凝固酶阴性葡萄球菌
葡萄菌属的微生物学检验方法与原理
葡萄菌属的微生物学检验方法与原理1.标本采集：根据葡萄球菌感染所致的疾病不同，可采集脓汁、渗出液、伤口分泌物、血液、尿液、粪便、痰液以及脊髓液等。
2.检验方法及鉴定（1）直接镜检：无菌取脓汁、痰、渗出物和脑脊液（离心后取沉渣）涂片，经革兰染色后镜检，如为革兰阳性球菌呈葡萄状排列可初步报告为："找到革兰阳性葡萄状排列球菌，疑为葡萄球菌".（2）分离培养：血液标本（静脉血约5ml）注入50ml 葡萄糖肉汤或含硫酸镁肉汤增菌培养，迅速摇匀，以防凝固，置35℃，一般于24h后开始观察有无细菌生长，若均匀混浊，溶血及胶胨状生长，则接种于血琼脂，进一步鉴定，若无细菌生长，于48～72h后自行观察（一般以7天为限），并接种血琼脂，以确定有无细菌生长。
血液标本也可注入商品血培养瓶培养。
脓汁、尿道分泌物、脑脊液离心沉淀物，通常可直接接种血琼脂。
35℃18～24h培养，可见直径2～3mm，产生不同色素的菌落。
金黄色葡萄球菌在菌落周围有透明的溶血环。
尿液标本，必要时作细菌菌落计数。
粪便、呕吐物应接种高盐卵黄或高盐甘露醇琼脂平板，经35℃18～24h培养，可形成细小菌落，48h后形成典型菌落。
（3）鉴定试验1）触酶试验：细菌产生的过氧化氢酶催化双氧水生成水和氧气，产生气泡。
方法：取营养琼脂上的菌落置于洁净试管内或洁净玻片上，滴加3％H202溶液数滴，观察结果，如立即（1min内）有大量气泡产生为阳性，不产生或气泡量少为阴性。
葡萄球菌属为触酶阳性。
2）血浆凝固酶试验：血浆凝固酶是金黄色葡萄球菌所产生的一种与其致病力有关的侵袭性酶，分游离型和结合型两种。
其作用是使血浆中的纤维蛋白在菌体表面沉积和凝固以阻碍吞噬细胞的吞噬。
可分别用试管法和玻片法检测。
玻片法用于粗筛，若玻片法为可疑或阴性结果，还需用试管法确证。
使用的血浆为EDTA抗凝兔血浆。
有商品化乳胶凝集试验。
3）甘露醇发酵试验。
4）新生霉素敏感试验：凝固酶阴性的葡萄球菌的鉴别，采用新生霉素敏感试验。
葡萄球菌
（五）抵抗力
在不形成芽胞的细菌中金黄色葡萄球菌抵 抗力最强
对干燥、热和化学消毒剂有一定的抵抗力 60℃1h或80℃30min才能将其杀死。在2%石炭酸 中15min死亡。 耐盐，在含有10%-15% NaCl的 培养基中仍能繁殖 对某些染料较敏感 如1∶10-20万倍稀释 的龙胆紫溶液能抑制其生长 易产生耐药菌性
初步诊断应符合以下特征：
① 镜检符合葡萄球菌的形态学特征
② 菌落色素为脂溶性金黄色，血平板上有完 全透明的溶血现象 ③ 甘露醇发酵阳性 ④ 血浆凝固酶阳性 ⑤ 耐热核酸酶检测阳性，肠毒素的鉴定，在 专业实验室进行
四、防治原则 无特异性防治 注意个人卫生，及时处理皮肤创伤
加强食品加工或饮食服务工作的管理
5.剥脱性毒素(表皮溶解毒素)
是蛋白质， 能裂解表皮的棘状颗粒层细胞， 引起烫伤样皮肤综合征 (SSSS)。该毒素分 A、B 两种类型。前者耐热 (100℃,20min)，由染色体 基因控制；后者不耐热， 60 ℃ 30min 灭活，由 质粒控制 作用:能裂解表皮的棘状颗粒层细胞使表皮 和真皮脱离
如病人得不到及时治疗，可有20%病人 死亡
④毒素性休克综合征（TSS)
由产生 TSST-1 的金黄色葡萄球菌引起。病人 表现为突然高热、呕吐、腹泻、弥漫性红疹、 瘀斑或多形性皮疹，继有脱皮、低血压、粘膜 病变 (口咽、阴道等)；严重的病人还出现心、 肾衰竭，甚至休克 TSS 过去常见于经期使用受污染或未经消毒 月经塞的妇女，但现亦见于儿童和成人
葡萄球菌
第一节 葡萄球菌属
葡萄球菌属是 G+ 球菌，是化脓菌中最常见 者，广泛分布于自然界，因其常堆聚成葡萄串 状，故名。本属包括30多个种，其中金黄色葡 萄球菌致病性强，分布广泛，可引起许多严重 感染。表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌是人体正 常菌群，前者偶尔能引起感染
葡萄球菌凝固酶的检测及临床应用
葡萄球菌凝固酶的检测及临床应用【摘要】葡萄球菌凝固酶(staphylocoagulase)能使含有枸椽酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固。
葡萄球菌凝固酶的检测方法主要有玻片法、试管法、乳胶凝集法(slidex staph-kit)和基因扩增法。
葡萄球菌凝固酶可用于鉴定致病性葡萄球菌，为金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）分型。
经生物技术加工后的金葡菌滤液，是一种含有多种生物学活性物质的生物制剂，可用于治疗难治性溃疡、皮肤缺损和骨折等。
【关键词】葡萄球菌凝固酶；实验室技术与方法；临床应用葡萄球菌(staphylococcus)是革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界的空气、水、土壤中,是最常见的化脓性球菌，也是医院和社区感染常见病原菌之一［1］。
据2006年3月原核生物名录(list of prokaryotic names with standing in nomenclature, lpsn)公布，葡萄球菌属包含39个种，其中11个种可分亚种［2］。
葡萄球菌凝固酶，是与葡萄球菌致病力有关的一种侵袭性酶，其作用是使血浆中的纤维蛋白在菌体表面沉积和凝固，以抵抗吞噬细胞的吞噬，此过程亦是血浆凝固的过程［3］。
在凝固酶阳性葡萄球菌中，金黄色葡萄球菌是全球性医院和社区获得性感染最常见的病原菌之一，每年引起全世界范围250万例肺炎，700万例耳部感染和3千例脑膜炎等［4］。
因此，及时准确的了解是否有葡萄球菌凝固酶产生并选择合适的检测方法，对准确鉴定致病性葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌，具有重要意义。
结合近年来国内外相关文献，本文就葡萄球菌凝固酶的特点，检测方法及其临床应用三方面进行综述。
1葡萄球菌凝固酶的特点1.1 理化性质葡萄球菌凝固酶的相对分子质量约为350 000，糖含量为18.1%，主要紫外吸收峰位于260nm处,α-螺旋含量占27.3%，含甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸等17种氨基酸， n-末端为天冬氨酸。
球菌
SPA抗吞噬的原理
吞噬细胞 Fc 受体 SPA IgG 细菌
体外作用：
协同凝集试验（coagglutination） 广泛应用于多种微生物抗原检测。
(2)荚膜多糖： 有利于细菌粘附
(3)多糖抗原： 存在于细胞壁，有群特异性。
4.分类
金黄色葡萄球菌（S. aureus） 腐生葡萄球菌（S. saprophyticus）
为毒素性食物中毒，随着毒素的消失1-2天痊愈。
(5)表皮剥脱毒素（exfoliative toxin）
—引起金黄色烫伤样皮肤综合征,又称剥脱性皮炎 （staphylococcal scalded skin syndrome, SSSS）
(6)毒性休克综合征毒素-1（TSST-1）
—引起多器官系统功能紊乱或毒性休克综合征 （TSS）
第9章
球菌（coccus）
对人类有致病性的球菌包括以下四个菌属中 的一些球菌： ① ② ③ ④ 葡萄球菌属 链球菌属 肠球菌属 奈瑟菌属
G＋球菌: 葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、肠球菌 G－球菌: 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌
化脓性球菌（pyogenic coccus）： 引起机体化脓性炎症的球菌。
第二节 链球菌属
（Streptococcus）
链球肺炎链球菌 主要引起人类的化脓性炎症
1)据色素、生化反应 表皮葡萄球菌（S. epidermidis）
三种葡萄球菌的主要性状比较
性状 菌落色素 金黄色葡萄球菌 金黄色 表皮葡萄球菌 白色 腐生葡萄球菌 白色或柠檬色
发酵甘露醇
血浆凝固酶 α溶血素 耐热核酸酶 SPA 致病性
+
+ + +
+
—
耐药菌分类及英文缩写
MRSA耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
MRSE耐甲氧西林表皮葡萄球菌
MRCONS耐甲氧西林凝固酶阴性的葡萄球菌
VRE耐万古霉素葡萄球菌
VRSA耐万古霉素金黄色葡萄球菌
CRE耐碳青霉烯的肠杆菌
CR-AB耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌
CR-KP耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌
CR-EC耐碳青霉烯的大肠埃希菌
CR-PA耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌PDR-AB泛耐药的鲍曼不动杆菌
MDR/PDR-PA泛耐药的铜绿假单胞菌
MDRG-多重耐药的革兰阴性杆菌
MDRG+多重耐药的革兰阴性杆菌
XDR只对一种或两种药物敏感的细菌
细菌的生化鉴定
综合的部分常见菌鉴别试验表1 常见产黄色素菌种的鉴别菌名氧化酶动力葡萄糖吲哚硝还ONPG麦芽糖木糖七叶苷Mac生长少动鞘氨醇单胞+ + + - - + + + + - 浅黄金色单胞菌- + + - + + + + + + 栖稻黄色单胞菌- + + - - - + + - + 嗜麦芽窄食单胞- + + + + + - + + 食醇鞘氨醇杆菌+ - + - - + + + + + 多食鞘氨醇杆菌+ - + - - + + + + + 脑膜炎败血黄杆+ - + + - + + - + V 有毒威克斯菌+ - - + - - - - （+）- 短稳杆菌+ - + + - - + - - + 洋葱伯克霍尔德+/- - + + + + + + + 产吲哚金黄杆菌+ - + + + - + - + + 食醇鞘氨醇杆菌阿拉伯阴性,甘露醇阳性,多食鞘氨醇杆菌相反。
（+），多数阳性；（-），多数阴性；V，不定；空缺的是暂时未查到确切结果。
表2葡萄球菌与其他革兰阳性球菌的鉴别菌属严格需氧四联排列紧粘琼脂动力触酶氧化酶厌氧葡萄糖产酸杆菌肽耐药呋喃唑酮耐药5.0％NaCl琼脂生长葡萄球菌属－ d －－+ － d + －+气球菌属－+ －－－－（+）－－+动性球菌属+ d －+ + －－+口腔球菌属－ d + －±－+ －－－微球菌属+ + －－+ + －－+ +注：杆菌肽0.04U/片，（+）为耐药，（-）为敏感，抑菌环10～25mm；呋喃唑酮100μg/片，抑菌环≤9mm为耐药（+），抑菌环15～35mm为敏感（-）。
葡萄球菌、动性球菌、口腔球菌和微球菌都属微球菌科。
表3常见凝固酶阴性葡萄球菌的鉴定试验菌名新生霉素硝酸盐还原尿素酶甘露醇产酸*蔗糖产酸*麦芽糖产酸覃糖产酸表皮葡萄球菌S （＋）＋－＋＋－头状葡萄球菌S （＋）－＋＋－－孔氏葡萄球菌R （－）±（＋）（－）±＋溶血葡萄球菌S （＋）—V ＋＋＋腐生葡萄球菌R －＋＋＋＋＋模仿葡萄球菌S ＋＋＋＋（±）±人型葡萄球菌S ＋＋－＋＋±里昂葡萄球菌S ＋±＋＋＋＋施莱弗葡萄球菌S ＋－＋－－±华纳葡萄球菌S ±＋±＋（＋）＋注：产酸试验应加石蜡油。
病原性球菌及检验
病原性球菌及检验球菌种类很多，根据革兰氏染色的不同，分为G-、 G+两类球菌。
G+有：葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌和微球菌。
G-有：脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、卡他布兰汉氏菌等。
对人体致病的球菌称病原性球菌，因能引起机体化脓性炎症，故又称为化脓性球菌。
常见的有葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌。
一、葡萄球菌属(一)形态与染色葡萄球菌呈不规则堆集排列，形似葡萄串状，也可见单个、成对或短链排列。
为G+性球菌，直径0.5-1.5um，（致病性葡萄球菌菌体较非致病性葡萄球菌菌体小）无芽胞，无鞭毛、无荚膜；无动力。
(二)分类 1965年按血浆凝固酶分为：血浆凝固酶阴性葡萄球菌，血浆凝固酶阳性葡萄球菌。
1.血浆凝固酶阴性葡萄球菌包括：表皮、腐生葡萄球菌。
2.血浆凝固酶阳性葡萄球菌包括：金黄色、中间型、家畜葡萄球菌。
(三)抗原本菌水解后，用沉淀法可获两种抗原即蛋白抗原和多糖抗原。
1.蛋白抗原：是一种表面抗原，为完全抗原；有种特异性，无型特异性。
存在葡萄球菌细胞壁的表面，结合在细胞壁的粘肽部分，具有抗吞噬作用，称葡萄球菌A蛋白。
2.多糖抗原：是半抗原，存在于细胞壁上，是金黄色葡萄球菌的重要抗原。
有型特异性，分A、B、C三型。
(四)标本接种1.脓汁、尿道分泌物、脑脊液沉淀物，通常直接接种在血琼脂上，经37℃24-48h培养，可见直径2-3mm，产生不同色素的菌落。
2.粪便、呕吐物应接种卵黄高盐、高盐甘露醇琼脂平板上，经37℃24-48h培养可形成细小菌落，48h后形成典型菌落。
3.疑为败血症者，抽取静脉血5ml，注入50ml葡萄糖肉汤培养基中。
(五)培养特性需氧或兼性厌氧，对营养要求不高。
在20%CO2环境中，有利于毒力产生。
最适温度37℃，最适PH7.4。
DNA中G+C含量：30-39%。
1.在普通琼脂平板上，经37℃、24-48h培养，可形成圆形，凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽、不透明、脂溶性色素的菌落，直径一般为1-2mm，但大者也有4-5 mm的菌落。
细菌室生物安全风险评估报告
XX院检验科细菌室实验活动风险评估报告一、概述依据WHO《实验室生物安全手册》（第三版2004），本实验室为BSL-2级生物安全实验室，仅为临床检验实验室，主要实验活动为向临床治疗活动提供所需数据的细菌、真菌培养及药敏试验等，不从事大量增殖培养实验。
二、拟操作生物因子的危害程度本实验室操作的病原微生物均属于第二类或第三类感染性物质，详见表1 病原微生物汇总表表1 病原微生物汇总表除此之外，其中常见检测的具有乙类传染的有伤寒和副伤寒沙门菌、志贺菌等能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且实验室具备有效治疗和预防措施的微生物，属于第三类病原微生物;另外，具有甲类传染的鼠疫杆菌、霍乱弧菌以及炭疽芽胞杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、粗球孢子菌等可能引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物，属于第二类病原微生物，本实验室只检测这类病原微生物中的“霍乱弧菌”危害相对较小的病原微生物，对于“鼠疫杆菌”及其他细菌等，本实验室不作为常规检测项目，但为防止病人所送样本可能具有此类微生物，也作了相关防护措施。
本实验室常规不检测那些引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物等第一类微生物。
三、实验活动的危险性三.1实验活动是指实验室从事与临床相关的细菌，真菌培养、鉴定及药敏试验、教学培训、诊断等活动。
三.2实验活动的类型根据实验室流程，主要涉及的有样本采集运输、接收、处理、实验室检测（培养、鉴定、药敏）操作、锐器使用及生物安全柜等设备的使用、废弃物处理等。
实验操作包括标本接种，阅读平板、上机鉴定药敏试验、补充药敏试验、涂片检查、保留菌株等过程。
三.3实验活动风险识别1.操作风险1.1气溶胶产生风险主要来源于打开标本，打开平板，调菌液、灼烧接种环等实验活动，以及标本平板转运过程中可能发生的倒翻、容器破裂和样本洒溅等情况风险控制措施：所有标本接种过程均在可靠的处于正常运行的生物安全柜内操作，操作过程动作应轻柔。
《医学微生物学》临床常见病原菌的培养与鉴定
《医学微生物学》临床常见病原菌的培养与鉴定病原菌的鉴定是将一个未知菌株按其生物学特征，经过与所有已知菌种进行比较后到一个已知菌种的分析过程。
根据感染特性选择合适的培养基，首先要明确被鉴定菌种已获得纯培养。
然后确定革兰氏染色性、形态，再按科、属、种逐步鉴定下来。
应该利用已具备的条件，尽可能地缩小鉴定范围，这是在作实验设计时必须想到的，要用最小数量的试验方法作出鉴定。
基于鉴定菌的特点，选用合适的鉴定体系，力求方法学简单，反应判断明确，价廉的方法。
血清学鉴定由于操作简便、快速、特异性高，给细菌学鉴定提供了快速诊断方法。
对培养困难的病原菌，可考虑应用基因水平的鉴定技术。
最后还要提示，对检测人员应把知识和经验运用到每一鉴定步骤。
【球菌】球菌主要引起化脓性炎症，故又称化脓性球菌。
包括葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌及淋病奈瑟菌等，根据革兰氏染色可将其分为两类，均无鞭毛和芽孢，少数可形成荚膜。
本实验要求了解化脓性球菌的形态特征及染色性、链球菌溶血素“O”试验；葡萄球菌、链球菌及奈瑟球菌的检验程序和主要的鉴定方法；肺炎链球菌Op—tochin敏感试验。
一、葡萄球菌属葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌常堆聚成葡萄串状。
能引起皮肤粘膜、多种组织器官的化脓性炎症，是最常见的化脓性球菌。
有的菌株还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征、毒性休克综合征等，又是医院内交叉感染的重要传染源。
近年来，耐药性菌株逐年增多。
临床上首先要与其他革兰氏阳性球菌鉴别，然后再作属内种的鉴定及致病性的检测。
[材料]1．菌种：葡萄球菌培养物。
2．培养基：血琼脂平板，普通琼脂平板，甘露醇发酵管，氧化、发酵(OF)管，甲苯胺蓝核酸琼脂。
3．试剂：兔血浆、3％H2O2、致敏胶乳／红细胞制剂。
4．其他：革兰氏染液、玻片、一次性卡片。
[方法]1．形态学观察：取普通琼脂平板上葡萄球菌培养物少许，涂片，革兰氏染色，镜检。
可见到葡萄状排列的革兰氏阳性球菌。
9-葡萄球菌
（3）烫伤样皮肤综合征
（4）毒性休克综合症
所致疾病
烫伤样皮肤综合征
致病性与免疫性
所致疾病
烫伤样皮肤综合征
所致疾病
毒性休克综合症
致病性
金黄色葡萄球菌的致病物质与所致疾病
致病物质 血浆凝固酶 所致疾病 侵袭性疾病：皮肤局部的化脓性炎 症 各种器官的化脓性感染； 全身的感染和败血症、脓毒血症等； 食物中毒；假膜性肠炎；
3. 简述金黄色葡萄球菌所致的疾病类型。
血浆凝固酶，
能否分解甘露醇，
耐热核酸酶。
防治原则
注意个人卫生和消毒隔离，及时处 理皮肤创伤。
皮肤化脓性感染的人(特别是手部 感染)未愈前不应从事食品加工或饮食 服务工作，以防止就餐人员食物中毒。
治疗应根据药物敏感性试验结果， 选用敏感抗菌药物。
防治原则
医务人员在接触感染者后，手指 要充分消毒再接触其他患者。预防交 叉感染发生。 对反复发作的顽固性疖疮，采用 自身菌苗或用类毒素人工自动免疫疗 法有一定疗效。
一、生物学性状
（一）形态与染色
呈球形；G+，典型排列呈葡萄状； 无鞭毛和芽胞，体外培养一般不形成荚膜 衰老、死亡或被吞噬细胞吞噬易染成G--
生物学性状
光学显微镜油镜
扫描电子显微镜
生物学性状
金黄色葡萄球菌G+
金黄色葡萄球菌电镜图
生物学性状
葡萄球菌
葡萄球菌L型（B）
（扫描电镜，×12000）
一组热稳定的可溶性蛋白，
100℃可耐受30min
抗胃蛋白酶分解；
刺激呕吐中枢，导致以呕吐
为主要症状的食物中毒
致病性
6、表皮剥脱毒素(exfoliatin)：