2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑶油脂类供试品
• 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶 解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌 聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面 活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般 不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃），小心混合，若需要可在水浴中进 行，然后加入预热的稀释液使成 1∶10供 试液，保温，混合，并在最短时间内形成 乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面 活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。
– 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数 法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
• 菌数报告规则
– 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1 报 告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供 试品）,或﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培
养基，20～25℃，2～3 天 【10版：改良马丁（琼脂）培养基，23~28 ℃ ，24~48h】
黑曲霉 〔CMCC(F) 98 003〕
沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂
培养基 ，20～25℃，5～7天 ，或直接获得 丰富孢子 【10版：改良马丁琼脂斜面培养基，23~28 ℃ ，5~7天】
• 若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检 查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合 规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定 ，判供试品不符合规定。
3. MPN 法
– 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的 方法进行供试液制备和供试品接种，所有试 验管在30～35℃培养3～5 天，如果需要确 认是否有微生物生长，按方法适应性试验确 定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长 的管数，从表3查对每1g 或1ml 供试品中需 氧菌总数的最可能数。
1.5结果判断
菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2 ～8℃，可在24小时内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2 ～8℃，在验证过的贮存期内使用。
1.3.2计数培养基适用性检查【10版】
细菌计数
霉菌及酵母 菌计数
金黄色葡萄球菌 营养琼脂培养基
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌 黑曲霉
玫瑰红钠琼脂培养基
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
• 使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查 。若采用MPN 法，测定结果为需氧菌总数。
1.5结果判断
• 各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：
– 101cfu： 可接受的最大菌数为20； – 102cfu： 可接受的最大菌数为200； – 103cfu： 可接受的最大菌数为2000：依此类推。
– 常用的供试液制备方法如下。如果下列供试 液制备方法经确认均不适用，应建立其他适 宜的方法。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
微生物限度检查法
《中国药典》2015年版修订后将分为三个附录： – 1、非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 – 2、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 – 3、非无菌药品微生物限度标准
1.非无菌产品微生物限度检查： ----微生物计数法
1.1 总则：环境、要求 1.2 计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数法
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株
试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕
枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基
【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时
白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
• 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的 总菌落数（包括真菌菌落数）；
• 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
• 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌 和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可 使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡 萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红 钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
• 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动 检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定 的检查方法。
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑵ 水不溶性非油脂类供试品
• 取供试品， 用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。 分散力较差的供试品，可在稀释液中加入 表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供 试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供 试液进一步 10倍系列稀释。
简称MPN 法）。
– MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微 生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方 法。
• 供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准 等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品 量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否 符合规定。所选方法的适用性须经确认。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
或cm²）。
– 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量不大于100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平 均数的比值应在0.5-2 范围内，且菌落形态大小应与对 照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培 养基管比较，试验菌应生长良好。
10ml；膜剂为100cm²；贵重药品、微量包
装药品的检验量可以酌减。检验时,应从2 个 以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不 得少于4 丸,膜剂还不得少于4 片。 – 一般应随机抽取供试品，取规定容器数，混 合，取规定量供试品进行检验。
1.4.2供试品检 品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。
2. 薄膜过滤法
– 除另有规定外，按计数方法适用性试验确认 的方法进行供试液制备。取相当于1g、1ml 或10 cm²供试品的供试液，若供试品所含的 菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照 方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液 中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌 面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡 萄糖琼脂培养基上培养。
• 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基 用于测定需氧菌总数；
• 沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总 数。
• 阴性对照试验 – 以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，阴 性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌 生长，应进行偏差调查。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– 根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适 宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温 时,应均匀加热,且温度不应超过 45℃。供试 液从制备至加入检验用培养基,不得超过 1小 时。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。
药品的微生物限度检查
24～48h
紫红胆盐葡 萄糖平板
10-1
无菌落
18～24h
有菌落
报告未检出
10g/10ml/ 100cm2供试品
3.耐胆盐革兰阴性菌定量检查操作示意图
以TSB为稀释液制供试液
一定量 肠道增菌肉汤
20～25℃, 2h预增菌
1ml
24～48h
紫红胆盐 葡萄糖平板
报告结果
10-1
18～24h
（六）梭菌的检查
梭菌 增菌 培养 基
供试液的制备
书写检 验记录
哥伦比亚琼脂培养基分离
1.梭菌检查程序
无菌落生长
过氧化氢 酶试验
配培养基和稀释液
最终结果判断
有 菌 落
确证 试验
10g/10ml/ 100cm2供试品
2.供试品梭菌检查操作示意图
各10ml
分别接种
一份80℃保温10min后迅速冷却
10-2
10-31ml10-110-210-3
各管加1ml
查可能菌数表
9ml 稀 释 液
有/无菌落
（二）大肠埃希菌检查
大肠埃希菌作为检验供试品是否受粪便污染的指示菌。
2015年版《中国药典》规定经口及呼吸道服给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出大肠埃希菌。
TSB 增菌 培养
30℃～35℃
3～5d
1.平皿法
（1）基本程序：
数据 处理
结果观察与计数
书写检 验记录
平板 接种
需氧菌 的培养
供试液 的制备
配培养基和稀释液
倒置 培养 3～5d
30～35℃
TSA
不少于 0.1ml
2015版中国药典微生物限度解析
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
2015版中国药典纯化水微生物限度检测方法验证方案
2015版中国药典纯化⽔微⽣物限度检测⽅法验证⽅案1. 审批起草⼈签名：审核⼈签名：批准⼈签名：2. ⽬录1.审批 (1)2.⽬录 (2)3.⽬的 (3)4.范围 (3)5.职责 (3)6.执⾏程序 (4)7.描述 (4)8.⽅法验证 (4)8.1.⼈员培训 (4)8.2.⽂件确认 (5)8.3.仪器确认 (5)8.4.供试品确认 (6)8.5.培养基及缓冲液确认 (6)8.6.菌种确认 (7)8.7.培养基 (7)8.8.菌种：枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌。
(7)8.9.供试品制备 (8)8.10.试验结果 (9)8.11.验证结果分析与评价 (10)9.偏差处理 (10)10.变更控制 (10)11.附件⽇志 (11)12.再验证 (11)13.参考书⽬ (11)14.修订历史 (12)3. ⽬的纯化⽔微⽣物限度检查采⽤薄膜过滤法，验证该⽅法适⽤于纯化⽔中需氧菌总数的测定。
4. 范围本验证⽅案适⽤于上海XXXX有限公司QC实验室，对纯化⽔微⽣物限度检查⽅法（薄膜过滤法）适⽤性的验证。
5. 职责5.1. 验证⼩组组成：5.2. 验证⼩组组长负责5.2.1. 组织起草或审核验证⽅案及变更申请；5.2.2. 对验证⼩组成员进⾏培训；5.2.3. 验证⽅案的组织实施；5.2.4. 对验证过程中的记录审核，保证其真实性、可靠性和完整性；5.2.5. 组织验证报告的起草、汇总并参与对其进⾏审核及验证周期的拟定。
5.3. QA参与⼈员负责5.3.1. 审核验证⽅案、报告及报告中出现的偏差、变更；5.3.2. 参与验证⽅案的实施及评价；5.3.3. 对验证⽅案及报告进⾏编号并纳⼊验证⽂件系统且归档。
5.4. QC参与⼈员负责5.4.1. 起草验证⽅案；5.4.2. 已经批准的验证⽅案的具体实施；5.4.3. 收集测试数据，应评估数据并对测试数据做出评论；5.4.4. 参与偏差调查、变更申请等；5.4.5. 起草验证报告。
中国药典2015版 四部 9202 非无菌产品微生物限度检查指导原则
为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则110 7），特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低，甚至使药品丧失疗效，从而对患者健康造成潜在的危害。
因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节中，药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非无菌制剂及原料、辅料等是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料等微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原则将对微生物限度检查方法和标准中的特定内容及应用做进一步的说明。
1. 非无菌产品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。
2. 供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法，同时，所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
3. 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。
4. 进行微生物计数方法适用性试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，最高稀释级供试液的选择根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则而确定，如供试品应符合的微生物限度标准是lg需氧菌总数不得过10 3 cfu，那么最高稀释级是1：10 3 。
2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案
2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案佛山市华普生药业有限公司文件编码：TS-VP-4201-00页数：1/56 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC组签名：日期：审核部门：QC组签名：日期：部门：质量部签名：日期：批准质量负责人签名：日期：质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门：01 质量部下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
佛山市华普生药业有限公司文件编码：TS-VP-4201-00页数：2/56 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00 按GMP（2010年修订版）要求新制定2015.10.22佛山市华普生药业有限公司文件编码：TS-VP-4201-00页数：3/56 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制佛山市华普生药业有限公司文件编码：TS-VP-4201-00页数：4/56 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案9.验证报告会审佛山市华普生药业有限公司文件编码：TS-VP-4201-00页数：5/56 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。
参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。
2015年版中国药典 通则1105 非无菌产品微生物限度检査：微生物计数法
养 温 度 3 0 〜 3 5 C ， 3 5 X ：, 培 养 时 间 不 超 过
培 养 时 间 1 8 〜 24 3 天 ， 接 种 量 不 大 于
小时
100c£u
计数方法适用性试验
需氧菌总数计数
霉菌和酵母菌 总数计数
胰酪大豆胨琼脂培养 基或胰酪大豆胨液体培 养 基 （M P N 法 ）， 培 养 温 度 30〜 35°C, 培 养 时 间 不 超 过 3 天 ，接 种 量 不 大 于 lOOcfu
苗种及苗液制备 苗 种 试 验 用 菌 株 的 传 代 次 数 不 得 超 过 5 代 （从 菌 种 保 藏中心获得的干 燥 菌 种 为 第 0 代 ），并 采 用 适 宜 的 菌 种 保 藏 技 术进行保存，以 保 证 试 验 菌 株 的 生 物 学 特 性 。计 数 培 养 基 适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。 菌液 制 备 按 表 1 规 定 程 序 培 养 各 试 验 菌 株 。取 金 黄 色 葡萄球菌、铜 绿 假 单 胞 菌 、枯 草 芽 孢 杆 菌 、 白色 念珠菌 的新 鲜培养物，用 P H 7 .0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0 .9 % 无菌 氣化 钠 溶 液 制 成 适 宜 浓 度 的 菌 悬 液 ；取 黑 曲 霉 的 新 鲜 培 养 物 加 人 3〜5 m l含 0. 05% ( m l/m l) 聚 山 梨 酯 8 0 的 p H 7_0无 菌 氯 化 钠 -蛋 白胨 缓 冲 液 或 0 .9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 ，将 孢 子 洗 脱 。 然后，采 用 适 宜 的 方 法 吸 出 孢 子 悬 液 至 无 菌 试 管 内 ，用 含 0. 05%(m l/m l)聚 山 梨 酯 8 0 的 pH7. 0 无菌氣化钠-蛋白胨缓冲 液 或 0. 9%无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 适 宜 浓 度 的 黑 曲 霉 孢 子 悬 液 。 菌 液 制 备 后 若 在 室 温 下 放 置 ，应 在 2 小 时 内 使 用 ；若保 存 在 2〜8 * C ，可 在 2 4 小 时 内 使 用 。黑 曲 霉 孢 子 悬 液 可 保 存 在 2〜8 ° C , 在 验 证 过 的 贮 存 期 内 使 用 。 阴性对照 为 确 认 试 验 条 件 是 否 符 合 要 求 ，应 进 行 阴 性 对 照 试 验 ， 阴 性对照 试 验应 无菌 生 长。如 阴 性 对 照 有 菌 生 长 ，应进 行偏 差调查。 培养基适用性检査 微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配 制的培养基均应进行培养基适用性检查。 按 表 1 规 定 ，接 种 不 大 于 lOO cfu的 菌 液 至 胰 酪 大 豆 胨 液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼
2015版中国药典微生物限度
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
3. MPN 法
– 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的 方法进行供试液制备和供试品接种，所有试 验管在30～35℃培养3～5 天，如果需要确 认是否有微生物生长，按方法适应性试验确 定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长 的管数，从表3查对每1g 或1ml 供试品中需 氧菌总数的最可能数。
1.5结果判断
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。
– 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
中国药典2015版-微生物限度检查解析
菌种的传代、保藏与管理
控制程序
菌种来源
菌种的保 管
菌种的复 活
菌种确认
菌种的储 存和领用
菌种的销 毁及领用 记录
菌种传代、保存、使用及销售记录
菌种名称： 传 代 日 期 菌 种 来 源 菌种编号： 传 代 支 数 菌 种 生 长 培 养 基 培 养 温 度 时 间 保 存 温 度 保管人： 发 出 日 期 发 出 方 式 日期： 购 买 单 位
《中国药典》2015年版-微生物限度 标准修订解析
标准修订内容 修订思路1 《中国药典》2010年版一、二、三部限度标准的相关内容合 并。 修订思路2 参考EP7.0，USP35，JP X V标准，修订中国药典的微生物 限度标准。
标准修订内容
参考欧美日药典标准 <1>修订菌数标准表达方式： 指数形式10ncfu，最大可接受限度值遵守2倍规则： 101cfu： 可接受的最大菌数为 20； 102cfu： 可接受的最大菌数为 200； 103cfu： 可接受的最大菌数为 2000：依此类推。 <2>检查指标： 需氧菌总数：TAMC（替代细菌数）----胰酪大豆胨琼脂培养基 耐胆盐的格兰阴性菌（替代大肠菌群） <3>检查制剂分类： 齿龈、皮肤制剂 原辅料、中药提取物、中药饮片的控制 呼吸道制剂耐胆盐格兰阴性菌的控制
增加新概念
• • • • • 1.MPN法使用范围：含菌量较低的供试品细菌总数测定 2.“分散均匀”：并非一定要溶解 3.偏差调查概念引入 当检验结果出现超常或超标时需要进行偏差调查 调查范围：人、机、料、法、环
控制菌检查法修订解析
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法， 但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法---新增内 容
2015年版微生物限度检验操作规程.
青岛**有限公司文件目的建立微生物限度检查操作规程，规范操作，保证结果的准确性。
范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。
责任品管部微生物限度检验人员内容概述：本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。
微生物计数法一、计数方法1．微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表1。
4.2菌液制备按表1规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
表1 试验菌液的制备和使用4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
4.4培养基适用性检查按照表1规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
《中国药典》2015年版微生物测定修订情况
常州药检
一、微生物计数法
分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球 菌、枯草芽孢杆菌菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平 板，每一试验菌株平行制备2个平皿，30～35℃培养 不超过3天。同时，用相应的对照培养基代替被检培 养基进行上述试验。 分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌液至 胰酪大豆胨琼脂培养基平板，每一试验菌株平行制备 2个平皿，30～35℃培养不超过5天。同时，用相应 的对照培养基代替被检培养基进行上述试验。
常州药检
一、微生物计数法 计数培养基适用性检查
菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，不得超过5代。
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
取其新鲜培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。黑曲霉制 备时在缓冲液或氯化钠溶液中加入0.05%（v/v）聚山 梨酯80。 菌液在室温下2小时内使用，2～8℃时可在24h内使用， 黑曲霉孢子悬液可2～8℃保存，在验证过的贮存期内 使用。
MPN法
常州药检
一、微生物计数法
平皿法：包括倾注法和涂布法。每株菌每种培养基 至少制备2个平皿，以算术平均值计算。使用涂布 法应采用适宜的方法使培养基表面干燥，且每个 平皿接种的供试液不少于0.1ml。
常州药检
一、微生物计数法
薄膜过滤法：一般取相当于1g（ml、10cm2）的供试 品，（若供试品中所含的菌数较多时，供试液可 酌情减量）加至适量稀释液中，混匀，过滤。用 适量冲洗液冲洗。 每株菌每种培养基至少制备一张滤膜。 同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
常州药检