南方医科大学质粒DNA的提取与PCR鉴定再试版
质粒DNA的提取和PCR技术讲义
操作步骤及注意事项
1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中， 于37℃振荡培养14～18 h。-培养时间不能太长，否则细
菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。
2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心 12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可 能流尽。 3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振 荡，使菌体分散混匀。 4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要 剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞 膜裂解,DNA变性。-放置时间不能太长。因为在碱性条件下
1。培养细菌的容器用过后都要及时进行灭菌，细菌培养基上清
不要随便丢弃，应存放在一起进行灭菌处理，以免污染环境。
2。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿 异戊 醇时要在通风橱中进行，氯仿 可引起神经系统功能紊乱要引起 肝脏损害 。异戊醇其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有 刺激作用
3。电泳时注意避免EB污染。
基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋 白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。当加 入中和液后，因为闭环的质粒DNA分子虽然氢键破坏 但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态，离心 时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成 大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖，当加入溶液三后 形成PDS被离心时可沉淀下来。
PCR技术
❖ 基本原理 ❖ 反应动力学 ❖ 使用步骤及注意事项 ❖ 反应参数要素 ❖ PCR优化
PCR技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年 代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、 敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化
质粒DNA的提取及检测实验报告
题目：质粒DNA的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
二．实验原理1. 质粒 (Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。
2.载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。
目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。
3.分离质粒DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。
4.碱裂解法（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl (pH8.0)作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性（3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。
大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
5.电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
6.提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
质粒DNA的提取和鉴定
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5.加入150μL溶液III(冰上预冷),盖紧管口,颠 倒数次使混匀,冰上放置5min 6.12000r/min,离心5min,将上清夜转至另一 Eppendorf管中 7.向上清夜加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置510min.12000r/min离心5min.倒去上清夜,把 Eppendorf管倒扣在吸水纸上,吸干液体 8.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心, 倒去上清夜,真空抽干或空气中干燥 9.50μL TE缓冲液,使DNA完全溶解(-20℃保存)
③淀粉凝胶电泳:多用于同工酶分析,凝胶铺厚些, 可一层一层剥层分析(一板多测).天然淀粉经加工 处理即可使用,但孔径度可调性差,并且由于其批号 之间的质量相差很大,很难得到重复的电泳结果,加 之电泳时间长,操作麻烦,分辨率低,实验室中已很 少使用. ④琼脂糖凝胶电泳:一般用于核酸的分离分析.琼脂 糖凝胶孔径度较大,对大部分蛋白质只有很小的分子 筛效应. ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳:可用于核酸和蛋白质的分离, 纯化及检测.其分辨率较高. 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持 介质
电泳装置
电泳仪 电泳槽 灌胶模具等
电泳仪
普通电泳仪 高压电泳仪
电泳槽
水平平板 垂直平板
电泳操作步骤
1,凝胶准备 用1×TAE配制1%琼脂糖凝胶.
① 称0.8g琼脂糖置三角瓶中,加100ml 1×TAE ② 微波炉加热大约1分钟,熔化琼脂糖 ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时准备倒胶.
凝胶浓度选择
琼脂糖浓度(%) 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0 线型DNA分子的分离范围(Kb) 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
质粒DNA的提取、鉴定与转化
(6)加入200μl无菌蒸馏水溶解沉淀，再加入1/2体积 7．5mol ／L NH4Ac，混匀后冰浴3～5min，以12000r／min离心5min。 (7)转移上清至新管中，并加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙 醇，室温放置5min后以12000r／min离心30min。弃去上清。 (8)沉淀用70％乙醇洗涤一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙 醇，室温自然干燥。 (9)加入20μlTE，使DNA充分溶解，置-20℃贮存,待用。
（二）质粒DNA的含量及纯度鉴定
含量测定：紫外吸收法 纯度鉴定：紫外吸收法和琼脂糖凝胶电泳
1、实验原理：
（1）测定DNA浓度的方法有两种：
紫外光吸收法：核酸在260nm处具有强吸收峰，所以通 过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因 为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一 般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测 定比较纯的样品。 溴化乙锭荧光强度法：当DNA含量很低以及样品中杂质 含量高时，会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用 测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧 光强度，因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。
一、实验目的：
大肠杆菌在LB培养基上培养，用碱性裂解法快速从大 肠杆菌细胞中分离、提取、纯化质粒DNA。用紫外吸 收法测定质粒DNA含量；用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其 纯度；用质粒转化实验，检测质粒的生物活性。 通过本实验使学生能熟练掌握质粒的提取纯化、限制性 内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳、大肠杆菌感受态细胞制 备及转化等方法和技术。
* 荧光染料EB染色的原理
EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸双链配 对碱基或碱基对之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。 激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收 254nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收302nm 和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EB发 射波长为590nm的可见光（红橙区）。
质粒DNA的提取与鉴定
质粒DNA的提取与鉴定实验日期 2020.5.14 室温 25℃成绩实验报告摘要实验目的：①掌握质粒提取原理和各种试剂的使用②掌握琼脂糖凝胶电泳原理和方法实验方法：琼脂糖凝胶电泳法实验结果：质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图获得三条带，从近到远分别为开环状DNA；线状DNA；超螺旋状DNA实验结论：碱性裂解法可以从大肠埃希菌中提取到质粒DNA实验原理1、质粒是独立存在于染色体，能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。
2、细菌质粒是应用最多的质粒群体，在细菌细胞内利用宿主细胞的复制机构复制质粒自身的DNA。
3、对数期菌体：具有质粒的大肠埃希菌。
4、溶液 I 充分重悬：50 mmol／L 葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
25 mmol／L Tris-HC1(pH 8.0) ：维持PH。
10 mmol／L EDTA(pH 8.0)：二价金属离子的螯合剂、消除游离Mg2+等二价金属离子,抑制DNA酶的活性。
5、溶液II裂解：0.2 mol／L NaOH:主要作用溶解细胞，释放DNA；l％ SDS:阴离子去垢剂。
作用：既能裂解细菌细胞膜，又能使细菌蛋白质变性。
质粒DNA具有特定的形态结构，在特殊环境下，如加热、极端PH等，能变性。
SDS处理细菌细胞能导致细菌细胞壁破裂，释放质粒DNA和细菌基因组DNA。
6、溶液III中和：5 mol／L 醋酸钾：使钾离子置换SDS中的钠离子，形成PDS（十二烷基硫酸钾）。
因为SDS遇到钾离子后变成PDS，而PDS是不溶于水，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。
冰乙酸：中和NaOH。
去除变性条件后，质粒DNA能复性，在加入强碱NaOH后，通过酸性的醋酸钾中和碱性溶液，质粒DNA便能迅速复性。
需要注意，染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性，所以，离心后，能将质粒DNA留在上清中，染色体DNA则和细胞碎片一起沉淀在离心管底部。
质粒DNA的提取及鉴定
水平电泳装置
四、实验操作
1、用碱裂解法提取质粒DNA：挑选单菌落小规模扩增后， 将2 mL含相应抗生素的 LB加入到容量为15 mL并通气良好的 试管中，然后接种入一单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜， 收集细菌。
2、将细菌团块重悬于100μL用冰预冷的溶液Ⅰ（150 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris–HCl，pH8．0，10 mmol/L EDTA， pH8.0）中剧烈振荡。加200μL新配制的溶 液Ⅱ(0.2mol/L Na0H, 1%SDS)盖紧管口，快速颠倒离心管5 次，将离心管放置于冰上。
三、仪器、试剂和材料
1、设备：恒温培养箱、恒温摇床、台式 离心机、超净工作台、高压灭菌锅、琼 脂糖凝胶电泳及分析系统等。
2、试剂：Tris、EDTA、SDS、限制性内 切酶、含质粒大肠杆菌、琼脂糖、溴化 乙锭、DNA marker等。
超净工作台
制冰机
漩涡混匀器
高速冷冻离心机和超速离心机等
四、实验操作
3、对提取的质粒DNA进行纯化及酶切鉴定： 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA，采用胶回收 试剂盒纯化质粒DNA；分析质粒DNA的限制 性酶切图谱，选择合适的限制性内切酶对质 粒DNA进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切 产物。
五、 结果处理
利用凝胶成像系统进行检测
闭环(螺旋) 闭环(超螺旋) 开环(部分解链 )
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只 需少量的DNA就能检测。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量 的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子 筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及 构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着 正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加 凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要 由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时 的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。
202212质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定
一、实验流程简述实验内容流程↓ 质粒DNA提取(约1小时) ↓ 紫外检测定量知识(计算方法),步骤↓ 紫外检测定量↓ 酶切步骤↓ 酶切约1~2小时↓ 学习酶切原理，琼脂糖电泳原理↓ 电泳(样品：质粒DNA,酶切产物，Marker) ↓约30分钟观察电泳结果、记录、拍照、保存二、实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法了解质粒酶切鉴定原理学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小质粒DNA的提取与定量Extraction and Quantitation of Plasmid DNA一、什么是质粒？独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状 DNA分子；基因工程常采用的载体方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离、纯化质粒DNA二、实验原理基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。
当以pH4.8的NaAc溶液调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、实验材料宿主菌：大肠杆菌DH5a菌株载体：PMD-18T质粒插入片段基因：CHD5CHD5补充知识：模板基因米尔副教授领导的研究小组发现的CHD5,其编码基因位于1 号染色体的特异部分(1p36)。
当CHD5失去功能的时候，细胞内平时起抑癌作用的系统会被关掉。
CHD5如同肿瘤抑制网络的总开关，这提示CHD5与多种人类癌症有关。