生物素标记的活性小分子探针的设计、合成及应用研究
生物素标记EMSA探针-AP1
生物素标记EMSA探针－AP1 产品简介： 生物素标记EMSA探针－AP1是用于EMSA(也称gel shift)研究的并经生物素(Biotin)标记的AP1 consensus oligonucleotide。 这个生物素标记的双链寡核苷酸含有公认的AP1结合位点，可以用作EMSA研究时的探针。 AP1 consensus oligo的序列如下： 5’-CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA-3’ 3’-GCG AAC TAC TGA GTC GGC CTT-5’ 本生物素标记EMSA探针已经过纯化，可以直接用于EMSA结合反应。 本生物素标记EMSA探针可以和碧云天的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)配套使用。 一个包装的生物素标记探针可以进行约200-400个样品的EMSA检测。 保存条件： -20℃保存，一年有效。 注意事项： 避免加热到40℃以上，温度过高会导致双链DNA探针解聚成单链。而单链无法用于EMSA研究。 对于基于生物素标记的EMSA检测的详细操作可以参考碧云天的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)的使用说明。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.本生物素标记EMSA探针用于EMSA结合反应时，参考如下步骤进行： A.如下设置EMSA结合反应： 阴性对照反应： Nuclease-Free Water 7-7.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 0μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 探针冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 未标记的探针 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl Super-shift反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 目的蛋白特异抗体 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 样品反应： Nuclease-Free Water 5-5.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 突变探针的冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 未标记的突变探针 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl
化学小分子探针在药物发现中的应用
化学小分子探针在药物发现中的应用 仇文卫，汤杰 华东师范大学化学系、药物化学研究所 当今创新药物的发现越来越依赖于靶点的发现以及靶点与活性化合物作用模式的确定，化学小分子探针在这两方面的特出优越性使其成为药物化学的研究热点。 1、 创新药物的发现、靶点与化学小分子探针 药物可以挽救生命、治疗疾病、改善健康状况、缓解痛苦和各种不适，因此，可以说药物改变着我们的生活，也影响着整个世界。然而，目前开发新药的费用平均每个高达数亿美元，尽管投入如此之高，从研发到上市仍约需10-12年之久（图1）。因此新药研发迫切需要新技术、新理论，以提高效率、缩短周期。 计算机药物设计2～3年 2～3年2～3年 年 周期长：10～12年耗资达：3.5～5.5亿美元 图1. 新药研发过程 现代药物的发现过程主要包括靶点(target)的识别、先导物的发现、结构优化、临床前及临床试验等阶段，其中正确的靶点识别是影响整个过程的关键步骤
之一。靶点也称为受体（receptor），是指与药物分子在体内相互作用的功能性大分子，通常是某种蛋白质（绝大部分靶点是蛋白质）、核酸、离子通道或DNA 等。药物分子在体内作用于靶点的特定部位，形成复合物，从而诱发生物化学及生理学上的变化，产生药物效应，达到治疗疾病的目的。若能发现这些靶点，就可以在此基础上建立相应的筛选模型，对活性化合物进行高效率的活性评价。从而促进先导物发现和结构优化的进程。可见，现今药物的发现已越来越依赖于药物靶点的发现。 那么如何解决药物靶点的发现问题呢？虽然，生命科学领域的研究近年来取得了巨大成就，2001年人类基因组工程的完成更是一个里程碑式的进步。然而，何种蛋白质是针对某种疾病的小分子药物的靶点，在目前基因水平上的生物技术仍然无法解决。随着后基因时代的到来，人们逐渐认识到蛋白质才是生理功能的执行者，也是生命现象的直接体现者。这其中有可能蕴藏着开发疾病诊断方法和新药的“钥匙”，在基因组学基础上开展蛋白质组学研究将有可能导致药物开发方面的实质性突破。因此针对药物发现的技术重心已经由基因组转向了蛋白质组。利用化学小分子的多样性，选择适当的活性小分子，设计合成能够高选择性地探测蛋白质的功能、结构以及与活性小分子作用模式的探针——化学小分子探针，可以为重大疾病的诊断和防治提供新的标记物、新的药物作用靶点和新的先导结构，从而为创新药物的发现奠定基础。 在药物发现过程中，化学小分子探针主要有以下几个方面的作用（图2）：1. 针对靶点已知的有药理活性的化合物，可以进行以下三个方面的研究：(1)了解药物分子与靶点作用部位的结构信息，为进一步的结构改造提供帮助；(2)利用探针分子研究靶点蛋白在生理与病理状态下的分布情况，深入研究蛋白质的功能；(3)利用探针分子进行细胞或体内的标记实验，可能会发现一些与活性化合物有交叉作用的靶点蛋白，从而为已知的小分子药物可能产生的毒副作用提供预测。2. 对于体内作用靶点未知，有药理活性的化合物，特别是来自天然产物的活性化合物，可以将其设计成探针分子，通过对细胞或动物的标记实验来发现其体内的作用靶点，建立新靶点的筛选模型，为先导物的结构优化服务。
高中生物素的生理作用
生长素的生理作用 【引言】 经过多位科学家的研究，发现了生长素，那生长素到底有什么样的作用呢？这正是我们这节课所要讨论的话题。生长素能调节细胞的生长，但是其发挥作用时具着它的特殊性——两重性，既能促进生长，也能抑制生长；既能促进发芽，也能抑制发芽；既能防止落花落果，也能疏花疏果。在我们生产生活中，最常见的反映生长素两重性的事例就是顶端优势，植物的顶芽优先生长而侧芽生长受到抑制的现象。生长素和农业密切相关，在农业上，它既可以促进扦插枝条生根，也可以促进果实的发育，还可以防止落花落果。总之，植物体的生命活动是通过植物体内的激素调节来实现的，尽管植物激素的含量极少，但是却是植物的生长，发育和繁殖等生命活动能有条不紊，正常进行，使植物体更好的适应不断变化的环境。 【教学目标】 知识目标： 1、掌握生长素的生理作用，理解顶端优势的原理。 2、通过分析“生长素浓度与所起作用的关系”图，能够简述生长素作用的两重性；植物不同器官对生长素的敏感性不同。 3、描述植物顶端优势的现象、原因、解除方法及应用。 4、了解生长素及其类似物在农业生产实践中的应用。 能力目标： 1、学会用已学知识来分析问题、解决问题。 情感态度与价值观： 1、通过生长素的生理作用，训练学生将知识运用于实践的能力。 2、通过课后探究活动，培养协作精神。 【重点】·突破策略： 重点： 1、生长素在发挥生理作用时的特点——两重性。 2、生长素在农业生产中的应用。 突破策略： 1、分析图表，引导学生总结生长素发挥作用时所表现的特点。 2、通过日常生活中的事例的分析，让学生更加深刻的理解生长素在农业生产中的应用。 3、共同探究扦插枝条生根时所需的生长素类似物最适的浓度。 【难点】·突破策略： 难点： 1、顶端优势产生的原因以及在生产生活中常见的实例分析。 2、生长素生理作用的两重性及应用问题。 突破策略： 1、通过生产生活中常见实例让学生分析理解顶端优势。 2、借助“同一株植物的不同器官对生长素浓度的反应”曲线图，突破生长素生理作用的两重性。 【教具准备】 多媒体教学软件：松树的塔形树冠；去顶芽后侧芽的生长情况；植物某一器官对不同浓度生长素反应图；根、茎、芽三个器官对不同浓度生长素反应图。 【学法指导】：本节内容可读性强，实验性强，动态性强。在教学过程中，引导学生学会运用理论知识于实验设计中；科学指导学生通过阅读、观察、课后实验等方法去落实知识。
DNA3’端生物素标记
1、准备工作： A、取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。 B、取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。如果待标记的EMSA探针为双链， 95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA探针转变为单链的探针，然后同样用水稀 释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA 探针浓度为0.5μM。 2、DNA探针的标记： Ultrapure water 29μl TdT Buffer(5X) 10μl 待标记探针(1μM) 5μl Biotin-11-dUTP(5μM) 5μl TdT(10U/μl) 1μl 总体积 50μl A、参考上述设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。 B、用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37℃孵育30分钟。 C、加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。 3、TdT的去除： A、探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。 B、12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探针。 4、探针的纯化(选做)： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。 如需纯化，可以按照如下步骤操作： A、对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。 B、-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。 C、4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。 D、4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 E、加入50μl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20℃保存。 5、生物素标记探针标记效率的检测： A、取5μl Biotin-Control Oligo(0.4μM)，加入196μl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 B、取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27μl TE，混匀，稀释成10nM 生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 C、参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。对于经过
有机小分子探针
有机小分子探针 黄美英 2014010714 摘要细胞内生物活性化合物在细胞内作用靶点的确定是化学生物学和药物开发中的关键 问题之一。作为功能蛋白质组学中的一项重要技术, 小分子探针在确定生物活性化合物细胞内作用靶点的研究中扮演着举足轻重的角色。PH值在生理及病理过程如受体介导的信号传导、酶活性、细胞生长和凋亡、离子运输和稳态调节、钙含量调节、细胞内吞作用、趋化作用、细胞粘附和肿瘤生长等过程中起到非常重要的作用。本文介绍了几种小分子探针原理，技术和方法，并通过列举近年来该技术应用的成功示例进一步阐明小分子生物活性探针技术的应用原理和重要性。 关键词生物活性化合物；小分子探针；PH值；DNA探针技术 一绪论 荧光探针是化学传感技术领域在上个世纪八十年代的一项重大发现，目前己有愈来愈多的荧光探针应用于分子水平上进行实时检测。荧光检测技术由于灵敏度高，操作简便，可视性强，且对细胞、生物体的损伤小，成为了用于临床分析、环境监测、生物分析及生命科学等领域不可缺少的检测工具[1]。分子荧光探针的检测对象包括各种离子、小分子、自由基、多肽、酶，甚至还包括温度、极性、粘度等。人们可以使用荧光显微镜、荧光光谱仪、流式细胞仪、荧光活体成像系统等仪器获取荧光探针检测的相关信息，借助荧光成像技术我们能够实时检测活细胞内分子或离子的浓度以及生物大分子结构的变化过程，也可以获得关于生物组织生理代谢过程的相关信息，还可以实现生物活体的荧光成像[2]。另一方面研究者们能够根据需要设计合成出满足“特定要求”的探针分子，基于此，荧光探针和荧光检测技术在生命科学的发展中起到举足轻重的作用[3]。 通常一个光探针分子由荧光团（Fluorophore）和识别基团（Receptor）通过连接臂（Spacer）以共价键方式连接，荧光团作为信号转换器将识别行为转化为光信号，可以通过荧光的增强或淬灭乃至光谱位移的变化对分析物进行识别。荧光探针分子具有非常大的可塑性和应用潜力，通过对有机分子结构进行巧妙设计和改造，就能够设计合成出满足各种需要的荧光探针。按照光化学反应原理，荧光传感器主要可以分为以下几类：光诱导电子转移(photoinduced electron transfer，PET)，分子内电荷转移(internal charge transfer, ICT)，扭转分子内共轭电荷转移（twisted intramolecular charge transfer, TICT），分子内单体-激基缔合物(monomer/excimer)，金属-配合体电荷转移(metal-to-ligand charge transfer, MLCT)，光诱导荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)，激发态分子内质子转移(excited state intramolecular proton transfer, ESIPT)，聚集诱导发光（aggregation-induced emission, AIE），C=N 异构化（C=N isomerization）。荧光探针因其具有体积小、成本低、无需预处理、不受外界电磁场影响等优良特性可以广泛应用于临床分析、环境监测、生物分析及生命科学等领域，成为当前一个重要的研究热点。寻找灵敏度高、选择性好、对光稳定、
探针标记
核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。 第四节非放射性标记的核酸探针 放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技
术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。 酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。 化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA 或RNA分子上。 非放射性标记核酸探针方法很多，现介绍常用的几种方法如下： 一、生物素标记核酸探针方法 生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。
生物素-探针实验步骤
罗丹明-探针实验步骤 1）贴壁细胞系在15cm平板中15ml培养基中生长至约90％。去掉培养基，用PBS洗涤细胞2次，然后加入新鲜培养基（15ml）。 （2）加入探针（探针终浓度为0.001-10μM或者终浓度为2μM），振荡摇匀，然后在37℃温育1小时。温育后，除去培养基，用15ml PBS洗涤细胞3次。 （3）收获细胞，用PBS清洗两次，然后加入裂解液，4℃，30min。探针超声，高速离心（16000g，4℃，15min）。 （4）BCA法测量蛋白浓度。（3mg/ml）。 二、Click反应 （1）取43ul的样品，加入终浓度为20 μM生物素叠氮化物，1mM TCEP，100μM TBTA和1mM CuSO4，并使终体积为50μl，混匀。反应在室温下进行1小时。（2）点击结合后，加入冰-80℃（甲醇：水：氯仿=4：3：1）10倍量，-20℃，4h。后用5mL冷甲醇洗涤3次。用UB（8M的尿素0.1M Tris/HCL PH8.0所配）复溶蛋白。 （3）加入12.5ul的5*sds，煮样，跑胶，扫描凝胶， (4)银染， (5)胶内酶解 (6)除盐 (7)测质谱 生物素-探针实验步骤 一、细胞处理 （1）贴壁细胞系在15cm平板中15ml培养基中生长至约90％。去掉培养基，用PBS洗涤细胞2次，然后加入新鲜培养基（15ml）。 （5）加入探针（探针终浓度为0.001-10μM或者终浓度为2μM），振荡摇匀，然后在37℃温育1小时。温育后，除去培养基，用15ml PBS洗涤细胞3次。 （6）收获细胞，用PBS清洗两次，然后加入裂解液，4℃，30min。探针超声，高速离心（16000g，4℃，15min）。 （7）取上清留样（input），BCA法测量蛋白浓度。（3mg/ml）。 二、Click反应
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标 记方法 Last revision on 21 December 2020
地高辛标记核酸探针的标记方法 核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。 采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA
探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。 对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。 1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法 1. 1 DNA 探针的标记方法 1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。 1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标记方法 核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙
元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。 采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR 法将其掺入到DNA探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。 对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。 1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法 1. 1 DNA 探针的标记方法 1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。 1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标
生物素
第十一章生物素—亲和素免疫放大技术 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：生物素—亲和素免疫放大技术、生物素、亲和素的概念，生物素—亲和素免疫放大技术的主要类型，原理和临床应用； 熟悉：生物素—亲和素免疫放大技术的类型、原理及临床应用； 了解：生物素及亲和素特性及其结合抗体的制备方法，各检测技术方法的技术要点。 二、教学内容 1．胶体金与免疫金制备：生物素及亲和素特性及其制备，生物素的制备。 2．生物素—亲和素免疫放大技术的类型、原理。 3．生物素—亲和素免疫放大技术临床应用与评价。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1.既能用于标记蛋白质氨基,又能标记蛋白质醛基的活化生物素是 A.BNHS B.BCHZ C.BHZ D.MPB E.BCNHS 2.间接法BA的反应模式为 A.Ag-(Ab-B)-A* B.Ag-Ab1-(Ab2-B)-A* C.Ag-(Ab-B)-A-B* D.Ag-(Ab-B)-AB*C E.Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-B* 3 下列哪一项属于长臂活化生物素 A.BNHS B.BHZ C.BCNHS D.BCHZ E.MPB 4.MPB是氯化生物胞素与3-(N-马来酰亚胺-丙酰)-N-BNHS在什么溶液中反应后制得的 A.二甲基甲酰胺 B.碳二亚胺 C.N-羟基丁二酰亚胺 D.马来酰亚胺 E.水合肼 5.每个亲和素能结合多少个分子的生物素 A.1 B.2
C.3 D.4 E.5 6.生物素通过噻吩环戊酸侧链上的什么部位与多种大分子偶联 A.羰基 B.-NH C. 羧基 D.-CH3 E.-NH2 7.常用于标记抗体的活化生物素是 A.BNHS B.BHZ C.BCNHS D.BCHZ E.MPB 8.在生物素标记抗体时,生物素:IgG 的比例(mg/mg)为多少时,效果较好 A.1:1 B.3:1 C.4:1 D.2:1 E.5:1 9.在用生物素标记酶时,酶活性会降低的是 A.HRP B.葡萄糖氧化酶 C.β-Gal D.AP E.LDH 10.亲和素-生物素化碱性磷酸酶(ABAP)复合物的制备是将亲和素溶液与生物素化AP按多少浓度比反应后制得 A.1:1 B.2:1 C.3:1 D.4:1 E.5:1 11.标记蛋白质氨基的活化生物素是 A.BHZ B.MPB C.光生物素 D.生物素脱氧核苷三磷酸 E.BNHS 12.标记蛋白质巯基的活化生物素是 A.MPB B.BNHS C.BHZ
化学小分子探针在药物发现中的应用
化学小分子?探针在药物?发现中的应? 用 仇文卫，汤杰 华东师范大?学化学系、药物化学研?究所 当今创新药?物的发现越?来越依赖于?靶点的发现?以及靶点与?活性化合物?作用模式的?确定，化学小分子?探针在这两?方面的特出?优越性使其?成为药物化?学的研究热?点。 1、 创新药物的?发现、靶点与化学?小分子探针? 药物可以挽?救生命、治疗疾病、改善健康状?况、缓解痛苦和?各种不适，因此，可以说药物?改变着我们?的生活，也影响着整?个世界。然而，目前开发新?药的费用平?均每个高达?数亿美元，尽管投入如?此之高，从研发到上?市仍约需1?0-12年之久?（图1）。因此新药研?发迫切需要?新技术、新理论，以提高效率?、缩短周期。 计算机药物设计2～3年 2～3年2～3年 3～4年 周期长：10～12年耗资达：3.5～5.5亿美元 图1. 新药研发过?程
现代药物的?发现过程主?要包括靶点?(targe?t)的识别、先导物的发?现、结构优化、临床前及临?床试验等阶?段，其中正确的?靶点识别是?影响整个过?程的关键步?骤之一。靶点也称为?受体（recep?tor），是指与药物?分子在体内?相互作用的?功能性大分?子，通常是某种?蛋白质（绝大部分靶?点是蛋白质?）、核酸、离子通道或?DNA等。药物分子在?体内作用于?靶点的特定?部位，形成复合物?，从而诱发生?物化学及生?理学上的变?化，产生药物效?应，达到治疗疾?病的目的。若能发现这?些靶点，就可以在此?基础上建立?相应的筛选?模型，对活性化合?物进行高效?率的活性评?价。从而促进先?导物发现和?结构优化的?进程。可见，现今药物的?发现已越来?越依赖于药?物靶点的发?现。 那么如何解?决药物靶点?的发现问题?呢？虽然，生命科学领?域的研究近?年来取得了?巨大成就，2001年?人类基因组?工程的完成?更是一个里?程碑式的进?步。然而，何种蛋白质?是针对某种?疾病的小分?子药物的靶?点，在目前基因?水平上的生?物技术仍然?无法解决。随着后基因?时代的到来?，人们逐渐认?识到蛋白质?才是生理功?能的执行者?，也是生命现?象的直接体?现者。这其中有可?能蕴藏着开?发疾病诊断?方法和新药?的“钥匙”，在基因组学?基础上开展?蛋白质组学?研究将有可?能导致药物?开发方面的?实质性突破?。因此针对药?物发现的技?术重心已经?由基因组转?向了蛋白质?组。利用化学小?分子的多样?性，选择适当的?活性小分子?，设计合成能?够高选择性?地探测蛋白?质的功能、结构以及与?活性小分子?作用模式的?探针——化学小分子?探针，可以为重大?疾病的诊断?和防治提供?新的标记物?、新的药物作?用靶点和新?的先导结构?，从而为创新?药物的发现?奠定基础。 在药物发现?过程中，化学小分子?探针主要有?以下几个方?面的作用（图2）：1. 针对靶点已?知的有药理?活性的化合?物，可以进行以?下三个方面?的研究：(1)了解药物分?子与靶点作?用部位的结?构信息，为进一步的?结构改造提?供帮助；(2)利用探针分?子研究靶点?蛋白在生理?与病理状态?下的分布情?况，深入研究蛋?白质的功能?；(3)利用探针分?子进行
中美科学家在利用小分子探针研究细胞自吞噬领域取得重要突破
2011年9月30日，《细胞》杂志发表了中国科学院上海有机化学研究所和哈佛大学医学院等单位联合完成的研究进展。该文章报道了一种具有高选择性和高活性的细胞自吞噬抑制剂的发现，以及利用这个小分子探针，第一次揭示了两种重要的抑癌蛋白p53和Beclin1之间的内在联系的结果。 细胞自吞噬是细胞依靠溶酶体降解胞内物质的统称。细胞处于饥饿时通过自吞噬降解蛋白质和细胞器，获得维持生存所必需的氨基酸，脂肪酸和核酸等营养物质。细胞自吞噬还负责细胞的自我净化，通过降解和重复利用细胞内老旧蛋白和细胞器，维持细胞内环境稳定和代谢平衡。细胞自吞噬在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键，对防治某些疾病如肿瘤疾病、神经退行性疾病以及对抵抗病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面都发挥重要作用。因此，研究其作用机制不仅可以进一步了解生命的奥秘，同时也为一些疾病的治疗提供新的思路。对于细胞自吞噬机制的研究，能够特异性地调控自吞噬过程小分子是非常重要的研究工具。目前高效、特异、低毒的细胞自吞噬抑制剂还很缺乏，因此发展理想的细胞自吞噬抑制剂十分重要。 上海有机所马大为课题组与哈佛大学医学院教授、上海有机所特聘研究员袁钧瑛的课题组合作，通过筛选和进一步的结构优化，发现了一种高效并具有高选择性的细胞自吞噬小分子抑制剂，命名为Spautin-1。通过深入研究发现该小分子通过对两个去泛素酶----USP10和USP13----选择性抑制，促进Beclin1蛋白泛素化水平增高，进而引起III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶复合物的降解。III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶复合物--Vps34/Beclin1是细胞自吞噬信号通路中重要的调控元件。该复合物主要负责催化磷脂酰肌醇转化为3-磷酸磷脂酰肌醇。其中，Vps34是一种典型的III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶。Beclin1 作为一个重要的抑癌基因，在人类乳腺癌，卵巢癌和前列腺肿瘤等多种癌症中出现变异或者基因单拷贝缺失。泛素-蛋白酶体系是细胞内一种重要的蛋白降解途径，去泛素酶通过控制蛋白的泛素化水平，调节蛋白通过蛋白酶途径的降解。有趣的是，他们发现Beclin1也调控这两个去泛素酶的稳定性。因为USP10同时也是p53蛋白的去泛素酶，所以III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶复合物对去泛素酶的影响也调控着p53蛋白的水平。 这些结果不仅为细胞自吞噬研究提供了重要的研究工具，也揭示了两种重要的抑癌蛋白p53和Beclin1之间的不为人知的内在联系。为人类发展新的癌症治疗药物提供了重要信息。 这项工作得到了国家自然科学基金重大国际合作项目(21020102037)以及重大研究计划项目(90813007)等项目的支持。主要工作在中国科学院上海有机化学研究所完成。
生物素的生理功能及其分子作用机制
生物素的生理功能及其分子作用机制 摘要：生物素是动物机体内维持正常生理机能所必需的一种维生素,它作为4种羧化酶辅酶成分在哺乳动物体内的葡萄糖氨基酸和脂肪酸代谢中起着重要作用,越来越多的研究表明生物素对基因表达的调控起着重要的作用.本文综述了生物素的营养生理作用及其对基因表达调控的影响. 关键词: 生物素营养基因表达 [Abstract]：Biotin is an essential vitamin for animal to maintain normal metabolism. It plays essential roles in theme metabolism of glucose,amino acids and fatty acids serving as coenzyme for four carboxylases in mammals.More and more researches showed that biotin played an important role in regulating gene expression The nutritional and physiological function of biotin and its effects on gene expression were reviewed in this paper [Key words] biotin;nutrition;gene expression 生物素(biotin),是动物机体内维持正常生理机能所必需的维生素之一。由于生物素在饲料中广泛分布,而且动物肠道能够合成生物素,过去人们曾认为猪和家禽饲料中可以不添加生物素。但是,在生产实践中,经常出现生物素缺乏症,尤其在集约化生产条件下,更容易出现生物素缺乏症状。于是,人们开始重新重视和研究生物素的营养作用(MeDowell,一959)。近年来,生物素已成为最受关注的水溶性维生素之一。 1生物素理化特性 生物素广泛分布于动植物中,天然存在的生物素主要以与其它分子结合的形式存在。生物素的化学结构中包括一个含五个碳原子的梭基侧链和两个五元杂环,在体内由侧链上的梭基与酶蛋白的赖氨酸s残基结合,发挥辅酶作用。生物素可能有8种不同的异构体,其中只有D一生物素具有生物活性。在一般情况下,生物素是相当稳定的,只有在强酸、强碱、甲醛及紫外线处理时才会被破坏。生物素是许多需ATP的羧化反应中羧基的载体，羧基暂时与生物素双环系统上的一个氮原子结合，如在丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸的反应中。动物缺乏生物素引起皮肤疾患和脱毛。卵蛋白质含有能与生物素紧密结合的抗生物素蛋白。如大量食用生鸡蛋，因妨碍生物素的吸收，可导致人类生物素缺乏症。在正常情况下，人类肠细菌合成的生物素足敷需要，不会发生生物素缺乏症。在生物体内，它几乎都是作为生物素酶的辅基与蛋白质的赖氨酸的ε-氨基形成共价键。其生理作用主要是由生物素酶引起的固碳作用及羧基转移反应。通过丙酰辅酶A羧化酶，乙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酸单酰CoA 羧基转移酶等反应参与糖和脂肪的代谢。在这些酶促反应中形成的N-羧基生物素作为中间产物。通常条件下生物素相当稳定，亚硝酸、其它强酸、强碱和甲醛可破坏生物素,酸败脂肪及胆碱可使其失活[1]紫外线照射也可逐渐破坏生物素。 2生物素的营养机制 生物素有结合和游离两种存在形式,结合的生物素不能被动物直接利用,必须在肠道经生物素降解酶分解,释放出游离生物素,方能被动物利用。生物素在小肠可较好地吸收在小肠上 1/3~1/2段以完整分子形式被吸收。生物素在小肠可较好的被吸收，生物素在小肠上1/3~1/2段,以完整分子形式被吸收[2] 3生物素与营养素质的代谢 生物素是水溶性的B 族维生素,是动物的必需营养物质,它对生产、食物的利用、上皮组织的健康、骨骼的发育和繁殖均有重要的作用。生物素是羧化和羧基转移酶系的辅酶,是羧基转用的载体,这些酶系在组织中有转移羧基和固定二氧化碳的作用。具体表现在: ①葡萄糖合
常用核酸探针标记方法
常用核酸探针标记方法 1、切口平移法（nick translation） 原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。 图1 切口平移法原理示意图 特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。 2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。 3）DNA模板要用纯化过DNA
2、随机引物法（random priming） 原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。 图2 随机引物标记法原理示意图 特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。 2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。 3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。按标准方法得到 的标记产物长度一般为200-400bp。
第六章探针制备与标记技术
第六章探针制备与标记技术 实验一核酸探针的制备 一、原理和用途 核酸探针制备的方法很多，经典的方法包括以重组单链噬菌体为模板的单链DNA 探针的合成，利用体外转录原理进行的单链RNA探针的合成，以mRNA为模板进行的cDNA探针的合成，以及寡核苷酸的人工合成；目前更为常用且简便的是双链DNA探针的制备，其来源包括纯化的限制性酶切片段或PCR产物。本实验以M13噬菌体为模板，学习单链DNA探针合成的基本操作。 单链DNA探针合成的基本原理是将人工合成的寡核苷酸与重组M13噬菌体中的单链DNA退火结合，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（简称Klenow酶）对退火引物的延伸作用，催化与模板链互补的标记探针的合成。由于反应产物长度及放射性标记dNTP结合量的均一性不高，通常需要对反应产物进行限制酶切和琼脂糖凝胶电泳分离，以便获得长度一致的双链DNA探针。 单链DNA探针特别适合用S1核酸酶或绿豆核酸酶进行的mRNA 51端结构分析，真核基因外显子位置的确定，以液体杂交进行的mRNA定量，无载体序列探针的制备，以及基因或cDNA特定区域的显示等。由于M13噬菌体载体的多克隆部位上游多有lac 基因或T7等启动子序列，根据这些序列合成的寡核苷酸可以作为通用引物，用于任何与噬菌体插入片段互补的单链DNA探针的制备。 二、实验材料 单链M13噬菌体DNA。 三、溶液与缓冲液 1．10 mol/L 醋酸钠 2．1 mol/L DTT 3．0.5 mol/L EDTA，pH 8.0 4．5 mol/L NaCl 5．1：1（V/V）苯酚/氯仿混合液 6．10×Klenow酶缓冲液 7．Klenow酶 8．限制性内切酶及其缓冲液 9．20 mmol/L dCTP、dGTP、dTTP混合液 10．5 pmol/μL M13噬菌体通用引物（溶解于pH 7.6的TE缓冲液中） 11．40 μmol/L和20 mmol/L dATP
亲和素与生物素系统的基本原理
亲和素与生物素系统的基本原理 1979年，Guesdon及其同事首先将生物素—亲和素应用于免疫组化技术中，并成功地建立了标记亲和素—生物素技术(LAB)和桥亲和素—生物素技术(BAB)。1981年，Hsu在LAB法和BAB法的基础上，先后建立了生物素—亲和素间接法及ABC法。近年来，由于双重免疫组化标记技术的发展，除ABC-HRP试剂外，还制成了ABC-AKP和ABC-GOD试剂，进而发展了ABC-AKP等技术。同时人们又对ABC法进行改进，相继出现了快速ABC法、二步ABC法、PAP和ABC连用等技术。随着链霉亲和素(streptavidin)的应用又出现了LSAB、S-P、SABC等方法。 1．标记亲和素—生物素法(1abeledavidinbiotin，LAB) 将亲和素与标记酶(HRP)结合，一个亲和素可结合多个HRP；将生物素与抗体(一抗或二抗)结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原(或通过一抗)先与生物素化的抗体结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。 2．桥接亲和素—生物素法(bridgedavidinbiotin，BAB) 先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素为“桥”物素连接，也可达到多层放大效果。将生物素化抗体与酶标记生 3．亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplex，ABC) 此方法为前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶标生物素(或称生物素化酶)结合，形成亲和素—生物素—过氧化物酶复合物(ABC复合物)。抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物(此ABC复合物不能饱和，即亲和素上的4个结合位点最多允许3个位点与生物素化酶结合，留1～2个位点与生物素化二抗结合)结合，最终形成巨大复合体。因该复合体网络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。
地高辛标记探针的Southern 杂交技术
地高辛标记探针的Southern 杂交技术 根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。 核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。其基本过程包括以下几步。首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹（nucleic acid blotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dot and slot blotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colony and plaque blotting）；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术（Dot blot）、Southern杂交技术（Southern blot）、Northern杂交技术（Northern blot）。前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。本实验主要介绍Southern杂交技术。 1主要内容 1. Southern Blot方法的原理。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳。 3. DNA转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜及膜处理。 4. 介绍随机引物法标记DNA探针，Southern blot的预杂交、杂交及显色过程。2目的要求 掌握Southern blot方法的原理；掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移DNA 至硝酸纤维素膜及膜处理。 3 实验原理 Southern杂交技术是由Edward M. Southern在1975年首先发明的用于检测DNA 的一种核酸杂交技术，并因此而得名。Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而