分子生物学技术实验指导2009版
1 分子生物学实验指导 2009年9月19日修订 2 实验一 质粒DNA的制备 [原理] 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中，大小在1—200kb之间，它们为双链闭环状的DNA分子。质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达其携带的遗传信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，离开宿主细胞就不能存活，而寄主在没有质粒存在时是可以正常生长的。质粒可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，其控制的许多生物学功能通常是对宿主细胞的补充。因此，可以认为质粒是一种寄生性的自主复制子。 质粒在细胞内的复制一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松驰控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，因此，染色体不复制时，其也不复制；后者在整个细胞周期中随时都可以复制；通常，前者在细胞内只含1个或几个质粒分子，而后者在细胞里有许多拷贝，一般在20个以上，甚至多达数千个。 在基因工程中，通常使用的是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而人工构建的质粒，称为质粒载体，其带有一个或多个选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有若干个限制性核酸内切酶识别的位点（多克隆位点）。由于去掉了天然质粒中的大部分序列，一般不含转移所必需的基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的转移。常用的质粒载体有PUC18/19、PBR322、PGEM—32、PKK223—2等，其大小一般为2—5kb，由于其分子小，因此便于操作。 分离纯化质粒DNA主要是利用宿主染色体与质粒之间的差异来进行的，如染色体DNA分子量比质粒DNA大得多，又如染色体DNA在提取过程中大多断裂成线状分子而质粒 DNA为共价闭合环状结构。 分离纯化质粒 DNA包括三个基本过程： 1、培养细菌使质粒大量扩增； 2、收集和裂解细菌，并去掉蛋白质和染色质DNA； 3、分离纯化质粒DNA。 目前质粒 DNA制备大致有三种，1、碱裂解法，2、煮沸法，3、去污剂裂解法。 碱裂解法 将细菌悬浮于葡萄糖等渗溶液中，经EDTA处理，可破坏细菌细胞壁和细胞外膜，阴 3
离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）或Triton x-100处理使细胞崩解，经碱处理可使氢键断裂、破坏碱基配对，使细菌线状染色体DNA和质粒DNA变性，加入乙酸钾后质粒DNA迅速复性为可溶性质粒DNA，小分子RNA也呈可溶状态，而变性的染色体DNA、高分子RNA以及K+/SDS/细胞膜复合物缠绕附着在细胞壁碎片上，冰浴后易沉淀，可离心去除，而质粒DNA及细菌中的可溶性蛋白质、核糖核蛋白体和tRNA等留在上清中。通过加入蛋白水解酶和核糖核酸酶可以分解之。通过碱性酚（pH8.0）或酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)或氯仿-异戊醇等有机溶剂除去蛋白质、氯化锂沉淀RNA和残存的蛋白质、再用乙醇等有机溶剂沉淀DNA，即得纯化的质粒DNA。 [器材] 1、台式高速离心机 2、涡旋器 3、摇床（干热振荡培养箱） 4、手提式高压消毒锅 5、微量进样器 6、移液器 7、1.5ml Eppendorf管 8、100ml三角烧瓶 9、水浴锅 [试剂] 1、 LB( Luria—Bertani)培养基: 950ml去离子水中加入胰蛋白胨10克、酵母提取液5克、NaCl 10克，摇荡至溶解，用5N NaOH（约1.6 ml）调pH至7.5，用去离子水定容至1000ml，15磅/英寸2高压灭菌20分钟（LB培养基不能反复高压）。 2、 氨苄青霉素（Ampicillin , Amp）母液：10 mg/ml水溶液,-20℃冰箱贮存，备用。 3、 LB-AMP液体培养基: 在100 ml LB培养基中加入氨苄青霉素（10 mg/ml）母液0.5 ml。 4、 LB固体培养基：在LB培养基中加1.4%琼脂粉，经高压灭菌制备LB固体培养基。 5、 LB-AMP固体培养基（含氨苄青霉素50ug/ml）：在100 ml LB培养基中加1.4g琼脂粉，经高压灭菌后冷却至55℃,加入氨苄青霉素（10 mg/ml）母液0.5 ml ,制备LB-AMP固体培养基。 6、 1 mol/L Tri-HCl Buffer ：800 ml水中加Tris 121.1 g 、浓HCl( pH 8.0时42ml、pH 7.6 4
时60ml、pH 7.0时70 ml)，用水定容至1L。 7、 1 mol/L EDTA: 800 ml水中加 EDTA-Na2-2H2O 372.2 g 、NaOH 约20g ，调pH至8.0 ，用水定容至1L，高压。 8、 GTE缓冲液[50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris·Cl(PH8.0),10mmol/L EDTA]：高压灭菌15分钟，贮存于4℃冰箱备用。注意：GTE缓冲液不可反复灭菌。 9、 TE缓冲液[ 10 mmol/L Tris·Cl (PH8.0), l mmol/L EDTA ]：每100ml 蒸馏水加１.０ml 1 mol/L Tris·Cl(pH8.0), 200 μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。 10、 3mol/L乙酸钾溶液：29.5ml冰乙酸加KOH颗粒调至pH4.8，加双蒸馏水定容至100ml。不必高压灭菌，室温下贮存。 11、 无水乙醇和70%乙醇。 12、 10% SDS 13、 异丙醇 14、 Tris饱和酚 15、 氯仿 16、 NaOH—SDS溶液：10mol/L NaOH 20 μl, 加双蒸馏水880μl， 10% SDS 100μl ,新鲜配制。 17、 2μg/μl Rnase：用TE Buffer稀释。 [实验步骤] 1、将含有PUC-tem质粒的菌种接种于LB-AMP固体培养基上，37℃培养过夜。 2、挑取菌落接种到5ml LB-AMP液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长期备用。 3、取1.5ml对数生长期的菌体于Eppendorf管中，在台式离心机上8000rpm离心30秒钟收集菌体。 4、弃上清，将Eppendorf管倒置在吸水纸上，吸干溶液。 5、加100μl GTE缓冲液，用移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，室温放置5分钟。 6、加入200μl新鲜配制的NaOH—SDS溶液，颠倒混匀10次，然后置冰浴5分钟。 7、加入150μl预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，置冰浴5分钟。 8、 在4℃下于台式高速离心机12000 rpm离心5分钟，并将上清移至另一支新Eppendorf 管中。 9、加入2μg/μl Rnase溶液 2 μl，37 ℃ 30 min。 10、加等体积酚、氯仿抽提一次，12000 rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新 5
Eppendorf管中。 11、加等体积氯仿抽提一次，12000 rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新Eppendorf管中。 12、加0.6倍体积异丙醇，置冰浴3 0 min ，12000rpm离心10分钟, 弃上清。 13、沉淀用70%乙醇0.5 ml洗一次,弃上清，室温放置10分钟，挥干乙醇。 14、用30 μl TE溶解沉淀的DNA，置4℃保存，（不要吹打，放置10分钟后自然溶解）。
质粒示意图： 6 实验二 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 [原理] 琼脂糖凝胶（agarose gel）电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的最常用的方法。不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离从100bp至60kb的DNA片段。在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大，迁移速率越慢；而且还与DNA分子构型有关，对于分子量相同而构型不同的DNA分子来说，迁移速率为负超螺旋构型分子>线状构型分子>开环状构型分子。 质粒DNA在电泳体系中带负电向正极移动，由于质粒DNA有三种存在形式，（1）共价闭环DNA（covalently closed circμlar DNA，ccc DNA），常以负超螺旋构型存在；（2）开环DNA（open circμlar DNA，oc DNA），质粒DNA双链中有一条链发生一处或多处断裂形成缺口，可以自由旋转从而消除了张力，形成松驰的环状分子；（3）线状DNA（linear DNA），质粒DNA的两条链在同一处断裂而形成线状分子；因此，在电泳时，同一质粒的不同构型有不同的迁移速率，从而得到分离，从阳极至阴极分别为共价闭环DNA、线状DNA和开环DNA。 由于低浓度的荧光染料溴化乙锭(ethidum bromide，EB)会嵌入到DNA分子的碱基对中形成荧光复合物，在紫外线激发下发射荧光，其强度与DNA的含量成正比（肉眼观察可检出0.05-0.1 ug的DNA）。 因此，DNA在含有EB的琼脂糖凝胶中电泳结束后，可在紫外灯下观察质粒DNA在凝胶中的位置和含量。 [器材] 1、稳压稳流电泳仪 2、小平板电泳槽 3、紫外检测仪 4、照相机（带快门线及黄色滤光片） 5、黑白胶卷 6、微量进样器 7、移液器及吸嘴 8、胶带 7
9、Eppendorf管 10、眼科镊子 11、手术 [试剂] 1、TAE缓冲液 （1）贮存液：50×TAE：每升溶液中含242克Tris，57.1毫升冰乙酸，100毫升0.5mol/L EDTA(pH 8.0)。 （2）工作液：1×TAE 2、10×上样缓冲液：0.25%溴酚兰—40%（W/V）蔗糖水溶液。 3、1.0%琼脂糖：称1.0克琼脂糖，加100毫升1×TAE缓冲液，加热溶解。 4、10mg/ml溴化乙锭贮存液：1克溴化乙锭（溴化乙锭为核酸的荧光染色剂，有强烈的诱变性和中度毒性，使用时需戴手套）用100毫升重蒸水溶解，避光保存。 [实验步骤] 1、准备小平板电泳槽，取出平板，用胶带封口，放回槽内，并插上样孔梳，调节上样孔梳，使上样孔梳底部与凝胶模底板的距离为0.5-1.0mm。 2、将用1×TAE缓冲液配制的1.0 % 琼脂糖凝胶置微波炉或沸水浴加热使之熔化，冷却至60℃后加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5ug/ml，混匀。 3、将琼脂糖凝胶趁热倒入平板达3—5毫米厚，静止40分钟让其完全凝固。 4、去掉平板两端的封口胶带，将凝胶随凝胶模一起放入加有足量的1×TAE缓冲液电泳槽中（缓冲液浸没过凝胶面2—3毫米），小心拔出样孔梳。 5、取5μl质粒DNA，加入1 μl 6×上样缓冲液，混合后用微量进样器小心加入样品孔。 6、以靠近上样端接负极，另一端接正极，接通电源，以5v/cm（该距离为电泳槽两电极间的距离，非凝胶自身的长度）的电压电泳30—60分钟。 7、电泳结束后，带上保护手套，倾去电极缓冲液，取出凝胶置透明薄膜上，在紫外灯下观察电泳结果，并照相（光圈5.6、B门暴光2-5分钟）记录结果。
分子生物学实验报告全解(有图有真相)
分子生物学实验报告慕蓝有志班梦想学院目录实验一细菌的培养 (2)实验二质粒DNA的提取 (4)实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (7)实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (9)实验五聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (11)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (14)实验七RNA分离与纯化 (17)实验八RT-PCR扩增目的基因cDNA (19)实验九质粒载体和外源DNA的连接反应 (21)实验十感受态细胞的制备及转化 (23)实验十一克隆的筛选和快速鉴定 (25)实验十二地高辛标记的Southern杂交 (27)实验十三阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达 (31)思考题 (32)分子实验心得总结 (33)实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。
培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。
实验室中最常用的是LB培养基。
三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂1. 胰蛋白胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养皿2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. 无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（一）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。
分子生物学实验指导-3
分子生物学实验指导-3北京化工大学分子生物学实验指导实验一少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。
（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。
（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。
二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。
目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。
严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。
每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。
松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。
该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。
生化与分子生物学实验指导
⽣化与分⼦⽣物学实验指导⽣化与分⼦⽣物学实验指导-（)————————————————————————————————作者:————————————————————————————————⽇期:实验⼀氨基酸纸层析法⼀、实验⽬的通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作⽅法。
⼆、实验原理纸层析法(ｐａp ｅｒ c ｈro ｍａt ｏgr ａphy ）是⽣物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常⽤技术,可⽤于蛋⽩质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。
纸层析法⼜称纸⾊谱法,是⽤滤纸为⽀持物,所⽤展层溶剂⼤多由⽔和有机溶剂组成,滤纸纤维与⽔的亲和⼒强,与有机溶剂的亲和⼒弱,因此在展层时，纸纤维上吸附的⽔分是固定相,有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的,称上⾏法；由上向下移动的,称下⾏法。
将样品点在滤纸上(此点称为原点),进⾏展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进⾏分配。
由于它们的分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动的速率就不同,于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率⽤Rf 值表⽰：在⼀定条件下某种物质的Ｒf 值是常数。
Ｒf 值的⼤⼩与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
只要条件(如温度、展层溶剂的组成）不变,Rf 值是常数,故可根据Ｒf 值作定性判断。
样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的R ｆ值相同或相近,此时如只⽤⼀种溶剂展层,就不能将它们分开。
为此，当⽤⼀种溶剂展层后，将滤纸转动90度,再⽤另⼀溶剂展层,从⽽达到分离⽬的,这种⽅法称为双向纸层析法。
氨基酸⽆⾊,可利⽤茚三酮显⾊反应,将氨基酸层析点显⾊作定性、定量⽤。
所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产⽣蓝紫⾊物质,只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产⽣(亮)黄⾊物质。
三、药品器材1器材层析滤纸（新华1号)、喷雾器、剪⼑、层析缸、⽑细管、电吹风、刻度尺、铅笔。
R ｆ=原点到层析斑点中⼼的距离原点到溶剂前沿的距离2试剂(1)氨基酸溶液:赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸溶液以及他们的混合溶液(各组分浓度0．5％)。
高中生物实验指南：分子生物学实验操作手册
高中生物实验指南：分子生物学实验操作手册1. 简介分子生物学是研究生物体内分子结构、组成、功能以及相互作用的科学。
在高中生物学课程中，通过进行一系列分子生物学实验，可以加深对基因、DNA、RNA等内容的理解，并培养学生动手实践和科学探究的能力。
本操作手册将介绍一些适合高中副标准课程的基本分子生物学实验，帮助教师和学生更好地开展这方面的实验教学。
2. 实验一：提取DNA2.1 实验目的了解DNA的结构和提取过程，并掌握提取DNA的基本方法。
2.2 材料与仪器•成熟香蕉或其他植物材料•盐水溶液（含氯化钠）•蛋白酶（如葡萄胺酸酶）•洗涤剂（如洗衣粉）•咖啡滤纸或滤纸漏斗•烧杯•酒精1.将香蕉剥皮后放入砧板上，用刀将香蕉捣碎成泥状。
2.在烧杯中加入适量的盐水溶液，并将捣碎的香蕉放入其中搅拌均匀。
3.加入少量蛋白酶和洗涤剂，再次搅拌均匀，让细胞破裂释放DNA。
4.将混合物过滤到另一个烧杯中，通过滤纸除去大颗粒的残渣。
5.将过滤后的溶液倒入试管中，并缓慢地倾斜试管，在溶液与酒精接触的界面处，会出现白色粘稠物质，即提取到的DNA。
2.4 实验结果及分析实验中提取到的DNA呈现为白色细丝状物质。
通过这个实验可以观察到DNA 在水相和酒精相之间的界面上凝聚堆积。
说明了DNA在酒精中不溶性，从而便于提取。
3. 实验二：PCR扩增3.1 实验目的了解聚合酶链式反应（PCR）的原理和基本步骤，并能够进行PCR扩增实验。
3.2 材料与仪器•PCR试剂盒（含模板DNA、引物、聚合酶等）•热循环仪•PCR试管或反应管1.准备PCR反应体系，按照试剂盒说明书的要求加入模板DNA、引物和聚合酶等。
2.将装有反应溶液的PCR管放入热循环仪中。
3.设置PCR的温度程序，包括变性、退火和延伸阶段。
4.启动热循环仪开始PCR扩增反应。
5.完成PCR后，可以通过凝胶电泳等方法检测扩增产物。
3.4 实验结果及分析通过PCR扩增，可以在较短的时间内大量复制并放大目标基因片段。
分子生物学实验指导
1.5 mL 塑料离心管 10 个，0.5 mL 塑料离心管 7 个，塑料离心管架（30 孔）1 个，20、200、1000 µL 微量加样器各一支，常用玻璃仪器及滴管等， 台式高速离心机,恒温摇床,恒温培养箱,高压灭菌锅。 2、实验材料
大肠杆菌 JM109。 3、实验试剂
[思考题] 1．为什么 DNA 电泳速度共价闭环 DNA＞直线 DNA＞开环的双链环状
DNA，酶切后只剩下单一的直线 DNA 条带？ 2．在琼脂糖凝胶电泳（制备胶板，加样，电泳）过程中的注意事项是
什么？
实验三 质粒 DNA 的限制性内切酶酶切及电泳分离、鉴定
[实验目的] 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解的操作方法，理解限制性内切酶
（4）将有机玻璃内槽置于一水平位置，放好样品槽梳子。 （5）将冷却至 65°C 左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽
上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面 形成均匀的胶层。室温下静置 lh 左右。 （6）待凝固完全后大约 30 min，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中 备用。将电泳槽内注满 1× TAE 稀释液，注意，使 TAE 稀释液刚没过 胶即可。 （7）轻轻拔出样品槽梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。 2．加样 （1）微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，加样时，微 量加样器的枪头垂直于样品槽上方，插入 TAE 稀释液，但不能碰到 样 品槽的凝胶面，将样品加入样品槽内。
[器材和试剂] 1．实验仪器 1.5mL 塑料离心管 10 个，0.5 mL 离心管 7 个，塑料离心管架（30 孔）
1 个，20、200、1000 µL 微量加样器各一支，锥形瓶（100mL 或 50 mL）白 搪瓷盘，玻璃纸，一次性塑料手套，常用玻璃仪器及滴管等，电泳仪，电泳 槽，样品梳子，有机玻璃内槽，台式高速离心机一台，台式高速冷冻离心机 一台，微型瞬间离心机一台，凝胶自动成像仪。
分子生物学实验_2
1 实验概述分子生物学试验指导1 实验概述1.1 实验目的实验过程中, 主要通过碱裂解法提取质粒DNA.对质粒进行双酶切、并连接构建成重组DNA分子、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备、感受态细胞的转化以及目的蛋白质gfp 的正常表达, 来完成一系列分子生物学基础实验。
通过本实验, 学习并掌握碱裂解法、双酶切、氯化钙法制备感受态细胞的制备及采用α互补现象进行重组DNA鉴定的原理和方法。
1.2 实验原理质粒是细菌内共生型遗传因子, 它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞特定的表型, 经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介, 这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途。
本次实验中, 分子克隆质粒载体T所携带的外源基因是gfp绿色荧光蛋白, 实验的最终目的是将gfp基因插入表达载体P中, 组成重组子, 并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达, 培养出绿色的大肠杆菌菌落。
为此, 我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来, 并通过HandⅢ和NCO Ⅰ两种酶的双酶切作用, 从而获得目的外源基因片段gfp和表达载体-P质粒的DNA, 然后通过连接酶连接后形成重组子, 并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中, 让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖, 最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp 和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落, 来判断gfp基因工程菌的构建效果。
广东工业大学现代分子生物技术实验报告2 实验流程2.1 实验安排表实验内容时间安排质粒T、质粒P的提取 3 h电泳检测质粒提取效果30～45 min确定质粒提取成功后, 利用HindⅢ、NcoⅠ这2种限制性内10～11 h切酶分别对质粒T、质粒P进行双酶切电泳检测酶切情况, 若酶切成功, 利用试剂盒回收DNA片断45 min利用T4 DNA连接酶进行连接14～16 h大肠杆菌感受态细胞的制备 3 h转化（gfp基因导入受体细胞） 2 h 重组子的筛选（在含有Amp的LB平板上筛选）12～16 h诱导表达与鉴定（加入诱导物IPTG诱导gfp表达）12～16 h2.2 实验流程图①质粒DNA的提取与纯化碱液裂解法；乙醇洗涤纯化（T-gfp质粒作为克隆载体、P32作为表达载体）②通过观察电泳图片, 来鉴定T、P两种质粒DNA的提取结果琼脂糖凝胶电泳的方法③对成功提取的T、P两种质粒DNA进行双酶切限制性内切酶Han dⅢ、NcoⅠ④T-gfp、P两种质粒的DNA片段的回收割胶（试剂盒快速回收）用刀片把凝胶上的目的DNA条带割取下来3 实验操作方法⑤连接T-gfp、P两种质粒的目的DNA T4噬菌体DNA连接酶（重组DNA分子的构建）⑥大肠杆菌感受态细胞的制备氯化钙法⑦将连接后的重组DNA分子导入大肠杆菌感受态细胞感受态细胞的转化⑧重组子的筛选含有AMP r的重组子才能在AMP平板上生长⑨将含有gfp、AMP r两种目的基因的重组子进行诱导表达重组DNA分子的鉴定在平板上加入底物IPTGgfp绿色荧光蛋白基因被诱导表达⑩gfp基因只有在诱导物IPTG和底物X-gal的存在时, 才能正常表达, 在平板上生成绿色的菌落构建出含有gfp绿色荧光蛋白基因的工程菌图2.1 gfp基因工程菌的构建与表达广东工业大学现代分子生物技术实验报告3实验操作方法3.1 质粒DNA的提取3.1.1 实验概述1.分子克隆载体载体是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
分子生物学实验指导_LSW
实验一质粒DNA的小量制备（碱裂解法）一、实验原理所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。
本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。
碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。
该方法的特点是，加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞壁裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。
当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。
细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。
如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀法或氯化铯－溴化乙锭梯度平衡法。
环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；若质粒DNA经过适当的核酸内切限制制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子（L DNA），通称L构型。
质粒DNA Mr一般在106～107之间，常以kb表示（l kb双链DNA=6.6×105）,如质粒pUC19的Mr为1.8×106 (2.69 kb)。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管Mr相同，仍具有不同的电泳迁移率，其中走在最前沿的是scDNA，其后依次为L DNA和ocDNA。
二、实验材料与设备1. 用品与仪器可调微量取样器（20 μl、l 000 μl），Tip头，1.5 ml Eppendorf管，常用玻璃仪器，恒温空气摇床，台式高速微量离心机，旋涡振荡器。
分子生物学实验指导书
农学院《分子生物学》实验指导书适用专业：园艺、农学、植物保护、农产品质量与安全、中草药栽培与鉴定贵州大学二OO 七年八月前言本实验课的目的是使学生掌握一些基本的分子生物学实验技术，提高专业技术水平。
学生通过实验掌握分子生物学的基本实验方法，验证、巩固和加深对分子生物学基本理论的理解，培养严谨的科学态度和分析问题，解决问题的能力，培养从事科学研究的基本素养。
为了使学生更好地理解和深刻地把握这些知识，设置了以下实验项目：实验一质粒DNA的提取与分离（验证性实验，学时数3）实验二质粒DNA的酶切（验证性实验，学时数3）实验三酶切片段的琼脂糖凝胶电泳分析（验证性实验，学时数2）实验四PCR技术在农业中的应用（综合性实验，学时数10）通过本课程的相关实验，让学生熟悉进行分子生物学研究的基本仪器设备和规范的操作方法，使学生学习并掌握质粒DNA提取的原理和操作步骤；了解质粒酶切鉴定原理；掌握应用琼脂糖凝胶电泳的原理及操作方法，并对PCR的扩增结果及DNA的质量进行检测。
掌握应用PCR技术对植物进行DNA水平遗传多样性检测及分析的方法。
使学生学会分子生物学的基本实验方法，并在科学态度、实验技能、独立工作能力等方面获得初步的训练。
目录1、实验一：质粒DNA的提取与分离······························································页码2、实验二：质粒DNA的酶切·········································································页码3、实验三：酶切片段的琼脂糖凝胶电泳分析··················································页码4、实验四：PCR技术在农业中的应用····························································页码5、实验报告基本内容要求··············································································页码6、实验报告格式····························································································页码实验一：质粒DNA的提取与分离实验学时：3实验类型：验证性实验实验要求：必修一、实验目的从细菌菌体中提取、分离质粒DNA分子，是基因工程的基础步骤。
分子生物学实验报告
本科学生综合性实验报告姓名学号学院生命科学学院专业、班级应用生物教育实验课程名称分子生物学实验教师及职称倪娟（老师）开课学期2014 至2015 学年下学期云南师范大学教务处编印当我被上帝造出来时，上帝问我想在人间当一个怎样的人，我不假思索的说，我要做一个伟大的世人皆知的人。
于是，我降临在了人间。
我出生在一个官僚知识分子之家，父亲在朝中做官，精读诗书，母亲知书答礼，温柔体贴，父母给我去了一个好听的名字：李清照。
小时侯，受父母影响的我饱读诗书，聪明伶俐，在朝中享有“神童”的称号。
小时候的我天真活泼，才思敏捷，小河畔，花丛边撒满了我的诗我的笑，无可置疑，小时侯的我快乐无虑。
“兴尽晚回舟，误入藕花深处。
争渡，争渡，惊起一滩鸥鹭。
”青春的我如同一只小鸟，自由自在，没有约束，少女纯净的心灵常在朝阳小，流水也被自然洗礼，纤细的手指拈一束花，轻抛入水，随波荡漾，发髻上沾着晶莹的露水，双脚任水流轻抚。
身影轻飘而过，留下一阵清风。
可是晚年的我却生活在一片黑暗之中，家庭的衰败，社会的改变，消磨着我那柔弱的心。
我几乎对生活绝望，每天在痛苦中消磨时光，一切都好象是灰暗的。
“寻寻觅觅冷冷清清凄凄惨惨戚戚”这千古叠词句就是我当时心情的写照。
最后，香消玉殒，我在痛苦和哀怨中凄凉的死去。
在天堂里，我又见到了上帝。
上帝问我过的怎么样，我摇摇头又点点头，我的一生有欢乐也有坎坷，有笑声也有泪水，有鼎盛也有衰落。
我始终无法客观的评价我的一生。
我原以为做一个着名的人，一生应该是被欢乐荣誉所包围，可我发现我错了。
于是在下一轮回中，我选择做一个平凡的人。
我来到人间，我是一个平凡的人，我既不着名也不出众，但我拥有一切的幸福：我有温馨的家，我有可亲可爱的同学和老师，我每天平凡而快乐的活着，这就够了。
天儿蓝蓝风儿轻轻，暖和的春风带着春的气息吹进明亮的教室，我坐在教室的窗前，望着我拥有的一切，我甜甜的笑了。
我拿起手中的笔，不禁想起曾经作诗的李清照，我虽然没有横溢的才华，但我还是拿起手中的笔，用最朴实的语言，写下了一时的感受：人生并不总是完美的，每个人都会有不如意的地方。
细胞生物学实验指导书09年
细胞生物学实验指导书09年实验一普通光学显微镜的构造和使用一、目的要求1了解显微镜的基本构造和使用方法2 掌握油镜的原理和使用方法二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理1．显微镜的基本构造光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。
机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。
2．显微镜的放大倍数和分辨率放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力3．油镜的使用原理当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、器材1．永久切片2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。
3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。
四、操作步骤1．观察前的准备（1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光源2．显微镜观察（1）低倍镜观察（2）高倍镜观察（3）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
3．显微镜用毕后的处理观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。
五、思考题1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？实验二胞间连丝的观察一、实验目的观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识．二、实验原理植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。
相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。
用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。