临床免疫学检验-课件-第9章 酶免疫技术1
• 酶标记物的标记原则
• 保有酶的催化活性和抗体（或抗原）的活性。 • 结合物有良好的稳定性。 • 标记方法简单、产率高、且重复性好。
制备酶结合物的方法
戊二醛交联法：以双功能交联剂为“桥”，分别 与酶和抗体（抗原）连接而形成结合物。
要求：交联剂至少含有两个可与蛋白质分子通过化 学反应而结合的反应基团。
HRP催化TMB
HRP催化
– 终止反应； –提高显色的稳定性，退色慢！以TMB为例
不加终止液：2小时内反应产物退色，蓝色产物 在450nm有最大吸收峰，但峰值较低
加终止液：反应产物变成黄色，在450nm处具有 最大吸收峰，峰值比蓝色产物峰值高。
–不同显色体系里可能使用的终止液不同（酸或碱）。
– 定义：通过化学反应将酶与抗体或抗原形成结合物 – 作用：酶免疫测定技术的核心组成部分，它的稳定性
决定EIA试剂盒的有效使用日期。
（一）酶标记抗体或抗原的制备 （p50）
• 抗原和抗体的要求：
• 抗原：纯度高，抗原性完整; • 抗体：效价高、亲和力强、特异性强，能批量生产，易于分
离纯化。常用单克隆抗体
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）： β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-Gal）
辣根过氧化酶（HRP）
• HRP的性质: • 主酶（糖蛋白）+ 辅基（亚铁血红素）蔬菜作物辣根中含 量很高。 • 最高吸收峰:主酶(275nm)与酶活性无关；辅基(403nm)酶活 性基团
• HRP的纯度： • 纯度数(Reinheit zahl, RZ)表示：A403/A275 • 用于标记的HRP, RZ ≥ 3.0。 • 仅表示辅基在HRP中的含量，RZ越大不意味着酶活性越高， 酶变性后RZ不变但活性降低 。
• 酶活性单位：用大写字母“U”表示。
– 1个单位：1min将1µmol的底物转化为产物的酶量。
β-半乳糖苷酶（β-Gal）
• 来源和性质
– 来源：大肠埃希菌的四聚体蛋白 – 分子量540 kD，最适pH=6.0~8.0
• 底物
• 常用底物：4-甲伞形酮-β-D半乳糖苷→ 4-甲基伞形酮（荧 光物质）
• 灵敏度高于HRP系统，需荧光仪。常用于均相酶免疫测定
二、酶标记抗体或抗原
• 酶标记抗体或抗原
双功能交联剂分类：同源（戊二醛）和异源。 分为一步法和两步法。
改良过碘酸钠法：通过化学物质（过碘酸钠）活 化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。常用 于HRP标记抗原或抗体。
戊二醛交联法：一步法
定义：抗体（抗原）、酶和戊二醛同时发生反应。 优点：操作简单，可用于HRP、ALP标记。 缺点：酶标记物的产率低，标记物易聚合，可发生 酶与酶，抗体与抗体之间的交联。
• HRP的抑制剂
– 强酸（反应终止剂）、氧化物、硫化物、叠氮化物 （样品不用NaN3防腐）
• HRP优点
– 易于提取，价格低廉，性质稳定，易保存，与抗原 抗体偶联后活性很少受影响，是ELISA中应用最广 泛的酶。
HRP的常用底物
• 催化反应式：DH2(供氢体)+ H2O2(受氢体) • 常用的供氢体(底物）：
优点：
灵敏度高、特异性强； 试剂稳定，操作简便快速； 对环境无污染; 适用范围广（医学、生物、环境）
第一节 酶免疫试验的组成要素
一、基本要素：酶和酶作用底物 （p42）
1.酶的要求
纯度高、活性强，催化反应的效率高：一个酶蛋白分子 每分钟可催化103~104个底物分子。
易与抗原或抗体结合，标记后酶活性保持稳定，且不影 响抗原抗体的反应性。
1.酶的要求
作用专一性，酶活性不受样品中其它成分影响，受检组织 或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或酶的抑制物。
有色产物易于判断或测量，方法简便易行、灵敏且重复 性好。
酶、辅助因子及其底物对人体和环境无害，酶的底物易 于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
2.常用酶及其底物
辣根过氧化酶（horseradish peroxidase, HRP）： 最常用
碱性磷酸酶
• ALP的底物： – 对硝基苯磷酸酯(p-PNP)。
405nm波长处有最高吸收峰
终止液：NaOH，产物吸光度增强，酶失活
• AP有发荧光底物（4-甲基伞形酮磷酸盐），可用于ELISA 作荧光测定 。
• AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记 物收率低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。
D+2H2O
邻苯二胺（OPD）：少用，显色应避光，致癌，不稳定，临配临用。
• HRP催化OPD：无色 （492nm）
橙红色
加终止液(H2SO4),棕黄色
四甲基联苯胺（TMB）：常用，无需避光，无致癌性，但水溶性差。
• HRP催化TMB: 无色
蓝色
加终止液(H2SO4),黄色（450nm）
2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS):缓慢氧化显色 （20min），避光，灵敏度低, 水溶性好。 • HRP催化ABTS：深蓝（蓝紫） ，加终止液(H2SO4)，绿色405nm
戊二醛交联法：二步法
定义: 过量戊二醛先与酶结合，不发生酶与酶之间的交联， 除去多余的未与酶结合的戊二醛，再加入抗体（抗原）形成酶 -戊二醛-抗体（抗原）结合物。
优点：酶标记物均一、酶标记效率较一步法高。
过碘酸钠法
NaIO４先将HRP表面的与酶活性无关的多糖羟基氧化成醛基， 然后再与Ig上的氨基相结合。本法常用于HRP的交联。
第九章 酶免疫试验 （enzyme immunoassay, EIA）
柏琴琴 baiqinqin1213@
酶免疫试验
酶标记技术 + 免疫技术
酶标记抗原或抗体 作为诊断试剂 保留免疫活性
与待测物发生抗原抗体反应
+底物
酶高效催化底物： 化学反应，颜色反应
产物进行吸光度的测定 实现对待测抗原或抗体的检测
NaIO4
NH2
NH2
Fe—E CH2OH + O ---->Fe— E CHO + H2O
NH2
NH2
Fe—E CHO + H2N-Ig ---> Fe—E C=N-Ig + H2O
H
+硼氢化钠
稳定的酶标记物
（二）酶标记抗体或抗原的纯化和鉴定
• 保有酶的催化活性和抗体（或抗原）的活性。 • 结合物有良好的稳定性。 • 标记方法简单、产率高、且重复性好。
制备酶结合物的方法
戊二醛交联法：以双功能交联剂为“桥”，分别 与酶和抗体（抗原）连接而形成结合物。
要求：交联剂至少含有两个可与蛋白质分子通过化 学反应而结合的反应基团。
HRP催化TMB
HRP催化
– 终止反应； –提高显色的稳定性，退色慢！以TMB为例
不加终止液：2小时内反应产物退色，蓝色产物 在450nm有最大吸收峰，但峰值较低
加终止液：反应产物变成黄色，在450nm处具有 最大吸收峰，峰值比蓝色产物峰值高。
–不同显色体系里可能使用的终止液不同（酸或碱）。
– 定义：通过化学反应将酶与抗体或抗原形成结合物 – 作用：酶免疫测定技术的核心组成部分，它的稳定性
决定EIA试剂盒的有效使用日期。
（一）酶标记抗体或抗原的制备 （p50）
• 抗原和抗体的要求：
• 抗原：纯度高，抗原性完整; • 抗体：效价高、亲和力强、特异性强，能批量生产，易于分
离纯化。常用单克隆抗体
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）： β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-Gal）
辣根过氧化酶（HRP）
• HRP的性质: • 主酶（糖蛋白）+ 辅基（亚铁血红素）蔬菜作物辣根中含 量很高。 • 最高吸收峰:主酶(275nm)与酶活性无关；辅基(403nm)酶活 性基团
• HRP的纯度： • 纯度数(Reinheit zahl, RZ)表示：A403/A275 • 用于标记的HRP, RZ ≥ 3.0。 • 仅表示辅基在HRP中的含量，RZ越大不意味着酶活性越高， 酶变性后RZ不变但活性降低 。
• 酶活性单位：用大写字母“U”表示。
– 1个单位：1min将1µmol的底物转化为产物的酶量。
β-半乳糖苷酶（β-Gal）
• 来源和性质
– 来源：大肠埃希菌的四聚体蛋白 – 分子量540 kD，最适pH=6.0~8.0
• 底物
• 常用底物：4-甲伞形酮-β-D半乳糖苷→ 4-甲基伞形酮（荧 光物质）
• 灵敏度高于HRP系统，需荧光仪。常用于均相酶免疫测定
二、酶标记抗体或抗原
• 酶标记抗体或抗原
双功能交联剂分类：同源（戊二醛）和异源。 分为一步法和两步法。
改良过碘酸钠法：通过化学物质（过碘酸钠）活 化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。常用 于HRP标记抗原或抗体。
戊二醛交联法：一步法
定义：抗体（抗原）、酶和戊二醛同时发生反应。 优点：操作简单，可用于HRP、ALP标记。 缺点：酶标记物的产率低，标记物易聚合，可发生 酶与酶，抗体与抗体之间的交联。
• HRP的抑制剂
– 强酸（反应终止剂）、氧化物、硫化物、叠氮化物 （样品不用NaN3防腐）
• HRP优点
– 易于提取，价格低廉，性质稳定，易保存，与抗原 抗体偶联后活性很少受影响，是ELISA中应用最广 泛的酶。
HRP的常用底物
• 催化反应式：DH2(供氢体)+ H2O2(受氢体) • 常用的供氢体(底物）：
优点：
灵敏度高、特异性强； 试剂稳定，操作简便快速； 对环境无污染; 适用范围广（医学、生物、环境）
第一节 酶免疫试验的组成要素
一、基本要素：酶和酶作用底物 （p42）
1.酶的要求
纯度高、活性强，催化反应的效率高：一个酶蛋白分子 每分钟可催化103~104个底物分子。
易与抗原或抗体结合，标记后酶活性保持稳定，且不影 响抗原抗体的反应性。
1.酶的要求
作用专一性，酶活性不受样品中其它成分影响，受检组织 或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或酶的抑制物。
有色产物易于判断或测量，方法简便易行、灵敏且重复 性好。
酶、辅助因子及其底物对人体和环境无害，酶的底物易 于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
2.常用酶及其底物
辣根过氧化酶（horseradish peroxidase, HRP）： 最常用
碱性磷酸酶
• ALP的底物： – 对硝基苯磷酸酯(p-PNP)。
405nm波长处有最高吸收峰
终止液：NaOH，产物吸光度增强，酶失活
• AP有发荧光底物（4-甲基伞形酮磷酸盐），可用于ELISA 作荧光测定 。
• AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记 物收率低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。
D+2H2O
邻苯二胺（OPD）：少用，显色应避光，致癌，不稳定，临配临用。
• HRP催化OPD：无色 （492nm）
橙红色
加终止液(H2SO4),棕黄色
四甲基联苯胺（TMB）：常用，无需避光，无致癌性，但水溶性差。
• HRP催化TMB: 无色
蓝色
加终止液(H2SO4),黄色（450nm）
2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS):缓慢氧化显色 （20min），避光，灵敏度低, 水溶性好。 • HRP催化ABTS：深蓝（蓝紫） ，加终止液(H2SO4)，绿色405nm
戊二醛交联法：二步法
定义: 过量戊二醛先与酶结合，不发生酶与酶之间的交联， 除去多余的未与酶结合的戊二醛，再加入抗体（抗原）形成酶 -戊二醛-抗体（抗原）结合物。
优点：酶标记物均一、酶标记效率较一步法高。
过碘酸钠法
NaIO４先将HRP表面的与酶活性无关的多糖羟基氧化成醛基， 然后再与Ig上的氨基相结合。本法常用于HRP的交联。
第九章 酶免疫试验 （enzyme immunoassay, EIA）
柏琴琴 baiqinqin1213@
酶免疫试验
酶标记技术 + 免疫技术
酶标记抗原或抗体 作为诊断试剂 保留免疫活性
与待测物发生抗原抗体反应
+底物
酶高效催化底物： 化学反应，颜色反应
产物进行吸光度的测定 实现对待测抗原或抗体的检测
NaIO4
NH2
NH2
Fe—E CH2OH + O ---->Fe— E CHO + H2O
NH2
NH2
Fe—E CHO + H2N-Ig ---> Fe—E C=N-Ig + H2O
H
+硼氢化钠
稳定的酶标记物
（二）酶标记抗体或抗原的纯化和鉴定
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临床免疫学与检验课件：章酶免疫技术
特點：
➢靈敏度高、特異性強、 準確性好 ➢酶標記試劑能夠較長時 間保持穩定 ➢操作簡便、對環境沒有 污染。 ➢易與其它技術偶聯 衍生出適用範圍更廣的
新方法。
一、酶和酶作用底物
標記酶的要求：
活性高 性質穩定 專一性強 酶催化底物的顯色信號易於判斷和測量 方法敏感，重複性好，簡單易行 酶的底物易於配製保存，酶及底物價廉
4、加酶標抗體 無抗原結合， 加底物不顯色
-
第四節 酶免疫測定的應用
均相酶免疫測定主要用於藥物和小分 子物質的檢測。非均相免疫測定中的 ELISA 應 用 更 為 廣 泛 ， ELISA 廣 泛 用 於傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎 （甲肝抗體、“乙肝三對”、丙肝抗 體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風疹病 毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細菌如 結核桿菌、幽門螺桿菌等。也用於一 些蛋白質檢測，如各種免疫球蛋白、 補體、腫瘤標誌物（甲胎蛋白、癌胚 抗原、前列腺特異性抗原等）。
克隆酶供體免疫分析 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
EMIT示意圖
CEDIA示意圖
二、非均相酶免疫測定
與均相不同 之處
需分離游離與結合的酶標記物
➢ 分類：液相酶免疫測定 固相酶免疫測定
以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯免疫吸 附試驗（ELISA） 是目前最為常用的固相酶免 疫測定
純化及鑒定
標記完成後應除去反應液中的游離酶、 游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體 或抗原聚合物，避免游離酶增加非特 異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭 作用而降低特異性染色強度
常用的純化方法：
葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純 化
50%飽和硫酸銨沉澱提純
三、固相載體
酶免疫测定技术PPT课件
测食品中的残留农药：迄今为止，应用ELISA检测食品中的残留农药主要是除 草剂、杀菌剂和杀虫剂。ELISA 法测定农药残留以其特异性强、灵敏度高及 快速准确而得到广泛的应用，尤其是现场控制水果、蔬菜、食品中的农药残 留，对发展无污染农产品，保障人体健康起到积极作用。
检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确 可靠，比常规方法缩短了 3~4ｄ，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。
ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。
ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。
编辑版ppt
18
一、治疗药物监测一药物血浓度测定 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、
N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。 测定方法亦系以阴性、低、编辑版中ppt等三种浓度的标准品作对照19 比较, 以测算样本中存在的药物量。
检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确 可靠，比常规方法缩短了 3~4ｄ，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。
ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。
ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。
编辑版ppt
18
一、治疗药物监测一药物血浓度测定 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、
N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。 测定方法亦系以阴性、低、编辑版中ppt等三种浓度的标准品作对照19 比较, 以测算样本中存在的药物量。
临床免疫学检验技术PPT(共64页)
临床免疫学检验技术
• 江西省胸科医院：熊国亮
一、概述
• 免疫学检验是研究免疫学技术及其在医学 检验领域应用的一门学科。免疫检验技术 则重点阐述各类免疫学技术的基本原理、 方法类型和临床应用。19世纪末相继建立 了凝集试验、沉淀试验和补体结合试验等 三大经典血清学试验，用于检测病原微生 物的抗原或抗体对传染病的诊断起到重要 作用。
三、酶联免疫吸附试验（enzy发展，放射 免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术、 化学发光免疫技术、流式细胞免疫分析技 术等免疫标记技术应用于临床免疫学检验， 加快了免疫学检验的自动化、标准化进程， 极大地提高了免疫学检验的灵敏度，拓展 了免疫学检测范围，从检测免疫相关物质 （抗原、抗体、补体、免疫活性细胞和细 胞因子等）到检测体液中的微量物质（激 素、酶、血浆微量蛋白、血药浓度、微量 元素等）。
三、酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）
• 此法常用多孔聚苯乙烯反应板作为固相载 体，读取结果需用酶标仪。标记抗原或抗 体所用的酶常选择辣根过氧化物酶（HRP）、 碱性磷酸酶（AP）等，HRP常用的底物有 邻苯二胺（OPD）或四甲基联苯胺 （TMB），碱性磷酸酶一般采用对硝基苯 磷酸酯（P-NPP）作为底物，产物为黄色的 对硝基酚，在405nm波长处有最高吸收峰。
二、免疫检验技术在临床免疫学 检验的应用
• 3.免疫球蛋白、循环免疫复合物和补体的测 定 包括测定五类免疫球蛋白的含量、血清 总补体活性及补体成分的含量和在多种疾 病时血清中升高的循环免疫复合物。
二、免疫检验技术在临床免疫学 检验的应用
• 4. 细胞免疫相关指标测定 检测淋巴细胞亚 群和淋巴细胞的功能以及白细胞介素—2等 多种细胞因子，用于判断机体细胞免疫功 能状况。
• 江西省胸科医院：熊国亮
一、概述
• 免疫学检验是研究免疫学技术及其在医学 检验领域应用的一门学科。免疫检验技术 则重点阐述各类免疫学技术的基本原理、 方法类型和临床应用。19世纪末相继建立 了凝集试验、沉淀试验和补体结合试验等 三大经典血清学试验，用于检测病原微生 物的抗原或抗体对传染病的诊断起到重要 作用。
三、酶联免疫吸附试验（enzy发展，放射 免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术、 化学发光免疫技术、流式细胞免疫分析技 术等免疫标记技术应用于临床免疫学检验， 加快了免疫学检验的自动化、标准化进程， 极大地提高了免疫学检验的灵敏度，拓展 了免疫学检测范围，从检测免疫相关物质 （抗原、抗体、补体、免疫活性细胞和细 胞因子等）到检测体液中的微量物质（激 素、酶、血浆微量蛋白、血药浓度、微量 元素等）。
三、酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）
• 此法常用多孔聚苯乙烯反应板作为固相载 体，读取结果需用酶标仪。标记抗原或抗 体所用的酶常选择辣根过氧化物酶（HRP）、 碱性磷酸酶（AP）等，HRP常用的底物有 邻苯二胺（OPD）或四甲基联苯胺 （TMB），碱性磷酸酶一般采用对硝基苯 磷酸酯（P-NPP）作为底物，产物为黄色的 对硝基酚，在405nm波长处有最高吸收峰。
二、免疫检验技术在临床免疫学 检验的应用
• 3.免疫球蛋白、循环免疫复合物和补体的测 定 包括测定五类免疫球蛋白的含量、血清 总补体活性及补体成分的含量和在多种疾 病时血清中升高的循环免疫复合物。
二、免疫检验技术在临床免疫学 检验的应用
• 4. 细胞免疫相关指标测定 检测淋巴细胞亚 群和淋巴细胞的功能以及白细胞介素—2等 多种细胞因子，用于判断机体细胞免疫功 能状况。
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第九章酶免疫技术
第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
一、酶和酶作用底物（一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物。
用于标记的酶应符合：1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。
用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。
4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）：目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛的标记用酶。
由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。
辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ（HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值）表示，RZ值应大于3.0。
RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。
酶活性以单位U表示：即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。
酶变性后，RZ值不变但活性降低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。
2.碱性磷酸酶（AP）：大肠杆菌来源的AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；小牛肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal来源于大肠杆菌。
因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定。
免疫酶技术 ppt课件
2.用金标记免疫法（斑点免疫 层析试验）检测HCG的原理
(酶免疫测定法)
固相载体 聚苯乙烯
Ag 或 Ab 吸 附 到 固 相 载体上的过程,称为 包被
实验中所需酶标抗体的制备方法 同荧光抗体制备：
纯化后的抗体+酶 透析去除游 离酶 测定酶标抗体工作浓度
试验中有关术语及试剂：
包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相
载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后， 不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB
（二）酶标光度仪检测A492值
（吸光率）：比色法
1.与阳性、阴性对照测定值比较 2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0 为阴性
P: positive（待测吸光度值） N: negative
四.ELISA试验的影响因素
（一）固相载体
常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸 附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。
缺点:
1.影响因素多,多方把关 2.偶有假阳性、假阴性
六.膜载体的酶免疫测定
（一） 斑点-ELISA
特点:
1. 固相载体为硝酸纤维素膜 2.酶促反应后在膜上形成有色沉淀物
固相Ag
（二）免疫印迹法
(immunoblotting test,IBT)
七. 应 用 (包括所有标记技术)
(一)病原体的诊断及研究
固相载体：酶标板 可分软、硬板 一次性使用，不可回收
酶标板要求：
•吸附性能好、空白值低、透明度高 •板批间、孔间性能相近
（二）抗原、抗体
Ag：需纯化 Ab：需效价高、亲和力强、纯化
（三）试验条件
1.包被：
一般用pH 9.6 CB(carbonate buffer)，0.05M, 有利于蛋白质吸附
(酶免疫测定法)
固相载体 聚苯乙烯
Ag 或 Ab 吸 附 到 固 相 载体上的过程,称为 包被
实验中所需酶标抗体的制备方法 同荧光抗体制备：
纯化后的抗体+酶 透析去除游 离酶 测定酶标抗体工作浓度
试验中有关术语及试剂：
包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相
载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后， 不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB
（二）酶标光度仪检测A492值
（吸光率）：比色法
1.与阳性、阴性对照测定值比较 2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0 为阴性
P: positive（待测吸光度值） N: negative
四.ELISA试验的影响因素
（一）固相载体
常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸 附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。
缺点:
1.影响因素多,多方把关 2.偶有假阳性、假阴性
六.膜载体的酶免疫测定
（一） 斑点-ELISA
特点:
1. 固相载体为硝酸纤维素膜 2.酶促反应后在膜上形成有色沉淀物
固相Ag
（二）免疫印迹法
(immunoblotting test,IBT)
七. 应 用 (包括所有标记技术)
(一)病原体的诊断及研究
固相载体：酶标板 可分软、硬板 一次性使用，不可回收
酶标板要求：
•吸附性能好、空白值低、透明度高 •板批间、孔间性能相近
（二）抗原、抗体
Ag：需纯化 Ab：需效价高、亲和力强、纯化
（三）试验条件
1.包被：
一般用pH 9.6 CB(carbonate buffer)，0.05M, 有利于蛋白质吸附
初级检验士考试(临床免疫学和免疫检验)讲义第九章酶免疫技术
第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点第二节酶免疫技术的分类第三节酶联免疫吸附试验第四节酶免疫测定的应用第一节酶免疫技术的特点酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。
它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性。
在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
它通过利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高了抗原抗体反应的敏感性。
一、酶和酶作用底物（一）酶的要求1、酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2、易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3、作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。
4、酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5、酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）HRP来源于蔬菜植物辣根中，分子量40kD，是由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。
辅基是酶活性基团，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶则与酶活性无关，最大吸收峰在275nm。
2.碱性磷酸酶（AP）AP是一种磷酸脂水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜提取，但两种来源的AP理化性质有所不同：菌源性AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）β-Gal来源于大肠杆菌，分子量540kD，最适pH6～8。
因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定中。
酶免测定技术ppt课件
Ap不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色
ß-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光
4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法
二、反应条件的选择 1. 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标
二抗，取OD=0.8度、时间等
包被缓冲液、包被方法 ⑵ 封闭：包被后在用1~5%小牛血清白蛋白再包
被，以消除非特异吸附的干扰。
㈡ 酶结合物：
1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性 强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。
2. ELISA常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 酶的底物：
HRP可溶性底物及呈色：
邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)
荧光素 酶标记 等等 ⑵按检测对象分类：免疫组织化学技术
免疫测定技术
酶免疫测定技术
概述：
1.酶免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂 抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗 体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种 免疫技术，称为酶标记免疫技术。
2.分类：酶免疫组化 酶免疫测定 均相法
异相法 固相酶免疫测定
4. 三、操作标准化 5. 1 加样 6. 2 保温 7. 3 洗涤 8. 4 比色 9.
四、影响ELISA测定的因素：
1 试剂盒因素 2 实验操作中的影响
试剂盒因素：
A 固相材料：孔间不均 B 抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成
(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗 原(与片段的选择和制备水平有关) C 酶结合物 D 色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)
双波长比色不需设空白： OD=OD450nm-OD630nm
ß-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光
4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法
二、反应条件的选择 1. 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标
二抗，取OD=0.8度、时间等
包被缓冲液、包被方法 ⑵ 封闭：包被后在用1~5%小牛血清白蛋白再包
被，以消除非特异吸附的干扰。
㈡ 酶结合物：
1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性 强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。
2. ELISA常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 酶的底物：
HRP可溶性底物及呈色：
邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)
荧光素 酶标记 等等 ⑵按检测对象分类：免疫组织化学技术
免疫测定技术
酶免疫测定技术
概述：
1.酶免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂 抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗 体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种 免疫技术，称为酶标记免疫技术。
2.分类：酶免疫组化 酶免疫测定 均相法
异相法 固相酶免疫测定
4. 三、操作标准化 5. 1 加样 6. 2 保温 7. 3 洗涤 8. 4 比色 9.
四、影响ELISA测定的因素：
1 试剂盒因素 2 实验操作中的影响
试剂盒因素：
A 固相材料：孔间不均 B 抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成
(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗 原(与片段的选择和制备水平有关) C 酶结合物 D 色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)
双波长比色不需设空白： OD=OD450nm-OD630nm
免疫学检验-9-酶免疫技术
的抗原检测。 当待测抗原相当高时，出现“钩状现象”
（hook effect)，导致结果偏低。
（三）间接法：测抗体最常用的方法
原理：为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受
检抗体，故称为间接法。常用于HCV抗体、HIV抗体和梅 毒螺旋体抗体等的测定。
待测抗体
酶标抗抗体
固相抗原
底物 阳性结果： 显色
（一）固相载体
要求:
具有较强的吸附蛋白质性能；吸附力强。 Ag或Ab吸附其上后保留原来的免疫活性；不影响免
疫反应性。 固相载体在酶免疫测定过程中作为吸附剂和容器，
不参与化学反应。 固化方法简便易行、快捷经济。
（一）固相载体
均相：酶标抗原+非标记抗原+限量抗体，酶标记物 发生抗原抗体反应后，酶活性减弱或增强。
异相：反应后，分离形成复合物的酶标记物并检测。 根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分为液相 和固相。
液相：待测抗原+酶标抗原+抗体，一次性温育 待测抗原+抗体，温育，加酶标抗原，温育
固相：固相载体预先吸附抗原或抗体，在其表面反应
概述
检测方法：肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度 计、酶标仪等。
可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位， 或在μg、甚至ng水平上对其进行定量。
特点：灵敏度高、特异性强、准确性好、适用范围广。 酶标记试剂能够较长时间保持稳定，操作简便、对环 境没有污染，易与其它技术偶联衍生出适用范围更广 的新方法。
抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。如： 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等。 所用两种抗体针对同一个抗原分子的相同抗原 决定簇。
（二）双位点一步法
（hook effect)，导致结果偏低。
（三）间接法：测抗体最常用的方法
原理：为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受
检抗体，故称为间接法。常用于HCV抗体、HIV抗体和梅 毒螺旋体抗体等的测定。
待测抗体
酶标抗抗体
固相抗原
底物 阳性结果： 显色
（一）固相载体
要求:
具有较强的吸附蛋白质性能；吸附力强。 Ag或Ab吸附其上后保留原来的免疫活性；不影响免
疫反应性。 固相载体在酶免疫测定过程中作为吸附剂和容器，
不参与化学反应。 固化方法简便易行、快捷经济。
（一）固相载体
均相：酶标抗原+非标记抗原+限量抗体，酶标记物 发生抗原抗体反应后，酶活性减弱或增强。
异相：反应后，分离形成复合物的酶标记物并检测。 根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分为液相 和固相。
液相：待测抗原+酶标抗原+抗体，一次性温育 待测抗原+抗体，温育，加酶标抗原，温育
固相：固相载体预先吸附抗原或抗体，在其表面反应
概述
检测方法：肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度 计、酶标仪等。
可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位， 或在μg、甚至ng水平上对其进行定量。
特点：灵敏度高、特异性强、准确性好、适用范围广。 酶标记试剂能够较长时间保持稳定，操作简便、对环 境没有污染，易与其它技术偶联衍生出适用范围更广 的新方法。
抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。如： 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等。 所用两种抗体针对同一个抗原分子的相同抗原 决定簇。
（二）双位点一步法
临床检验免疫学酶免疫技术课件
常用的供氢体(底物）： 邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）:反应显橙黄
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的 酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记 Ag（Ab）的浓度成反比
四）捕获法(capture ELISA )：
主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法
原理：
（三) 结果分析：
1、定性
• 间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关
4℃过夜
弃包被液，PBS清洗
保存备用。
三）封闭(blocking)
1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程
2、常用的封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白
二、酶免疫技术分类
Ag-E + Ab E-Ag Ab + Ag-E
EE
E
E
三、酶联免疫吸附试验
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
待测抗原或抗体量与产物量呈负相关
基本原理
测定抗原:
测定抗体
特点：
用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对 抗体进行测定
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是 固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与 非标记Ag（Ab）的分子数量和
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的 酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记 Ag（Ab）的浓度成反比
四）捕获法(capture ELISA )：
主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法
原理：
（三) 结果分析：
1、定性
• 间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关
4℃过夜
弃包被液，PBS清洗
保存备用。
三）封闭(blocking)
1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程
2、常用的封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白
二、酶免疫技术分类
Ag-E + Ab E-Ag Ab + Ag-E
EE
E
E
三、酶联免疫吸附试验
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
待测抗原或抗体量与产物量呈负相关
基本原理
测定抗原:
测定抗体
特点：
用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对 抗体进行测定
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是 固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与 非标记Ag（Ab）的分子数量和
9第9章酶免疫技术-PPT精品文档52页
酶标记物稳定 ，不形成聚合物
酶标记抗体或抗原
制备方法
过碘酸钠法（直接法）
常用于HRP标记抗体或抗原
戊二醛交联法
酶标记抗体或抗原
戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别 与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法 有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。
酶标记抗体或抗原
纯化及鉴定
标记完成后应除去反应液中的游离 酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以 及抗体或抗原聚合物，避免游离酶 增加非特异显色，以及游离抗体或 抗原起竞争作用而降低特异性染色 强度
常用的纯化方法： 葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层 析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯
三、固相载体
固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面
酶和酶作用底物
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
常用酶
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位U比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
纯度用RZ(纯度数)值： 403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD(吸光度)值之比
ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
优点
酶和酶作用底物
常用底物
邻苯二胺 OPD
四甲基联苯胺 TMB HRP的常见底物
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并 噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。