小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
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小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。
1. 实验材料与试剂
剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%，0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2
恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等
试剂配比：
(1) DMEM 10:10:1
DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)
(2) DMEM 5:5:1
DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S
(3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS（DMEM/F12无血清培养基+生长因子）
25μg/ml转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1μg/ml putrescine（腐胺），5μg/ml胰岛素， 20 nM hydrocortisone（氢化可的松），20 nM
progesterone（孕激素），1％P / S+生长因子（5ng/ ml的血小板衍生生长首钢迁钢二期110kv变电站工程
页脚内容 因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF）胰蛋白酶/ EDTA溶液0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSS DMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM
progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml
bFGF) Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o
Ca2+/Mg2+
Laminar flow hood Dissecting magnifying glass Water bath at 37ºC
Humidified tissue culture incubator (37ºC, 5% CO2) Sterilized microdissecting
instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine
Dumont forceps Orbital Shaker (Boeco OS 20) Tabletop centrifuge 50
ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004) T75 cm2 tissue culture flasks
with plug-seal (BD Falcon, 137787) Tissue culture plates (Falcon) Petri
dishes (Sterilin) 30 μm sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech)
2.实验步骤
2.1星形胶质细胞的混合培养
取新生SD小鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后首钢迁钢二期110kv变电站工程
页脚内容 剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平,
1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO2 恒温细胞培养箱( 37度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
2.2星形胶质细胞的分离和纯化
将培养于培养瓶中的混合胶质细胞上清弃去，用0.01mol/L PBS 洗2遍。用无血清培养基0.25%胰酶6 mL 加入培养瓶，37℃ 消化15 min 左右，至镜下观察到大部分星形细胞脱落，将含有星形胶质细胞的消化液立即置于等量含10% FBS
DMEM/F12培养基中止消化，1000 r/ min离心5 min，再用PBS 洗2 遍后，重悬于含10% FBS DMEM/F12 培养基中，种于培养瓶中; 将培养瓶置于37℃细胞培养箱稳定贴壁1 d 后，再用37℃恒温定轨摇床，200 r/min 振摇2 h;吸取上清液弃去(其中主要包括一些小胶质细胞和部分少突胶质细胞) ，贴壁细胞采用0.
25% 胰酶37℃ 消化后立即置于含10% FBS DMEM/F12 培养基中，终止消化后,1000 r/ min离心5 min，弃上清，将沉淀细胞重悬于含10%FBS的DMEM/F12 培养基，计数后调整细胞密度106 /孔接种于6 孔培养板中，稳定24 h 后可用于后续实验。
2.3星形胶质细胞的免疫细胞化学染色鉴定 首钢迁钢二期110kv变电站工程
页脚内容 本实验建议选择OX42作为小胶质细胞的标志物, 能同时反映小胶质细胞的激活状态，以OX42抗小鼠CD11b/c抗体免疫荧光染色法鉴定星形胶质细胞。
具体步骤:
(1)待小胶质细胞长成片后, 取出盖玻片, 依次用PBS液清洗3次,每次5 min, 冰丙酮固定15 min, 干燥5 min, PBS漂洗3 次;
(2)特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37℃孵育60min，进行抗体标记。
(3)洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次/15 分钟，晾干。
(4)加入荧光标记抗体，37℃孵育30min。1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次/15 分钟，晾干。
(5)封片：封片剂封片。
(6)镜检：荧光显微镜下观察，胶质细胞包质呈现较强黄绿色荧光，细胞核周围尤其明显。
注意事项
1、选材注意选取新生小鼠（24h内）。取材过程尽可能保证无菌，尽量剔除脑膜及血管和海马部分。
2、注意尽可能消除脑组织表面的残血，避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。
3、应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。
4、严格控制胶质细胞培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。
5、关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。
实验中，可以酌情考虑是否包被。 首钢迁钢二期110kv变电站工程
页脚内容 6、传代培养细胞接种量为1×106 个（25 cm2 培养瓶），细胞倍增时间为36小时。细胞传代培养最佳为5-8代， 传代次数增加，细胞体积增大，细胞之间间隙增加，细胞贴壁牢固，传代消化时间会有所延长。
原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞（primary astrocytes）是从胶质细胞含量较高的组织（如大脑皮层）中分离得到的。其细胞培养方法如下：
1. 将新鲜脑组织剖出，用积聚素/液体软膜法（trypsin/liquid
membrane method）进行酶解，使得细胞可以分离开来。
2. 使用无菌生理盐水或DMEM/F12将细胞悬液进行洗涤，然后放置在含有足够营养物质的培养基中，如DMEM。
3. 放置的培养皿需放置在37摄氏度、5% CO2和95%空气的恒温箱内，以提供最适宜的环境和养分。
4. 在培养初期，需要添加适当比例的血清（如胎牛血清），以提供必要的生长因子以及细胞所需的其它营养物质。但在细胞数目增长到一定规模后，可将血清浓度逐步降低，以避免胎牛血清对实验结果的影响。
5. 定期更换培养基，以保证细胞在最佳的生长状态。
6. 如需进行实验或操作，需要将细胞从培养皿中移入滴定皿或其它相应容器中，并按照操作所需加入相应的药物或物质。
注意事项：
1. 在操作过程中需要尽可能避免对细胞的机械损伤，比如抽吸和强烈摇动。
2. 在移入滴定皿或其它操作容器时，需要注意细胞的密度，以避免过于稀疏或过于密集。
3. 在更换培养基、加药等操作时，需要十分温和，以避免对细胞造成伤害或死亡。
肝星状细胞分离培养及鉴定的试验方案
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源-于-网-络-收-集 肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分离培养及鉴定的试验方案
【试验原理】
在用循环灌注法去除肝胶原组织后,根据HSC内含富含脂滴,密度较轻,它与肝脏内其它细胞在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理,采用密度梯度离心方法(连续性和非连续性两种)使HSC存在于 一高度提纯的区带中而得以分离。
【试验动物】
雄性清洁级Sprague-Dawsey大鼠（购自浙江省实验动物中心,合格证号：）,体重400～500g,常规饲料喂养,正常饮水,在分离HSCs前2周每天Vitamin A以200IU/100g灌胃。
【试剂与仪器】
主要试剂
Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶(Pronase E)、Nycodenz均为美国Sigma公司产品,DNA酶I(Dnase I)、DMEM培养干粉(高糖型)为Gibco公司产品,鼠抗人Desmin抗体SP试剂盒为福州迈新生物工程公司产品,其它试剂均为国产分析纯试剂。
主要仪器设备
蠕动恒流泵、超净工作台(2台)、电子分析天平、超速低温离心机、二氧化碳培养箱、多功能动物手术台等。
【试验方法】
1、肝星状细胞的分离制备
1）肝星状细胞的分离采用改良的Friedman方法,大鼠术前禁食12～16h,自由饮水。
2）用1％戊巴比妥钠40mg/kg 腹腔内注射麻醉大鼠。
3）胸腹部皮肤消毒,移入超净工作台中。沿腹部正中线剪开腹腔,分离下腔静脉及门静脉,在门静脉距肝外10mm处用眼科剪斜形剪一小口,迅速插入自制血管插管,结扎固定。
4）接通恒流蠕动泵,灌注预热37℃的D-Hank’s肝脏灌流液,剪开下腔静脉,此时可见灌流液自下腔静脉流出,肝脏逐渐饱满,由紫红色逐渐变成淡黄白色。
5）游离肝脏,保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。将游离之肝脏置于平皿中,灌注预热37℃的含酶Hank’s液I(含0.05％的胶原酶、0.1),并将灌注系统进液端放入平皿中,使流出的酶液可进行循环灌流,可见肝脏变软无弹性,肝包膜下出现小液泡。
星形胶质细胞传代步骤
星形胶质细胞传代步骤
星形胶质细胞是中枢神经系统中的一种神经胶质细胞，主要功能包括提供支持和保护神经元、调节外界环境、参与神经元的代谢等。传代是细胞培养中常见的操作，用于维持细胞系的稳定和扩增。以下是星形胶质细胞传代的一般步骤：
1. 收集细胞，首先需要将原始的星形胶质细胞培养物收集起来，可以通过细胞培养皿中的离心或者洗涤的方式将细胞收集到一起。
2. 细胞计数，使用显微镜或自动细胞计数仪器对收集到的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
3. 离心沉积，将细胞培养物进行离心，以沉淀细胞并去除培养液中的废旧培养基和代谢产物。
4. 细胞重悬，将离心沉积后的细胞用新的培养基重悬，使细胞得到充分的营养和生长条件。
5. 稀释传代，根据需要，将细胞按照一定比例进行稀释，然后接种到新的培养皿中，使细胞得到更多的生长空间。
6. 细胞培养，将接种好的细胞培养在恰当的培养条件下，包括适当的温度、湿度和培养基成分，以促进细胞的生长和分裂。
7. 细胞观察，在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长情况，确保细胞处于良好的状态。
8. 重复传代，根据需要，可以重复以上步骤进行多次传代，以扩增细胞数量或者维持细胞系的稳定。
总的来说，星形胶质细胞的传代步骤包括细胞收集、计数、离心沉积、重悬、稀释传代、培养和观察等环节。在进行传代操作时，需要严格控制培养条件和操作技术，以确保细胞的健康生长和稳定传代。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法
原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：
1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。
2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。
3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。
4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。
5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。
6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。
7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。
8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。 9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。
10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
注意事项：
取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。
操作时要小心，避免损伤组织。
使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。
培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。
培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。
在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。
以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。
8_9个月SD大鼠小胶质细胞的纯化分离培养
#论 著#
8-9个月SD大鼠小胶质细胞的纯化分离培养
耿 慧 钟 远
=摘要> 目的 建立培养8-9个月SD大鼠大脑皮层小胶质细胞的方法。方法 以McCarthy的方法为
基础,并加以改进,采用振摇结合贴壁分离法纯化小胶质细胞;CD11b免疫细胞化学染色对纯化的小胶质细胞
纯度进行鉴定;相差显微镜下进行细胞形态观察和细胞计数;CCK-8比色法检测纯化的小胶质细胞在不同时
间点的活力和增殖。结果 培养的8-9个月SD大鼠大脑皮层小胶质细胞,纯度达到95%,培养过程中未出
现明显的增殖。结论 8-9个月SD大鼠大脑皮层的小胶质细胞在体外亦可成功培养,为小胶质细胞在老年
疾病中的研究奠定了基础的。
=关键词> 小胶质细胞;细胞培养;衰老;阿尔茨海默病
中图分类号:R331 文献标识码:A 文章编号:1006-351X(2010)02-0152-03
Theprimaryculturemethodforisolationofmicrogliafrom8-9monthrats GENGHui,ZHONGYuan.
DepartmentofGerontism,theSixthPeoples'HospitalofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200233,China
Correspondingauthor: ZHONGYuan,Emai:lzhongyuan60@
=Abstract> Objective Tosetupaneasyandeffectivemethodforprimarycultivateandpurificationofthe
microgliacells.Methods BasedonclassicalmicrogliaprimaryculturemethodofMcCarthy,andweimprovedthis
method.Inthelaterpurificationphaseofcellcultivation,microgliaswereparallyoperatedandcultivatedwith
小鼠原代肝细胞分离培养
小鼠原代肝细胞分离培养
准备材料
1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；
2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；
3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；
4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；
5.无菌100mL广口玻璃瓶；
6.无菌50mL锥形管；
7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；
8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；
9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；
10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；
11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；
12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；
13.口罩；
14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；
15.动物操作台；
16.胶带。
分离试剂
1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；
2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；
3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；
4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；
小鼠原代神经元提取
小鼠原代神经元提取
1. 背景介绍
小鼠是神经科学研究中常用的实验动物，尤其是小鼠原代神经元是研究神经细胞生长、形态及功能的理想模型。提取小鼠原代神经元是展开这类研究的重要步骤。
2. 提取方法
2.1 原代神经元分离
将小鼠脑的皮层或海马区取出，用酶消化等方法分离出原代神经元。其中，较为常用的来源是阿霉素（Ara-C）处理后，剥离出菜花状星形胶质细胞后得到神经元。
2.2 细胞贴附
将原代神经元移植到附着于玻璃片或培养皿的细胞培养基中，使其附着并生长。
2.3 细胞培养
在培养基中加入营养物质，如神经生长因子、谷氨酸等，加速神经元的生长，并使组成更加丰富多彩。
2.4 细胞鉴定
通过标记染色、光镜观察等手段，检测培养出来的细胞是否为神经元。 3. 应用领域
小鼠原代神经元的提取及培养成为研究神经科学和神经元特性的重要手段。研究重点主要包括神经元的细胞膜特性、各种信号转导途径、神经元与神经胶质细胞之间的相互作用及神经元发育等问题。此外，还可运用于药理学研究、癫痫及脑防护药物的开发研究等。
4. 注意事项
提取方法中，对原代神经元的提取、分离及培养有许多细节问题，包括材料选择、酶消化时间调节、培养基添加条件等。在实验过程中，需要注意操作规范化、洁净化，并遵守实验室安全规范。
星形胶质细胞和少突胶质细胞培养
（二）星形胶质细胞
星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大，数量最多的一种，胞体呈星形，核大，呈卵圆形，染色质稀少，星形胶质细胞分两类，一类为原浆性星形胶质细胞（protoplasmic astrocyte），其突起短粗，分枝多。另一种为纤维性星形胶质细胞（fibrous astrocyte），它的突起细长，分枝少。纤维性星形胶质细胞是与少突胶质细胞源自同一前体细胞。星形胶质细胞具有多种功能，中枢神经系统内神经元及其突起间的空隙几乎全部由星形胶质细胞充填，起结构的支持作用，星形胶质细胞的突起构成血脑屏障，星形胶质细胞能摄取和代谢某些神经递质如γ-氨基丁酸等。调节局部神经递质的浓度，使神经网络能平稳地发挥作用。还能吸收细胞间隙中过多的K+，为K+的存储库，通过调节K+的水平而影响神经元的电生理活动。星形胶质细胞能合成和分泌大量神经营养因子，有维持神经元生存和促进神经元突起生长的作用，亦能分泌白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等多种细胞因子，星形胶质细胞有分裂能力，在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞增生、肥大，填补缺损，形成胶质瘢痕。
（1）方法和结果
选择出生 2 d 的SD大鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化(37℃
30min)后用培养液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的75cm2塑料培养瓶中, 种植密度为1×105 个细胞/cm2，每瓶10ml细胞悬液置。置36℃、10%CO2 培养箱中培养。每周换液2 次，培养10-14h，细胞分为两层，下一层为I型胶质细胞即原浆形胶质细胞，上一层是O-2A前体细胞，根据两类细胞贴壁能力的差异，以振荡培养技术进行分选，在37℃摇床上振荡，16 h（180r/min）O-2A前体细胞可被摇下来，摇下来的细胞种植在涂有鼠尾胶的75mcm2塑料培养瓶中，培养液使用20 % 胎牛血清促进O-2A前体细胞分化为II型胶质细胞即纤维型胶质细胞。可分裂增殖的原浆形胶质细胞和纤维型胶质细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。纯度鉴定可用胶质纤维酸性蛋白抗体（GFAP）染色确定。
原代小胶质细胞提取
原代小胶质细胞提取
简介
小胶质细胞是中枢神经系统中的一类非神经元细胞，主要起到支持和修复神经元的作用。提取原代小胶质细胞是进行相关研究的重要步骤之一，本文将详细介绍原代小胶质细胞提取的方法和步骤。
材料和仪器
• 新鲜解剖的小鼠或大鼠脑组织
• 离心管和离心机
• 细胞培养液（DMEM/F12等）
• 消化酶（如胰蛋白酶和DNA酶）
• 细胞培养皿或培养板
• 显微镜
• 血红蛋白溶解液
• 离心管和适当的离心速度
方法步骤
1. 将新鲜解剖的小鼠或大鼠脑组织置于含有细胞培养液的离心管中，并使用显微镜进行清洗和去除非脑组织部分。
2. 将脑组织放入含有消化酶的细胞培养液中，使用离心机在适当的温度和时间下进行消化。消化的时间和温度需要根据具体实验目的和消化酶的种类进行调整，一般情况下为37摄氏度下1-2小时。
3. 在消化过程中，每隔一段时间用吸管轻轻地反复吸取和释放溶液，以充分分散细胞和加速消化过程。
4. 消化完成后，用细胞培养液洗涤细胞多次，以去除消化酶和细胞碎片等杂质。
5. 将洗净的细胞转移至含有细胞培养液的细胞培养皿或培养板中，置于带有5%
CO2的恒温培养箱中进行培养。通常在37摄氏度下培养48-72小时。
6. 每隔一段时间观察培养皿或培养板中的细胞形态和数量，并进行必要的培养液更换。
7. 当细胞达到适当状态后，使用血红蛋白溶解液进行裂解，以释放胶质细胞内的胶质酸球。
8. 使用离心机将细胞裂解物离心，以去除细胞碎片和核酸等杂质。
9. 取得清除杂质的细胞裂解物，即可得到纯净的原代小胶质细胞。 结论
通过本文介绍的方法和步骤，可以提取到纯净的原代小胶质细胞，用于进一步的研究和实验。在进行实验前，需要根据具体实验目的和研究要求对提取步骤进行相应的调整和优化。同时，保持细胞培养的良好条件和适当的观察，有助于获得质量优良的小胶质细胞，为相关研究提供可靠的实验基础。
以上是关于原代小胶质细胞提取的详细步骤和方法介绍，希望对相关研究工作者有所帮助。
鼠肝星状细胞分离方法汇总
1、 大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总：
方法一雄性SD大鼠，体重400—500g。
[操作步骤]
1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝；
2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉；
3.以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；
4.以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03％Ⅱ型胶原酶5ml/min灌注3-4分钟；
5．取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10pug/ml。37℃5％C02孵箱内消化30分钟；
6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，对照管中加入等量培养液;
7.4℃ 800g平抛离心30分钟。吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次；
8.加入五血清RPMll640培养液，于37℃5％C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞悬液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培养。24小时后换液，此后每3天换液1次。
方法二：
[动物]
雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。
[操作步骤]
1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔；
2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37℃)，至肝细胞略显黄色；
3.链霉蛋白酶E溶液(0.02％)反复灌注10-20分钟(40—41℃)，胶原酶溶液反复灌注10-15分钟(40—4l℃)，至肝组织完全软化；
4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37~C下振荡消化20分钟，三层纱布过滤；
5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000r／min离心30分钟(20℃)；