我国重要食源性寄生虫病的发病机制及防治研究

项目名称：我国重要食源性寄生虫病的发病机制及

防治研究

首席科学家：余新炳中山大学

起止年限：2010年1月-2014年8月

依托部门：教育部

一、研究内容

弓形虫、旋毛虫、广州管圆线虫和华支睾吸虫是我国重要的食源性寄生虫，对我国食品安全及国民健康构成严重威胁。食源性寄生虫与宿主相互作用所致的组织炎症和免疫病理损伤是上述4种寄生虫病的共同病变结局。因此，寄生虫与宿主相互作用的分子基础及其免疫调节机制是关键科学问题。

本项目围绕这一科学问题，针对上述4种食源性寄生虫病，从环境、遗传和分子生物学层面，从基因、蛋白、细胞、整体、机制和功能等诸方面有机地整合在一起进行系统研究，从筛选食源性寄生虫诱发宿主炎症和免疫病理损伤相关的基因或蛋白入手，通过对基因表达蛋白相关功能的研究及体内外验证，确认这些寄生虫关键致病分子和免疫调节分子，并研究这些虫体关键分子与宿主的相互作用，阐明弓形虫、广州管圆线虫、旋毛虫和华支睾吸虫的致病机制和免疫调节机制，在此基础上研究新的干预措施，为这些重要食源性寄生虫病防治提供新思路和新方法。

主要研究内容：

1、寄生虫的致病关键基因或蛋白分子及其功能研究：

对4种食源性寄生虫分别从下述的三个层面研究其致病关键基因或蛋白: ①利用寄生虫的分子标记，分析从我国不同地区分离的寄生虫虫株，通过研究虫株的基因型与致病的关系，确定流行我国寄生虫虫株的致病基因型；②利用生物信息学技术，从寄生虫基因文库中筛选与疾病相关的潜在功能基因并进行重组表达，在体内外研究其与致病的关系，确定致病相关基因；③富集体外培养的寄生虫分泌排泄蛋白或其中的蛋白酶组分，利用基于生物质谱的蛋白质组学技术鉴定，选择并重组表达其中的相关功能蛋白，在体内外研究其与致病的关系，确定

致病相关蛋白。

2、虫体致病相关蛋白与宿主靶蛋白的相互作用研究

①利用本课题已有的高覆盖率的人类蛋白质组芯片（含17000多种人类蛋白质），寻找能与虫体致病蛋白相互作用的宿主靶蛋白，在体内外研究虫体致病蛋白与宿主靶蛋白的相互作用，从中发现与宿主免疫相关的虫体致病蛋白，并研究其免疫相关功能；②利用小分子抑制剂、转基因或基因沉默技术，干扰虫体致病蛋白的功能，研究干扰后寄生虫虫体与宿主的相互作用。

3、寄生虫致病机制及防治干预研究：

①利用免疫磁珠分选法和流式细胞检测技术，检测动物感染后外周血液中抗原递呈细胞、效应细胞及调节性Ｔ细胞的数量变化，以及炎症细胞因子的表达水平，比较寄生虫感染过程中适宜和非适宜宿主细胞免疫应答与炎症发生的关系；通过细胞或动物感染模型，研究干预免疫细胞的活化及其相关信号通路，对寄生虫感染所致的炎症反应的影响。②利用细胞和动物模型，通过检测端粒酶活性、BMI1、P53、细胞周期控制相关蛋白基因表达水平等与细胞永生化及恶性转化的指标，并通过肿瘤细胞克隆形成实验和祼鼠体内成瘤实验，研究虫体致病蛋白对宿主靶细胞的永生化及恶性转化的作用。③利用转基因或基因沉默技术，构建致病蛋白缺陷型虫株，研究其对宿主的致病作用的影响；或利用小分子化合物干预致病蛋白活性，研究寄生虫病防治的新策略和新方法。

二、预期目标

总体目标

本项目研究围绕“食源性寄生虫与宿主相互作用的分子基础及其免疫调节机制”这一科学问题，针对弓形虫病、旋毛虫病、广州管圆线虫病和华支睾吸虫病4种食源性寄生虫病，从环境、遗传和分子生物学层面，从基因、蛋白、细胞、整体、机制和功能等方面有机整合在一起进行系统研究。通过发现并验证致病相关基因和关键蛋白，研究这些致病分子在诱导炎症、免疫病理和免疫调节方面的功能，揭示这些重要靶分子在食源性寄生虫病的发生、发展中的作用。同时，利用细胞模型和动物感染模型，并结合干预研究，从分子病理学和分子免疫学水平研究这些致病分子与宿主相互作用的分子机制，阐明这些重要寄生虫病的致病机理，寻找新的防治策略和方法，提高早期诊断、早期干预及治疗水平，保障食品安全，降低感染率、发病率和死亡率。使我国寄生虫病基础研究和防治达到国际领先水平。

五年预期目标

1. 建立我国人兽弓形虫分离株的基因型库，明确流行我国弓形虫虫株的主要基因型，及其与毒力和致病的相关性，通过比较蛋白质组学技术分析不同基因型虫株速殖子和缓殖子基因表达差异，研究差异蛋白的功能，阐明弓形虫速殖子和缓殖子相互转换的分子机制并发现药物作用的新靶点，采用高通量人蛋白质组芯片，研究致病相关基因型虫体入侵与宿主细胞之间相互作用的分子关系，为致病基因型虫株在妊娠结局的转归评估及艾滋病等免疫低下患者的早期干预方案的制定提供科学依据。

2.对旋毛虫引起的食源性寄生虫病，通过发现并验证旋毛虫致病相关基因和关键

分泌蛋白，研究这些致病分子在虫体入侵肠上皮细胞和成囊过程的致病相关功能，揭示其在旋毛虫病的发生发展中的作用。同时，利用细胞模型和动物感染模型，并结合干预研究，从分子病理学和分子免疫学水平研究虫体致病分子与宿主相互作用的分子机制，阐明旋毛虫病的致病机理，在此基础上寻找新的防治策略和方法，提高旋毛虫病早期诊断、早期干预及治疗水平，保障肉类食品安全，降低旋毛虫病感染率、发病率和死亡率。

3.通过华支睾吸虫分泌排泄抗原中对胆管上皮细胞、卵圆细胞、肝星状细胞的活化和转化效应的关键分子的发现及其相关功能研究，试图阐明华支睾吸虫感染引起胆管上皮细胞增生和肝纤维化的形成机制；并通过研究这些关键分子对胆管上皮细胞永生化和恶性转化的效应，揭示华支睾吸虫感染诱发肝胆管癌的分子基础；通过干预研究，明确控制幼虫成囊的关键分子及其作用，为阻断华支睾吸虫病传播途径提供新的免疫预防策略。

4.发现广州管圆线虫活化淋巴细胞和嗜酸性粒细胞等免疫细胞的关键虫源分子，探讨其介导的炎症反应信号转导通路，研究广州管圆线虫感染后宿主炎症细胞活化及细胞因子释放网络，进一步阐明广州管圆线虫感染所致的中枢神经系统炎症反应的免疫调节机制，提出治疗广州管圆线虫感染所致炎症损伤的新思路。

优秀人才培养和量化考核指标

优秀人才培养：以课题承担单位为人才培养基地，充分利用中山大学“有害生物防治和资源利用国家重点实验室”、“热带病防治研究教育部重点实验室”的平台实力，培养具有国际竞争力的优秀人才；预期培养国家教育部“长江学者奖励

计划”岗位或讲座教授1-2名、国家杰出青年基金获得者2-3名。培养博士后50-60名、博士生100-120名、硕士生120-150名。

量化考核指标：通过本项目的研究，取得一批在国内外具有影响力的研究成果，包括在SCI学术期刊发表论文100-120篇，其中在本专业领域影响力排前五位的学术期刊发表论文数达40％以上，项目内容被国际学术会议邀请作大会报告达5次以上。国家发明专利、实用新型专利受理或授权10项左右。

三、研究方案

总体研究思路

寄生虫与宿主相互作用所致的炎症和免疫病理损伤是弓形虫病、旋毛虫病、华支睾吸虫病、广州管圆线虫病4种食源性寄生虫病的共同病变结局。因此，本项目研究围绕“食源性寄生虫与宿主相互作用的分子基础及其免疫调节机制”这一科学问题，从环境、遗传和分子生物学层面，从基因、蛋白、细胞、整体、机制和功能等方面有机整合在一起进行系统研究。通过发现并验证致病相关基因和关键蛋白，研究这些致病分子在诱导炎症、免疫病理和免疫调节方面的功能，揭示这些重要靶分子在食源性寄生虫病的发生、发展中的作用。同时，利用细胞模型和动物感染模型，并结合干预研究，从现代病理学和分子免疫学水平研究这些致病分子与宿主相互作用的分子机制，阐明这些重要寄生虫病的致病机理，研究新的防治策略和方法，以期提高早期诊断、早期干预及治疗水平，保障食品安全，提高国民健康水平。

创新性

本项目围绕“食源性寄生虫与宿主相互作用的分子基础及其免疫调节机制”这一科学问题，以人蛋白质组芯片、蛋白质组学技术、流式细胞检测等高通量技术及分子免疫学和现代病理学技术为主要技术手段，从基因、细胞、整体、机制和功能等方面有机整合在一起进行系统研究。其创新性主要表现为：

1.本项目凝练出“寄生虫与宿主相互作用的分子基础及其免疫调控机制”这一科学问题，并以寄生虫与宿主相互作用所致炎症和病理损伤作为研究弓形虫病、旋毛虫病、华支睾吸虫病和广州管圆线虫病4种食源性寄生虫病共同的核心内容。

2.本项目以寄生虫致病蛋白与相应的宿主靶蛋白的相互作用作为研究寄生虫与宿主关系和致病-免疫机制的切入点，并首次利用目前世界上蛋白质种类覆盖率最全的人蛋白质组芯片，筛选与寄生虫致病蛋白相互作用的宿主靶蛋白，不仅大大提高了筛选人靶蛋白的机率，而且研究结果能直接反映出寄生虫与人相互作用的分子关系。

3.基于研究寄生虫致病分子和宿主靶分子的相互关系及致病机制的结果，提出干预食源性寄生虫病的新策略和新方法。

总体研究技术路线

从感染的人和动物分离弓形虫虫株体外培养弓形虫、旋毛虫、

华支睾吸虫、广州管圆线虫

富集分泌排泄物

确定虫株基因型质谱-蛋白质组学鉴定分泌蛋白

确定致病相关基因重组表达分泌蛋白

人蛋白质组芯片

发现分泌蛋白作用的宿主靶蛋白确定毒力基因型虫株重组表达相应蛋白

人蛋白质组芯片

速殖子和缓殖子转换

虫体蛋白与宿主靶蛋白介导的虫体-宿主相互作用研究

转基因、基因沉默

或小分子抑制剂

致病机制和防治干预研究

可行性分析

1.人员结构合理: 本研究团队汇集了在食源性寄生虫学、医学生化与分子生物学、蛋白质组学、神经生物学、免疫学、药物化学等领域长期从事基础研究的优秀科研人员，大部分骨干成员有长期合作的基础，完全胜任本项目拟定的科研计划。

2.研究平台优越: 拥有“有害生物防治与资源利用国家重点实验室(中山大学)”、“热带病防治研究教育部重点实验室(中山大学)”、“重要遗传病基因资源利用教育部重点实验室(安徽医科大学)”，本项目5个承担单位均拥有“生物安全二级实验室”，同时还拥有国家认证认可的“生物安全三级实验室（中山大学）”。

3.资源充足: 建立了完善的华支睾吸虫和广州管圆线虫的人工生态系统, 拥有科技部重要寄生虫虫种种质资源库，有丰富的食源性寄生虫资源：包括6个国内人源性弓形虫虫株和多个国外引进的弓形虫虫株（ME49株, RH株, Pru虫株, GFP 标记的和Luciferase标记的RH虫株等）。

4.项目管理合理:以中山大学为总协调单位, 团队合作联合攻关, 具有完善合理的项目监督管理机制, 保证专款专用和项目的顺利完成。

课题设置：

综合分析国内外最新研究进展和发展趋势，结合我们已有的研究基础，设置4个课题：①流行我国弓形虫虫株的毒力基因型及其致病机制研究；②旋毛虫致病的分子基础及干预研究；③华支睾吸虫致病的基础研究；④广州管圆线虫病的免疫调节机制研究。

课题一、流行我国弓形虫虫株的毒力基因型及其致病机制研究

主要研究内容：①根据2005年卫生部公布的第二次全国人体寄生虫病流行状况调查数据，从我国弓形虫感染率高、中、低三类流行区的散养鸡、猫（弓形虫终末宿主）、弓形虫抗体阳性而中止妊娠流产胎儿及免疫力低下人群中分离弓形虫虫株；②根据国际公认的弓形虫基因分型标志 (c22-8、c29-2、L358、PK1b、SAG2、BTUB、GRA6、SAG3、Apico等)，对获取的弓形虫虫株进行基因分型，确定流行我国弓形虫虫株的主要基因型；③根据感染小鼠的致病和死亡情况以及孕鼠致畸实验，确定各基因型株的毒力。将这些毒力株与孕妇流产、新生儿致畸及艾滋病等免疫低下患者中分离的弓形虫虫株进行基因型比较，研究流行我国弓形虫虫株基因型与毒力和致病的相关性；④利用弓形虫基因芯片、蛋白质组技术，比较分析不同致病基因型虫株速殖子和缓殖子基因表达差异，识别速殖子和缓殖子转换的调控关键基因或特有的蛋白质，并通过基因敲除等技术验证其对转换的作用，研究速殖子和缓殖子转换的分子基础及药物作用的新靶点；⑤利用弓形虫感染小鼠模型，研究在免疫抑制剂作用下，致病基因型虫株缓殖子向速殖子转换与宿主免疫细胞及细胞因子的关系；利用免疫低下或免疫缺陷小鼠感染模型，研究在免疫重建后，致病基因型虫株速殖子向缓殖子转换与宿主免疫细胞及细胞因子的关系，明确致病基因型虫株速殖子和缓殖子相互转化的关键宿主免疫分子，毒力相关虫源性分子与宿主免疫细胞的相互调节机制和相关信号通路。

研究目标：建立我国人兽弓形虫分离株的基因型库，明确流行我国弓形虫虫株的主要基因型，及其与毒力和致病的相关性，阐明弓形虫速殖子和缓殖子相互转换的分子机制并发现药物作用的新靶点，为致病基因型虫株在妊娠结局的转归评估

及艾滋病等免疫低下患者的早期干预方案的制定提供科学依据。

承担单位：安徽医科大学、中山大学

课题负责人：沈继龙

主要学术骨干：吕芳丽、伦照荣、余莉、汪学龙

经费比例：30%

课题二：旋毛虫致病的分子基础及干预研究

主要研究内容：①通过对我国旋毛虫病高、中、低度流行区人和畜旋毛虫病血清样品的采集，稳定性及理化条件的研究，建立旋毛虫病的国家标准参考血清库；

②利用生物信息学技术从旋毛虫基因文库中筛选与疾病相关的潜在功能基因, 或通过富集寄生虫分泌排泄蛋白（或蛋白酶）并利用质谱-蛋白质组学技术鉴定，选择并重组表达其中的功能蛋白，在体内外研究其与致病的关系，确定致病相关蛋白；③利用高覆盖率的人类蛋白质组芯片等组学技术，筛选与旋毛虫致病蛋白相互作用的宿主靶蛋白，在体内外研究虫源蛋白与人宿主靶蛋白的相互作用，从中发现与宿主肠道黏膜免疫相关的虫源蛋白并确定其相关功能；④利用小分子功能抑制剂或基因沉默技术，干扰虫体致病蛋白的功能，研究干扰后对旋毛虫入侵宿主肠上皮细胞和幼虫成囊的影响，在此基础上研究旋毛虫病干预的新策略和新方法。

研究目标：本课题的研究，将阐明旋毛虫感染宿主肠黏膜免疫的分子机制，为研发旋毛虫病检疫和早期诊断试剂盒、保障肉类食品安全提供技术支撑，并为旋毛虫病的有效干预和防治措施提供科学依据。

承担单位：中山大学、郑州大学

课题负责人：周兴旺

主要学术骨干：王中全、崔晶、姚尖平、万一千

经费比例：20%

课题三：华支睾吸虫致病相关分子及防治的基础研究

1．主要研究内容：华支睾吸虫感染引起肝纤维化的机制研究：

（1）分泌排泄抗原直接激活肝星状细胞的体外细胞模型研究：利用大鼠和人的肝星状细胞系和大鼠原代肝星状细胞，建立华支睾吸虫分泌排泄抗原促肝纤维化的细胞模型；利用蛋白组学、免疫学和分子生物学技术，鉴定成虫分泌排泄物中直接激活肝星状细胞的蛋白分子及其特异性受体和调控靶基因表达的信号通路；在分子和细胞水平阐明分泌排泄抗原直接激活肝星状细胞的分子机制。（2）肝纤维化的实验动物模型研究：以Wistar大鼠作为华支睾吸虫的感染模型，从整体水平研究分泌排泄抗原对肝星状细胞的直接和间接（肝细胞脂肪变性和免疫病理损伤）激活作用，阐明华支睾吸虫感染所致肝纤维化的主要途径和分子机制。

（3）肝纤维化的干预研究：将效应蛋白的重组抗原免疫Wistar大鼠，研究产生的抗体对华支睾吸虫感染所引起的肝纤维化的保护作用，以及引起的Th1/Th2免疫应答的特征对肝纤维化的影响，进一步阐明华支睾吸虫分泌排泄物引起肝纤维化的分子机制。

2．华支睾吸虫感染引起胆管癌的机制研究：

（1）分泌排泄抗原直接激活肝卵圆细胞的体外细胞模型研究：利用大鼠的肝卵圆细胞系和原代卵圆细胞，建立华支睾吸虫分泌排泄抗原促胆管上皮细胞腺瘤样病变及胆管癌的细胞模型；利用蛋白组学、免疫学和分子生物学技术、同位素

和荧光示踪技术、和人蛋白质组芯片技术，鉴定成虫分泌排泄物中直接激活卵圆细胞的蛋白分子及其特异性受体和调控靶基因表达的信号通路；在分子和细胞水平阐明分泌排泄抗原直接激活肝卵圆细胞的分子机制。

（2）胆管癌动物模型研究：从整体水平验证分泌排泄抗原对胆管上皮细胞/卵圆细胞的直接激活作用（细胞增生和恶性转化）和裸鼠成瘤能力实验，阐明华支睾吸虫感染所致肝纤维化的主要途径和分子机制。

（3）胆管癌的干预研究：将效应抗原的重组蛋白免疫Wistar大鼠，在抗体滴度达到一个高水平的情况下感染华支睾吸虫，与阳性对照组、单纯佐剂对照组比较胆管上皮细胞增生和转化的程度，评价这些抗原的预防效果。

3．华支睾吸虫鱼体成囊机制的研究

（1）囊蚴不同发育时期蛋白表达的差异：对感染后不同发育时间点的囊蚴组织匀浆和分泌抗原的混合物进行蛋白组学比较研究，寻找表达量由低到高又在囊蚴成熟后又降低的虫体蛋白组分，并对这些组分进行蛋白组学鉴定。

（2）采用制备级双向电泳纯化这些候选抗原，并克隆表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、TGF-β1等可能与成囊相关的抗原。免疫大鼠制备抗血清，并对这些蛋白在虫体和囊壁的分布进行定位研究。

（3）利用基因沉默技术或/和功能性抑制剂，构建基因缺陷或功能失活型尾蚴，观察感染鱼体后囊蚴的发育情况和对终宿主的感染力；并评价在这些候选分子在抗囊蚴形成的作用。

（4）筛选对控制囊蚴形成的抗原，制备口服疫苗疫苗，评价疫苗的保护效果。

4、华支睾吸虫病诊断、疫苗候选抗原的筛选和评价

（1）筛选华支睾吸虫成虫阶段表达的分泌型抗原，制备重组抗原，检测华支睾

吸虫病人（分急性期和慢性期）血清和唾液中特异性抗体及其亚类；筛选敏感、特异的标志物（抗原或抗体）。

（2）筛选华支睾吸虫囊蚴阶段表达的分泌型抗原，制备重组抗原，检测华支睾吸虫感染鱼血清、体表粘液中特异性抗体及其亚类；筛选敏感、特异的标志物（抗原或抗体）。

（3）对导致鱼体华支睾吸虫成囊的相关抗原基因克隆进益生菌中，构建重组芽孢的饲料添加剂型口服疫苗，制备抗鱼体华支睾吸虫感染疫苗，根据疫苗产生的抗攻击感染（囊蚴形成数及成熟程度作为评价指标）和对终宿主的感染能力评价疫苗的保护效果。

研究目标：通过华支睾吸虫分泌排泄抗原对肝星状细胞、卵圆/胆管上皮细胞等细胞模型和华支睾吸虫感染引起肝纤维化及胆管癌实验动物模型研究，发现导致肝纤维化，胆管上皮腺瘤样病变及胆管癌形成的虫体和宿主关键分子，阐明华支睾吸虫感染引起胆管上皮细胞增生和肝纤维化的主要分子机制；通过蛋白组学和功能基因组学鉴定可能与囊蚴形成有关的蛋白及其基因，并通过疫苗干预实验和功能缺陷型尾蚴感染实验进一步鉴定幼虫在鱼体成囊的关键分子及其作用机制；通过成虫和囊蚴功能基因组学研究，从其cDNA文库的分泌型抗原基因中筛选敏感、特异的诊断抗原和鱼用疫苗候选抗原，研制华支睾吸虫病诊断试剂盒和疫苗。

发表SCI论文30～36篇，其中本专业领域影响因子排名为前5名或3.0以上的文章12篇以上；

预期争取培养国家教育部“长江学者奖励计划”岗位或讲座教授1名、国家杰出青年基金获得者1名，培养博士后5名、博士生30名、硕士生40名。

承担单位：中山大学、华中科技大学

课题负责人：余新炳

主要学术骨干：李雍龙、刘文琪、胡旭初、李学荣、徐劲

经费比例：30%

课题四：广州管圆线虫病的免疫调节机制

主要研究内容：①开展广州管圆线虫不同地理株的致病力研究，广州管圆线虫感染后中枢神经系统形态学研究，进一步揭示广州管圆线虫致病的生物学特性。

②利用基于生物质谱的蛋白质组技术，识别广州管圆线虫III期、IV期和V期幼虫的分泌排泄物中的蛋白组分，采用体外蛋白表达系统表达并纯化候选蛋白，利用树突状细胞等体外培养模型测定候选蛋白的相关免疫学活性，发现具有活化淋巴细胞和嗜酸性粒细胞功能的蛋白分子；利用人宿主蛋白质组芯片等技术进一步鉴定其作用的靶蛋白，发现广州管圆线虫活化淋巴细胞和嗜酸性粒细胞等免疫细胞的关键分子，并研究这些分子与宿主靶蛋白相互作用介导的炎症反应信号转导通路。③利用免疫磁珠分选法和流式细胞检测技术，检测大鼠和小鼠感染后外周血液中树突状细胞、CD69阳性淋巴细胞、CD4+CD25+Treg细胞的数量变化，以及IL-5、IL-17和IL-23等炎症细胞因子的表达水平，比较研究广州管圆线虫感染过程中适宜和非适宜宿主细胞免疫应答与中枢神经系统嗜酸性细胞增多性炎症发生的关系；④利用免疫组化技术，研究广州管圆线虫感染过程中大鼠和小鼠脑组织中小胶质细胞分布及功能变化，探讨小胶质细胞在调节中枢神经系统嗜酸性细胞增多性炎症反应中的作用。研究活化的小胶质细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的相互作用，试图揭示中枢神经系统内外免疫细胞的相互作用可能机制。④通过动物感染模型，研究药物干预免疫细胞的活化对广州管圆线虫感染所致的中枢神经系统炎症反应改善影响。

研究目标：发现广州管圆线虫活化淋巴细胞的关键虫源分子并探讨其介导的炎症反应信号转导通路，研究广州管圆线虫感染后宿主炎症细胞活化及细胞因子释放网络，进一步阐明广州管圆线虫感染所致的中枢神经系统炎症反应的免疫调节机制，提出治疗广州管圆线虫感染所致炎症损伤的新思路。

承担单位：中山大学、南京医科大学

课题负责人：吴忠道

主要学术骨干：詹希美、王勇、雷万龙、张萍、吕志跃

经费比例：20%

各课题间的有机联系以及与预期目标的关系：

寄生虫与宿主相互作用所致的炎症和免疫病理损伤是弓形虫病、旋毛虫病、广州管圆线虫病、华支睾吸虫病这四种食源性寄生虫病的共同病变结局，因此，本项目设置的四个课题紧紧围绕这一核心问题，从环境、遗传和分子生物学层面，从基因、蛋白、细胞、整体、机制和功能等方面有机整合在一起进行系统研究。通过发现并验证致病相关基因和关键蛋白，研究这些致病分子在诱导炎症、免疫病理和免疫调节方面的功能，揭示这些重要靶分子在食源性寄生虫病的发生、发展中的作用。此外，发现与致病或免疫有关的关键虫源性分子是本项目的核心研究内容，为此，课题二中“寄生虫蛋白质组学技术和人类蛋白质组芯片技术”是本项目课题一、课题三、课题四共同利用的关键技术，利用该技术可以鉴定寄生虫分泌蛋白并发现与分泌蛋白作用的宿主（人）靶蛋白，将弓形虫、旋毛虫、华支睾吸虫、广州管圆线虫的研究内容有机地整合在一起，充分体现本项目优势集成和资源共享的宗旨。

四、年度计划

第一年

研究内容：根据弓形虫、旋毛虫、华支睾吸虫及广州管圆线虫在国内不同流行程度，分别从高、中、低度流行区的患者和（或）动物体内采集血清和虫体样品，进行基因分型、体外培养、虫体分泌排泄蛋白的制备。利用细胞模型和动物模型初步研究分泌排泄蛋白的功能，鉴定与致病相关的蛋白。

预期目标：

1.建立我国人兽弓形虫分离株的基因资源库，明确流行我国弓形虫虫株的主要基因型及其与毒力的相关性；建立感染旋毛虫病的国家标准血清库，利用蛋白质组学技术发现与致病相关的特异抗原或分泌蛋白并获得重组表达产物，初步明确其与旋毛虫致病的关系；发现与肝纤维化、胆管癌及鱼体成囊相关的华支睾吸虫蛋白及其基因，获得有较高敏感性和特异性的诊断抗原。建立广州管圆线虫幼虫分泌蛋白基因和蛋白质组数据库，明确我国主要流行区的广州管圆线虫地理株与致病力相关性，证实广州管圆线虫侵入中枢神经系统后的精确移行途径和虫体在组织中的确切分布。

2.发表SCI论文10-15篇。

第二年

研究内容：在继续完善上一年的工作基础上，利用蛋白质组学、基因沉默技术，在细胞模型和动物模型上对4种食源性寄生虫分泌排泄蛋白进行功能研究。筛选并鉴定弓形虫速殖子和缓殖子转化、旋毛虫入侵宿主肠上皮细胞、华支睾吸虫致肝纤维化和胆管上皮细胞腺瘤样增生、广州管圆线虫致中枢神经系统嗜酸性粒细

胞增多性炎症等致病相关的蛋白，进行初步的功能研究。

预期目标：

1. 阐明不同基因型弓形虫株急性感染和潜伏感染活化后，对免疫功能受损宿主的致病机制，以及不同基因型/毒力虫株先天性致畸作用。明确旋毛虫致病相关蛋白特别是与入侵宿主肠上皮细胞相关的功能蛋白；揭示旋毛虫幼虫致病分泌蛋白作用于宿主肠上皮细胞的宿主靶蛋白及其相关机制。初步阐明华支睾吸虫效应抗原促纤维化及胆管上皮细胞增生和转化的分子机制。发现具有活化淋巴细胞、嗜酸性粒细胞活性功能的广州管圆线虫虫源性分子；完成关键虫源性分子与宿主靶蛋白相互作用介导的炎症反应信号转导通路的检测。在对虫源蛋白功能研究的基础上，发现与免疫诊断和免疫保护相关的蛋白。

2. 发表SCI论文20-25篇。申请发明专利2-4项。

第三年：

研究内容：在继续完善上一年的工作基础上，进行弓形虫垂直传播的免疫干预研究，深入研究速殖子和缓殖子转换的分子机制，以及弓形虫分泌排泄抗原中特定功能分子与宿主细胞作用的受体及其信号通路。利用动物模型和细胞模型在体内外研究虫体致病蛋白与人宿主靶蛋白的相互作用，从中发现与宿主入侵及肠道免疫相关的虫体致病蛋白并研究其相关功能和机制；利用基因沉默技术或/和功能性抑制剂，构建基于成囊关键分子的功能缺陷型旋毛虫幼虫，通过动物模型研究成囊相关分子对幼虫发育及成囊的影响。通过动物模型进一步研究华支睾吸虫分泌蛋白促肝纤维化、胆管上皮细胞腺瘤样病变和胆管癌形成的效果；研究并鉴定

对华支睾吸虫囊蚴发育和成囊相关关键蛋白的影响；利用筛选到的诊断抗原，检测华支睾吸虫病人尿液和唾液中特异性抗体。利用人源蛋白质组芯片，发现广州管圆线虫关键虫源性分子的宿主靶蛋白，并研究炎症反应信号传导通路，以及正常、非正常动物宿主感染广州管圆线虫后免疫反应差异的机制。

预期目标：

1.初步阐明弓形虫垂直传播感染的免疫机制；揭示不同宿主细胞中抗弓形虫感染的关键因子；阐明关键分子在弓形虫速殖子和缓殖子转化中的作用；试验证实弓形虫ESA毒力相关分子对宿主免疫细胞亚群作用的糖基依赖特征。进一步阐明虫体致病蛋白与宿主肠上皮细胞靶蛋白相互作用介导的旋毛虫入侵分子机制，揭示旋毛虫幼虫成囊的分子基础及成囊相关机制。进一步阐明华支睾吸虫引起肝纤维化、胆管上皮细胞腺瘤样病变及胆管癌以及鱼体华支睾吸虫幼虫成囊的分子机制；发现抑制幼虫成囊的关键蛋白。阐明CD4+CD25+Treg细胞在调节广州管原线虫感染脑部病灶免疫病理中的机制。揭示关键虫源性分子活化或趋化嗜酸性粒细胞的分子机制。阐明小胶质细胞等中枢神经系统免疫细胞在嗜酸性粒细胞炎症反应中的调节作用

2.发表SCI论文25-30篇；申报1-2诊断试剂盒的新药证书或生产批文。申请发明专利2-4项。

第四年

研究内容：在继续完善上一年的工作基础上，研究Th1/Th2免疫反应对弓形虫感染的免疫病理及其调节机制和肥大细胞等对弓形虫感染的免疫病理及其调节机制。完成速殖子和缓殖子转化过程中的关键因子作用的分析。利用蛋白质组学技

术研究弓形虫分泌蛋白中与宿主细胞相互作用的分子机制及其信号通路。继续深入研究旋毛虫入侵肠上皮细胞的分子机制，并在此基础上研究基于阻断旋毛虫肠上皮细胞入侵的旋毛虫病干预新策略和新方法。探索以幼虫成囊候选分子为靶点的干预方法。利用动物模型研究不同种类和剂量的华支睾吸虫分泌蛋白联合作用下，对肝纤维化和胆管上皮细胞腺瘤样增生/胆管癌形成的效果；研究效应蛋白免疫所产生的抗体对肝纤维化和胆管上皮腺瘤样增生的干预效应。利用基因沉默技术，构建成囊相关蛋白功能缺陷型尾蚴，验证这些基因的功能。

深入研究各固有免疫信号通路关键组分在广州管圆线虫感染后所发挥的作用和分子机制。在此基础上，在动物体内进行广州管圆线虫嗜酸性粒细胞炎症反应的干预研究。

预期目标：

1. 阐明关键分子在弓形虫速殖子和缓殖子转化中的作用，阐明与弓形虫分泌蛋白中毒力相关分子作用的宿主细胞TLRs及其信号通路特征，及其诱导保护性免疫应答和抑制性免疫应答的剂量和时相依赖机制，阐明旋毛虫致病蛋白与宿主肠上皮细胞靶蛋白相互作用介导的旋毛虫入侵分子机制，发现基于阻断旋毛虫肠上皮细胞入侵的旋毛虫病干预新策略和新方法。揭示旋毛虫幼虫成囊的分子基础及成囊相关机制。深入阐明华支睾吸虫感染所致肝纤维化、胆管上皮腺瘤样增生和胆管癌形成的分子机制，及囊蚴成囊的分子机制，获得有效的鱼用抗华支睾吸虫感染/华支睾吸虫病疫苗。阐明广州管圆线虫致宿主中枢神经系统嗜酸性粒细胞增多性炎症的分子机制及信号转导通路。

2.发表SCI论文25-30篇。完成1-2个诊断试剂盒的流行区现场应用研究。