水稻基因组DNA提取方法
SSR分子标记鉴定两系杂交水稻“荃两优2118”的种子纯度
SSR分子标记鉴定两系杂交水稻“荃两优2118”的种子纯度摘要：水稻“荃两优2118”是一种具有较高产量和抗逆性的两系杂交稻品种，在种子生产中种子纯度的高低直接影响着该品种的生长发育和产量表现。
本研究使用SSR分子标记技术对“荃两优2118”水稻种子的纯度进行检测，结果表明该种子的纯度较高，具有良好的遗传纯度，适合用于种植生产。
关键词：两系杂交水稻；SSR分子标记；种子纯度；遗传纯度1.引言水稻是世界上最重要的粮食作物之一，对全球的粮食安全起着至关重要的作用。
而在水稻生产中，良种的选育和种子的纯度则是影响水稻产量和质量的重要因素。
两系杂交水稻“荃两优2118”是一种具有较高产量和抗逆性的水稻品种，种子的纯度对其生长发育和产量表现有着重要的影响。
本研究旨在利用SSR分子标记技术对两系杂交水稻“荃两优2118”的种子纯度进行检测，为该水稻品种的种子生产提供科学依据和技术支持。
2.材料与方法本研究所用水稻品种为两系杂交水稻“荃两优2118”，种子样品来自于生产基地，并经过初步筛选和清洁处理。
（1）DNA提取：采用CTAB法从水稻种子中提取DNA，提取后的DNA经过纯度和浓度检测，以保证后续实验的顺利进行。
（2）SSR引物筛选：从NCBI数据库中获取多个与水稻基因组中的SSR位点对应的引物序列，并进行筛选，选取适合“荃两优2118”水稻种子的SSR引物。
（3）PCR扩增：使用筛选得到的SSR引物对水稻种子DNA进行PCR扩增，获得扩增产物。
（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据产物的条带图谱，判断水稻种子的纯度情况。
3.结果与分析本研究共选取了20对与水稻基因组中SSR位点相关的引物进行筛选，并最终选取了3对引物用于PCR扩增。
经过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到的结果如下：根据PCR扩增产物和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，本研究表明，“荃两优2118”水稻种子纯度较高，具有较好的遗传纯度。
水稻叶绿体DNA提取和纯化方法优化
４ ３ ０ ｒ ｒｉ～ ．Ｔ ｅｃ ｌｒｐａｔ Ａ ｏａｅ ｒｍ ｅａ ｏ ｅｃ ｌｍｐａｔ ｎ ｕｉｅ ｓ ｇ Ｒ ａｅａ ｄ ｐ ｅｎ ｓ ０ － ｎ ａ ｈ ｈｏｏ ｌｓ ＤＮ ｉ ｉ ｌｔｄ ｆ ｓｓ ｏ ｔ ｂ ｖ ｈｏ ｌｓｓａ ｄ ｐ ｒ ｄ ｕ ｉ ｎ ｓ ｎ ｍｔｉａｅＫ ｈ ｉ ｆ ｎ ｗ ｉｈｃ ｕｄｂ ｓｄ ａ ｅ ｌｔ ｆＰ Ｒ． ｈｃ ｏ ｌ ｅｕ ｅ ｓｔｍｐａｅ ｏ Ｃ
操作 ． 本方法要点为 ： 液 ２３０ ・ ｉ 匀浆 ０ ｍｎ ｒ 离心去核 ， 上清液 ４３０ ・ ｉ ０ ｒｎ ｒａ 离心 ， 淀用 于 Ｄ Ａ提取 ， 后 的叶绿 沉 Ｎ 提取
体 Ｄ Ａ用 Ｒ ａｅ Ｎ Ｎ ｓ 和蛋白酶 Ｋ纯化 ．
关键词
水稻 ； 叶绿体 Ｄ Ａ 提取 Ｎ；
ｍｌ ｏＬ山梨醇 ， ．５ｍ ｌ Ｅ Ｅ ．Ｏ ０ ０ ｍ ｌ Ｃ ， ．１ｍ Ｆ ． ／ ０ ０ ｏＬＨ Ｐ Ｓ Ｈ， ．１ ｏ ＬＫ １０ ０ ｏ Ｌ口 ／ Ｋ ／ 巯基 乙醇 ， ｍ ｌ Ｄ Ａ， ｍ ｏ Ｌ ２ｍ ｏ ＬＥ Ｔ １ ｍ ｌ ／ ／ Ｍ Ｃ ， ｍ ｏ ＬＭ Ｃ ，．８ ｎ ｌ ２ Ｐ ４ｐ ．） ｇｌ ｌ ｍ ｌ ｎ Ｉ ００ ￣／ Ｋ Ｈ Ｏ ，Ｈ７６ 充分悬 浮后 ４ ０ ． ｉ ２ ／ ２ ｍ Ｌ ０ｒｍｎ ３ 离心 ２ ｉ， ０ｍｎ沉淀重悬浮于 ｌ ０
） ２ （６ ８ 文献标识码 Ａ 文章 编号 １０－５７ ２０ ）１ ０２０ ０ｏ２ ３ （０ ６Ｏ— ９ －３ ０
中图分 类号
Ｔｈ ｍｐｏ ｅ ｎ ｆａ Ｍｅｈ ｄ ｔ ｘｒｃ ｎ ｒｙ Ｒｉｅ Ｃｈｏｏ ｌｓ Ａ ｅ Ｉ ｒｖ ｍｅ ｔｏ ｔｏ ｏ Ｅ ｔａ ｔａ ｄ Ｐｕｉ ｃ ｌｒｐａ ｔＤＮ ｆ
Ｏ ｉ ，Ｈ Ａ Ｇ Ｇ Ｕ Ｌ－ ， ￣ Ｕ Ｎ ￣ －ｅ ，Ｗ Ｎ ｉ －ｎ ｗ ｔ Ａ Ｇ Ｊ ｇｊ ｇ，Ｃ Ｅ ｉｎ－ｉ ｔ ｎ ｉ Ｈ Ｎ Ｌａｇｂ
CTAB法提取植物DNA
(6) 室温下12000rpm离心10分钟；
(7) 小心取上清置于一个新的EP管中（尽量避免吸取中间层）,加 入2倍体积的无水乙醇（或2/3体积的异丙醇）,轻轻混匀，-20 ℃10min,使核酸沉淀下来；
(8) 14000rpm离心10分钟,小心倒去上清液; 1ml 70%乙醇洗涤沉淀 2次；在室温下使DNA沉淀干燥；
• （2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在 260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的 RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相 当于50ug/mL的DNA，40ug/mL的RNA。
• 蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。 • 纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的
实验原理
• 1、在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的 形式存在；在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜， 使核蛋白被释放出来。
• 2、在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解 度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液 (0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白 的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将 DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
• ③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到 破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性 剂、抑制剂使之失活。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化 物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。
• 操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。SDS和苯酚作为 蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。
提取水稻DNA的一种简易方法
提取水稻DNA的一种简易方法
卢扬江;郑康乐
【期刊名称】《中国水稻科学》
【年(卷),期】1992(000)001
【摘要】水稻染色体RFLP(DNA限制性片段长度多态性)图谱已经构建,RFLP标记正日益广泛地应用于水稻遗传育种的各项研究中。
从水稻植株提取一定数量能被各种限制性内切酶完全酶解的DNA是开展这项研究的第一步。
目前抽提水稻DNA 的一般方法,如Cornell大学Tanksley博士实验室所用的方法,还是比较复杂,而且要使用氯仿和苯酚来提纯DNA,实验过程中就必须使用耐酚的容器和离心管。
【总页数】2页(P47-48)
【作者】卢扬江;郑康乐
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S511.103.2
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DNA提取实验报告
DNA提取实验报告生物学大实验（二）实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。
实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。
实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。
经过处理的线状dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性而质粒dna可以复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分离。
限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位点上，并切割dna。
当对提取的质粒dna进行电泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
实验步骤：一质粒扩增（1）普通lb固体培养基制备：制备lb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。
（2）将大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分)二质粒dna的提取(碱法)1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀；2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。
3、加入100μl用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。
4、加入200μl现配的溶液ii，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免dna断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。
5、加入150μl预冷的溶液iii，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液iii中，冰浴5分钟。
6、取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4℃，12000rpm离心10min。
7、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的1ml 70％乙醇。
水稻品种48对dna指纹鉴定标准
水稻品种是指由一定的亲本配制而成的有一定遗传特点和明显区别的具有稳定遗传特性的品种。
水稻品种的鉴定对于种植业具有非常重要的意义，可以根据不同品种的特性选择适合当地种植的水稻品种，提高产量和质量。
DNA指纹鉴定是一种通过检测DNA序列的方法来鉴定生物的遗传信息的技术。
而对于水稻品种48，其DNA指纹鉴定标准是非常重要的，下面将从多个方面来介绍水稻品种48对DNA指纹鉴定标准的重要性和相关内容。
1. DNA指纹鉴定技术在水稻品种鉴定中的作用DNA指纹鉴定技术是根据DNA序列的差异来鉴定不同品种之间的遗传差异性的方法，是一种高度准确的技术。
在水稻品种鉴定中，DNA指纹鉴定可以准确、快速地鉴定不同水稻品种的遗传差异，对于水稻品种48的鉴定也是非常有帮助的。
通过水稻品种48对DNA指纹鉴定标准的建立和应用，可以更好地辨别出品种特征，促进水稻的良种繁育和品种改良。
2. 水稻品种48对DNA指纹鉴定标准的内容水稻品种48对DNA指纹鉴定标准包括了多个方面的内容，主要包括以下几个方面：(1) DNA提取和纯化：通过有效的DNA提取和纯化技术，可以获得高质量的DNA样本，保证后续的DNA指纹鉴定的准确性和可靠性。
(2) DNA引物选择：选择合适的DNA引物对水稻品种48进行PCR 扩增，保证PCR产物的特异性和可再现性，提高DNA指纹鉴定的准确性。
(3) PCR扩增条件：通过优化PCR扩增条件，包括反应体系、温度和时间等因素，保证PCR扩增反应的高效性和稳定性。
(4) 电泳条件和分析：在DNA指纹鉴定中，电泳条件的选择和分析方法的建立是非常关键的步骤，可以通过优化电泳条件和分析方法，准确、快速地分析水稻品种48的DNA指纹。
(5) 数据分析和结果解读：对DNA指纹鉴定得到的数据进行合理的分析和结果解读，可以得到准确的水稻品种48的DNA指纹图谱，对品种进行鉴定和区分。
3. 水稻品种48对DNA指纹鉴定标准的意义通过建立水稻品种48对DNA指纹鉴定标准，可以实现以下几个方面的意义：(1) 促进水稻良种繁育和品种改良：通过准确、快速地鉴定水稻品种48的遗传特性，可以为水稻的良种繁育和品种改良提供科学依据。
DNA提取总结
(1)将小麦叶片（约0.1g）放入研钵中，加入液氮冷冻，快速研成粉末后倒入 1.5mL 离心管中；(2)每管加入 600μL SDS DNA 提取液（含 2%的巯基乙醇），于 65℃水浴 30min，此间平和混匀几次；(3)拿出离心管，加入 60μL 5mol/L KAc ，立刻上下颠倒温柔混匀（5~6 次），冰上搁置20min；(4)于 12,000 rpm 离心 10min；(5)将上清液（约 600μL ）转移至新的离心管中，加入4μL RNase，室温搁置 5min；(6)加入 600μL 酚：氯仿：异戊醇（ 25:24:1）；(7)于 12,000 rpm 离心 15min；(8)将上清液转移至新的离心管中，记下体积，加入0.6~0.7 倍体积的异丙醇，于 -20℃下积淀 10~30min；(9)于 10,000 rpm 离心 5min，弃上清，将积淀用75%乙醇洗 2~3 次；(10)挥发洁净乙醇，加入50μL ddH2O，-20℃保存 ;(11)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
一、实验目的掌握植物总 DNA 的抽提方法和基根源理。
学习依据不一样的植物和实验要求设计和改进植物总 DNA 抽提方法。
二、实验原理往常采纳机械研磨的方法破裂植物的组织和细胞，因为植物细胞匀浆含有多种酶类(特别是氧化酶类)对DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强复原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，资料易于破裂，并减少研磨过程中各样酶类的作用。
十二烷基肌酸钠 (sarkosyl) 、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为 CTAB) 、十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate ，简称 SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，进而使 DNA 得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸 (DNA 、 RNA) 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除掉细胞碎片和大多半蛋白质。
DNA的提取和电泳实验报告
基因组DNA的提取和电泳（实验五）实验报告一、实验目的了解DNA提取的方法，以及琼脂糖凝胶电泳分析DNA技术。
二、器材和试剂1. 器材水平琼脂糖电泳仪，离心机，水浴锅，研钵，离心管、移液枪、水稻幼苗等2.试剂1.1mol/L Tris.Cl(pH8.0) 的配制：称取12.11g 的Tris，置于80 mL的ddH20,加入浓盐酸（约4.2 mL）,调节pH值至8.0，定容至100 mL。
2. 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)的配制：18.61g Na2EDTA·2H2O，加入80 mL的ddH2O,用NaOH颗粒调pH值至8.0（约需2 g），定容至100 mL。
3. 提取缓冲液的配制：100 mmol/L Tris.Cl(pH8.0), 20 mmol/LEDTA, 500 mmol/L NaCl,1.5%SDS4. 80/4/16氯仿：异戊醇：乙醇5. 6☓Loading buffer：0.15％溴酚蓝，0.15％二甲苯青FF，5 mmol/L EDTA，50％甘油三、实验步骤1.在15mL的离心管中加入5mL的提取缓冲液，60℃水浴预热。
2.植物叶1-2g，剪碎，在钵体中加入石英砂，加入预热的提取缓冲液，磨成粉末状，60℃水浴保温20 min，其间不时缓慢摇动。
3.5000 rpm离心5分钟，仔细吸取上清液至另一离心管中，4.加入5 mL 氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止皮肤损伤），室温下静置5-10分钟，使水相和有机相混匀。
5.室温下离心5000 rpm离心5分钟。
6.仔细吸取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状沉淀。
7.离心5000 rpm，离心5 min，弃去异丙醇，室温晾干。
8.视沉淀多少，加入1mL左右ddH2O溶解，可在60℃水浴中放置15分钟以上助溶。
9.取DNA样品5 µL，加入1 µL6☓Loading buffer，混匀，加入0.7%的琼脂糖凝胶加样孔中，电泳，检测DNA的分子大小。
水稻遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果，通过构建基因表达载体，将目的基因导入水稻细胞中，从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料：水稻品种为南桂占，农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105，目的基因（GFP基因）载体为pBI121。
2. 试剂：农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆：将GFP基因从质粒载体pBI121中切出，插入到农杆菌载体pBin19中，构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化：将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中，在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合，用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上，28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒：将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染：将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上，用无菌滤纸轻轻擦拭叶片，使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导：将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中，28℃条件下培养5-7天，诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选：将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中，28℃条件下培养3-4周，筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生：将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中，28℃条件下培养2-3周，诱导再生植株。
9. 抗性鉴定：将再生植株种植于田间，对植株进行潮霉素筛选，筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测：对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测，验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆：成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化：农杆菌转化效率较高，大部分叶片出现愈伤组织。
提取水稻线粒体DNA的一种简易方法
文章编号:049026756(2002)0z 20018203提取水稻线粒体DNA 的一种简易方法裴得胜1,2,蔡平钟1,李名扬2,阎文昭1,裴炎2向跃武1,张志雄1,吴洁1(1.四川省农业科学院生物技术核技术研究所,成都610066;(2.西南农业大学生物技术中心,重庆400716)摘要:介绍了一种利用常用的普通试剂提取水稻线粒体DNA 的简便方法.与其它方法相比较,它具有省时、省钱、高效、快捷、简单等特点.用该方法提取的水稻线粒体DNA ,经紫外分光光度计测定其纯度、限制性内切酶进行酶切和随机引物进行RAPD 反应的结果表明,完全可以满足作为RFL P 和RAPD 等分析质量的要求.关键词:水稻线粒体DNA ;提取纯化;酶切;RAPD中图分类号:Q244 文献标识码:A杂交水稻是粮食增产的主要方法之一,而水稻雄性不育是杂交水稻发展的基础.因而雄性不育是当今国内外研究的焦点.研究表明水稻的雄性不育与线粒体紧密相关[1],故此提取纯化水稻线粒体DNA 成为研究水稻线粒体DNA 与细胞质雄性不育的一个必要步骤.目前提取水稻线粒体DNA 的一般方法如:国外的Douce 方法[2]、Pri ng 方法[3]、Levi ngs 方法[4]以及国内所用的蔗糖的不连续梯度方法[5,6].国外提取纯化水稻线粒体DNA 的方法存在试剂价格昂贵、购买困难等不便;国内所用的蔗糖不连续梯度方法步骤繁琐,特别在吸取中间层黄色液时比较困难,费时又耗材.我们现介绍一种使用普通试剂的简易方法,此法操作步骤较少,并且所得的线粒体DNA 较纯,能被限制性内切酶酶切.其DNA 的质量完全符合RFL P 和RAPD 等研究的要求.1 材料和方法1.1 试剂缓冲液A (50m mol/L Tris 2HCl ,pH 8.0,2.5m mol/L EDTA ,0.44mmol/L Sucrose ,0.15%BSA ,5mmol/L 22Mercaptoet hanol ),缓冲液B (50mmol/L Tris 2HCl ,p H 8.0,20m mol/L ED TA ,5mmol/L 22Mer 2captoethanol),缓冲液C (0.6mol/L Sucrose ,20mmol/L ED TA ,10mmol/L Tri s 2HCl),缓冲液D (50mmol/L Tris 2HCl ,10mmol/L EDTA ),裂解液(50mmol/L Tris 2HCl ,pH 8.0,20m mol/L EDTA ,1.5%SDS ),除22Mercaptoethanol 为SI G MA 公司产品外,其它试剂均为华美生物工程公司国产分析纯.1.2 实验方法1.2.1 分离纯化水稻Ⅱ232A ,B ,F 1(A 即不育系,B 即保持系,F 1即杂种一代,下同)线粒体 剪取水稻黄化苗50g ,用10%NaClO 消毒10min ,蒸馏水洗涤数次.吸干水分后剪碎并按每克10mL 的比例加入预冷的缓冲液A ,用组织捣碎机匀浆后用3层无菌纱布过滤,滤液在4℃下18000g 离心15min 后,收集沉淀;用10mL 预冷的缓冲液A 悬浮至无颗粒存在.在4℃下1000g 离心10min 去沉淀后,加入70mL 预冷的缓冲液B ,于4℃下18000g 离心15mi n 后弃上清液,重复用缓冲液B 洗涤沉淀一次.沉淀悬浮于8mL 预冷的缓冲液A 中并轻轻加于缓冲液C 上,在4℃下12000g 离心10mi n.必要时可用缓冲液C 洗一次.所得的沉淀为纯化的水稻线粒体收稿日期222002年4月第39卷增刊四川大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan University (Natural Science Ed ition)Apr.2002Vol.39Issue.:200201291.2.2 提取纯化线粒体DNA 纯化的线粒体于2.4mL 缓冲液D 中充分悬浮.加入预处理的(37℃下保温10min )Prot ei nase K 至100×10-6g/mL ,轻摇2mi n 后,再加入1.2mL 裂解液,于37℃下反应1h.将所得的粘稠液倒入三角瓶中加入等体积的饱和酚且摇匀后于摇床上慢摇10min.再将混合液转入1.5mL 离心管中,于4℃下5000g 离心15mi n.转移上层液于1.5mL 离心管内并加入等体积的酚2氯仿2异戊醇(24∶23∶1)轻轻混匀后,于4℃下5000g 离心10min ,重复至中间层无蛋白质出现.取上层液并加入0.1倍体积的3mol/L NaAc 和2倍体积75%的乙醇,于-20℃放置3h ,再在4℃10000g 离心15min 后收集沉淀,用70%的乙醇洗涤两次,真空干燥5min ,最后溶于50μL TE 中在-20℃下保存备用.1.3 线粒体DNA 的定量和定性分析1.按常规方法用紫外分光光度计测定线粒体DNA 在OD 260nm 和OD 280nm 及OD 230nm 的值,计算出线粒体DNA 溶液的浓度和比较其纯度.2.取2μL 所得的DNA 溶液,用1%琼脂糖电泳以观察DNA 的带型及分子量大小.3.取1μL 线粒体DNA 溶液,加入4U 限制性内切酶于37℃下酶切4h ,用1%琼脂糖电泳以观察酶切效果.4.用OPERON 公司的OPA 17,OPD 03和OPE 193个随机引物作RAPD 反应.2 结果与分析1.紫外分光光度计测定结果:OD 260nm /OD 280nm =1.88,OD 260nm /OD 230=2.6,说明所提取的DNA 比较纯.通过OD 260nm 值计算所得的DNA 浓度达1.5×10-6g/μL.每50g 水稻黄化苗约可得线粒体DNA 58μg ,产率较高.2.所提取的DNA 电泳结果带型清晰,无拖尾且未发生降解现象(见图1).3.所提取的DNA 经限制性内切酶(EcoR I ,SABC )于37℃下酶解4h ,电泳结果重复性好、谱带清晰、酶切彻底(见图2).4.RAPD 最少为1条带,最多达12条带,分子量约在500～5000bp 之间.带型清晰,效果较好(见图3).图1 图2 图3 图1～3中的M 和M2为m arker ;A ,B 和F 1分别为水稻Ⅱ232不育系、保持系和杂种一代的mtDNA.1,2,3用引物OPA 17;4,5,6用引物OPD 03;7,8,9用OPE 19分别扩增Ⅱ232不育系、保持系和杂种一代mtDNA 所对应的扩增带3 讨论 在提取水稻线粒体过程中,如果存在酚类物质而影响最终的DN 产率时,可于缓冲液中适当加入%的V 线粒体裂解前的沉淀,要充分悬浮再缓慢加入裂解液,以提高线粒体DN 的产量线粒体裂91增刊 裴得胜等:提取水稻线粒体DNA 的一种简易方法A 1.0P P.A .02四川大学学报(自然科学版) 第39卷解前加入预热的Proteinase K可帮助更好的裂解.如果通过加入DNase I来除去核基因的污染,将导致产率降低[7].上述方法的特点之一是可不使用国外方法所用的昂贵试剂.其次可简化实验步骤,避免了国内所用蔗糖梯度方法的繁琐.再者不加DNase I,而是通过多次洗涤方法去除核DNA污染,结果证明所提取的DNA 纯度较好.在提取纯化过程中RNA一般会自动降解[8],可针对提取效果考虑是否加入RNase..参考文献:[1] 朱英国.水稻雄性不育生物学[M].武汉:武汉大学出版社,2000.256-279.[2] Douce R,et al.BBA,1972,275:148-160.[3] Pring D R,et a l.G enetics,1978,89:121-136.[4] Levings C S,et al.Scie nce,1976,193:158-160.[5] 陈毓荃.生物化学研究技术[M].北京:中国农业出版社,1995.232-235.[6] 王关林.植物基因工程原理与技术[M].北京:科学出版社,1998.605-608.[7] 赵衍,等.杭州大学学报(自然科学版),1991,18(3):321-325.[8] 谢纬武,等.中国科学,1996,26(2):172-176.A Simple Method f or Isolation of Rice Mitochon dr ial DNAPEI De2s heng1,2,CA I Pin g2z hon g1,L I Mi ng2ya n g2,YA N Wen2zhao1PEI Yan2,XIA N G Yue2w u1,Z HAN G Zhi2xi on g1,W U J ie1(1.Biotechn ology and Nuclear Techn ol ogy Research Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu610066,China;2.Center of Biotechnology,S outhwest Agricult ural University,Ch ongqing400716,China)Abstract:A si mple met hod for i solation of rice mi tochondrial DNA is descri bed by using t he com mon reagents. Comparing wit h ot her met hods,i t not only c ost s less time and money,but also has higher efficiency.It i s re2 garded as a simple,convenient and rapi d met hod.Tested by UV2spect rophotometer,t he rice mitochondrial DNA is very pure by t his met hod.Moreover,it i s well digest ed by t he rest riction endonuclease.The result shows t hat it s qualit y can be used for RFLP or RA PD.K ey w or ds:i solation and purification;rice mitochondrial DNA;endonuclease digestion;RAPD。
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1.TPS DNA提取buffer
成分使用浓
1L体系添加量
度
100mM 12.114g
Tris-HCl(pH
8.0)
NaCl 1M 58.44g
EDTA 10 mM 3.7224g
TPS法抽DNA （96孔板大量提取）
1.取4cm长的水稻叶片放在96孔取样板,加入两颗5mm钢珠，加400ulTPS,用力将皮盖盖紧（否则会交叉污染），组织破碎仪（70HZ ，60s~150s【根据叶片老嫩程度调节】）,短暂离心后放65℃烘箱20min~40min,期间震荡混匀三次。
2.配平后，4000rpm,30min；
3.准备96孔浅孔板，并标号，加入200ul异丙醇.将离心后的上清取200ul转移到板中；
4.-20℃沉淀3min(或4℃沉淀15min)，4000rpm,30min（注意配平）；
5.倒掉异丙醇，加400ul(或者500ul)75%乙醇，4000rpm,15min；
6.倒掉70%乙醇，倒扣离心，最好不要超过500rpm。
通风橱晾干2小时，加100-300ul水溶解。
PCR反应时取2~4ul做模板即可；
CTAB DNA提取buffer
成分使用浓度4L体系添加量
CTAB 2% 80g
Tris-HCl(pH 8.0) 100mM 48.456g
NaCl 1M 233.76g
EDTA二钠盐20 mM 29.7792g
CTAB 法抽DNA （单管少量提取）
1.取5cm长的水稻叶片放在2ml的tube中, 放入液氮中用筷子捣碎后(或者放入1颗6mm钢珠，用组织破碎仪打碎)，加750ulCTAB,放65℃烘箱30min~1h,期间震荡混匀三次。
2.用连续加样器加500ul氯仿，震荡混匀后，12,000rpm,10min
3.准备新的2ml的Tube,加入500ul异丙醇，并编号，将离心后的上清吸取500ul转移到新的EP管中,检查盖子是否盖严，上下颠倒混匀；
4.-20℃沉淀3min(或4℃沉淀15min)，12,000rpm,10min；
5.倒掉异丙醇，加750ul(或者1ml)75%乙醇，上下颠倒混匀，12,000rpm,5min；
6.倒掉70%乙醇，通风橱晾干2小时，加200-500ul水溶解。
PCR反应时取1~3ul做模板即可；
CTAB 法抽DNA （单管大量提取）
1.取5cm长的水稻叶片放在2ml的tube中, 放入液氮中用筷子捣碎
后(或者放入1颗6mm钢珠，用组织破碎仪打碎)，加750ulCTAB,放65℃烘箱30min~1h,期间震荡混匀三次。
2.用连续加样器加500ul氯仿，震荡混匀后，12,000rpm,10min
3.准备96孔深孔板，并标号，加入500ul异丙醇.将离心后的上清取500ul转移到板中；
4.-20℃沉淀3min(或4℃沉淀15min)，4000rpm,30min（注意配平）；
5.倒掉异丙醇，加750ul(或者1ml)75%乙醇，4000rpm,15min；
6.倒掉70%乙醇，倒扣离心，最好不要超过500rpm。
通风橱晾干2小时，加200-500ul水溶解。
PCR反应时取1~3ul做模板即可；。