcZ’
自连质粒转化子 （AmpR ， lzcZ’ ）
重组质粒1 重组质粒2 载体对照
克隆DNA序列检测
限制性酶切图谱法
限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图 谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法 不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。
但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验 成本也高。
lacZ△M15
AmpR
lacI lacP ,O lacZ´
NH2–
a-互补
–COOH
lacI lacP ,O lacZ△M15
X-gal → 半乳糖+ 5-溴-4-氯-靛蓝
a-互补（lacZ’ ）筛选原理
带有 lacZ’ 基因的质粒转入宿主菌后，在诱导物 IPTG（异丙基-b-D-
硫代半乳糖苷，isopropylthio-b-D-galactoside）诱导下，lacZ’ 基因合 成半乳糖苷酶 N-端片段，宿主菌染色体上的 lacZ△M15 基因合成半乳 糖苷酶 C-端片段。质粒编码的半乳糖苷酶 N-端片段可与宿主菌编码的 半乳糖苷酶 C-端片段结合，形成有酶学活性的 b-半乳糖苷酶。在呈色 底物 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷，5-bromo-4-chloro-3indolyl-b-D-galactoside）存在时，形成蓝色菌落。
重组子筛选与鉴定
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子