细菌内毒素检查验证方案
细菌内毒素检查验证方案 文件编号：VP-QC-2015-06 起 草 人： 审 核 人： 批 准 人： 批准日期： 年 月 日 目录 1 概述
1 2 验证目的及范围
1 3 验证小组人员组成及职责
1 4 验证依据
2 5 验证前准备
2 6 验证的实施
2 7 偏差处理5 8 验证数据及评估
5 9验证报告及评审
5 10 再验证及周期
5 11 验证文件及归档
5 12 附件
5 1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 验证小组组成及职责列表 组成 职 责
QC 1. 负责起草验证方案的起草 2. 负责本方案的培训 3. 仪器仪表校验确认 4. 负责验证的实施 5. 负责数据的收集和整理 6. 负责数据分析 7. 负责完成验证报告
质量部 1. 负责验证方案、验证报告的审核与批准 2. 负责验证现场的监督审查
生产部 1. 负责保障设备、器具的完好 2. 负责动力系统的保障 4 验证依据 《中华人民共和国药典》2015版 1143 细菌内毒素检查法 5.验证前准备 验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。 相关文件，确认以下文件皆为现行有效版本。 序号 相关文件 文件编号 1 DHG型电热恒温鼓风干燥箱操作规程 WI-100
2 BSC-100-II-B2生物安全柜操作和维护保养规程 WI-101
3 WXQI-S-18SI自动手提式灭菌器使用和维护保养规程 WI-103
4 DK型电热恒温水浴锅操作规程 WI-104
5 HWS型恒温恒湿箱操作规程 WI-105
6 JA2003N电子天平操作及维护保养规程 WI-106
7 PHS-3C型PH计操作及维护保养规程 WI-108
8 SHP-3C型低温生化培养箱操作及维护保养规程 WI-109
9 YJ-875SDB型净化操作台的操作及维护保养规程 WI-113
10 《培养基管理规程》 WI-76
6 验证的实施 实验材料及用具 电子天平 电热干燥箱 恒温恒湿箱 水银温度计 旋涡混合器 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号） 细菌内毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品) 细菌内毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于ml，且对内毒素试验无干扰作用。 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 实验准备 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。 鲎试剂灵敏度复核试验 本试验采用凝胶法，凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测的方法。 细菌内毒素标准溶液的制备 取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、λ、λ（λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟。 待复核鲎试剂的准备 取规格为 支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。 加样 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4 支（管）4 列每列每支分别加入 的2λ、λ、λ、和λ 的内毒素标准溶液；另2支（管）加入检查用水，作为阴性对照。 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，垂直放入试管架上，连同试管架放入37℃±1℃恒温恒湿箱中，试管架保持水平状态，保温60±2 分钟。 观察并记录结果。将试管架从恒温恒湿箱中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。保温和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。 实验结果计算 如最大浓度2λ4管均为阳性，最低浓度λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。 λc = lg-1 (∑X/4) 式中x为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。 结果判断 .判断标准 当λc在λ～2λ（包括λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。 判断结果：（记录附后）
干扰实验 目的 是检验本公司自制的注射用水对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。 确定最大有效稀释倍数（MVD） 注射用水的内毒素限值L为ml，鲎试剂的标示灵敏度为 EU/ml，则最大有效稀释倍数MVD为注射用水本身浓度。公司如下： MVD=cL/λ 式中：L为供试品的细菌内毒素限值 c为供试品溶液浓度 λ为鲎试剂灵敏度的标示值。 制备内毒素标准对照溶液 取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、λ、λ（方法同）。 制备含内毒素的供试品溶液 再注射用水将中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、λ、λ的含内毒素的供试品溶液。 鲎试剂的准备 取规格为支的鲎试剂28支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。 加样：按下列表1方法进行加样 1) 将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入的λ、λ、λ、λ的含内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入供试品溶液作为阴性对照。 2) 将另外10支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，每列2支（管）。其中的4列每列每支分别加入的含λ、λ、λ、λ的内毒素的标准内毒素溶液，另一列2支（管）加入检查用水作为样品阴性对照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃恒温恒湿箱中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。 表1 凝胶法干扰试验溶液的准备 编号 内毒素浓度/被加入内毒素的溶液 稀释用液 稀释倍数 所含内毒素的浓度 平行管数 A 无/供试品溶液 —— —— —— 2
B 2/供试品溶液 供试液溶液
1 2 4 2 1 4 4 4 8 4
C 2/检查用水 检查用水 1 2 2 2 1 2 4 2 8 2 D 无/检查用水 —— —— —— 2 注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。 实验结果计算 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂里面的复核试液要求时，试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂里面的复核试验要求室，认为该供试品溶液物干扰作用。其他情况则认为供试品溶液存在干扰作用。按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et). Es= lg-1 (∑Xs/4) Et= lg-1 (∑Xt/4) Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。 结果判断 判断标准 当Es在λ～λ（包括λ和λ）时，且Et在 Es～（包括 Es和）时，则认为该供试品溶液不干扰实验，可对此供试品进行细菌内毒素检查。 当Et不在 Es～（包括 Es和）时，则认为该供试品溶液干扰实验。 判断结果：（记录附后）
。 供试品的凝胶限度试验检查 在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。 凝胶限度溶液的制备：按表2进行各试验溶液的制备 表1 凝胶限度试验溶液的制备 编号 内毒素浓度/被加入内毒素的溶液 平行管数 A 无/供试品溶液 2 B 2/供试品溶液 2 C 2/检查用水 2 D 无/检查用水 2
细菌内毒素检查操作程序
细菌内毒素检查操作程序1 概述：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/mL的灭菌注射用水。
2 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理检测的方法。
2.1 材料准备2.1.1 0.1ml/支规格及灵敏度的鲎试剂，细菌内毒素检查用水以及细菌内毒素国家标准品或工作标准品。
2.1.2 恒温器、旋涡混合器、试管架、计时器、剪刀、封口胶布、砂轮片、酒精棉球、酒精灯、灭菌的1ml玻璃注射器、烘箱。
2.2 实验操作2.2.1 接通恒温器电源，将温度调节至37℃±1℃。
2.2.2供试品稀释2.2.2.1 当供试品需要控制的内毒素限值大于鲎试剂灵敏度时，需要对供试品进行稀释，计算公式如下：MVD＝L/λMVD：供试品的最大有效稀释倍数L：供试品需控制的内毒素限值（EU/mL）λ：鲎试剂灵敏度值（EU/mL）2.2.2.2[举例]某供试品需要控制的内毒素限值为5EU/ml，使用灵敏度λ＝0.25EU/mL 的鲎试剂作细菌内毒素检查.MVD＝5EU/ml / 0.25EU/mL＝20倍。
即供试品需作1:20稀释后再作检查。
若检查结果为阳性，表明供试品内毒素含量≥5EU/ml，超过限值；若检查结果为阴性，表现供试品内毒素含量＜5EU/ml，低于限值。
2.3 检查操作2.3.1供试品溶液制备：取0.2g糖粉，加入2ml检查用水稀释，混匀，备用。
2.3.2 取0.1ml/支规格的鲎试剂8支，折断（或割断）安瓿颈，其中2支作为供试品管，2支作为阴性对照管，2支作为阳性对照管。
2支供试品阳性管。
2.3.3 阴性对照管加入0.2ml水，其余各管加入0.1ml水复溶；供试品管各加入0.1ml 供试品溶液，阳性对照管加入0.1ml2.0λ浓度的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml供试品阳性对照溶液[用被测供试品溶液将同一支细菌内毒素工作标准品制成2.0λ浓度的同毒素溶液。
细菌内毒素检查法ppt课件
1、鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 鲎试剂的质量：抗干扰才干，稳定性； 鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。
1〕、鲎试剂灵敏度的误差
能否用细菌内毒素国家规范品标定？
标示值能否准确？
不同厂家的鲎试剂虽然标示值〔λ〕一样，但 依然存在较大的误差。比如，标示值为0.5EU/ml 的鲎试剂，有的真实灵敏度能够是0.65EU/ml； 而另一个厂家的鲎试剂能够是0.30EU/ml时，按 0.5-2λ误差规范都是合格产品，但对同一检品 在一样的稀释倍数下，这两个厂家的鲎试剂产品 对内毒素的检出程度却不同。
复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击 1-3秒，促进鲎试剂的溶解。
➢由于凝集反响是不可逆的，所以在反响 过程中及察看结果时应留意不要使试管 遭到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性 结果。
➢进展干扰实验时，规范对照系列和含内 毒素的供试品溶液系列应同时进展，并 运用同一支细菌内毒素规范品。
➢在进展鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和 供试品细菌内毒素检查时，各个实验中 要求的对照应同时进展，并在实验有效 的情况才干进展计算和判别。
三、售后技术效力专业，技术优势明显 细菌内毒素检查法在我国已开展了十多年，
经过许许多多专家学者的努力，目前该行业 曾经获得了非常重要的成果，但是该领域依 然有许多我们无法处理问题的存在，它并不 想我们想象的那么简单，这些问题的存在严 重妨碍了该行业的进一步开展，我们将与客 户的交流以及客户咨询的相关问题，进展一 次归纳总结。经过任务中出现的问题有必要 对以下情况进展交流，以加强对细菌内毒素 检查法的正确了解，同时纠正一些错误的观 念。
3、实验器皿的影响 器皿的计量管理〔校正〕 器皿的选择规范 器皿的正确处置
1〕、器皿的选择规范
鲎实验对器皿的要求：刻度准确；内 外表光滑；易于清理。细菌内毒素检查实 验不宜选用注射器，最好运用经过校正的 刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不准确， 内壁磨沙面吸附内毒素，而且要特别留意 注射器针头引入的铁离子对实验结果的干 扰，故不宜选用注射器。
细菌内毒素检查操作规程
细菌内毒素检查操作规程1.目的：建立一个测定细菌内毒素的检查方法。
2.范围：适用于需测定细菌内毒素的药品等。
3.责任：质检科检验员对实施本规程负责。
4.程序4.1原理4.1.1本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4.1.2细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
4.1.3细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
4.1.4细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.1.5细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
4.1.6凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml 的灭菌注射用水。
光度测定法的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml 。
4.1.7试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
试验操作过程应防止微生物的污染。
4.2供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的pH值在6.0 ～8.0 的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
4.3内毒素限值的确定4.3.1药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L = K/M式中：L——供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K ——人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg· h）表示，注射剂K＝5EU（/ kg·h），放射性药品注射剂K＝2.5EU/（kg·h），鞘内用注射剂K ＝0.2EU/ （kg·h）。
细菌内毒素检查- PPT课件
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检 查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试 验。 当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验 环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时， 须进行干扰试验。
干扰实验
进行干扰试验一般步骤
供试品限值确定 根据鲎试剂的灵敏度确定MVD范围（供试品溶液浓度范围） 预试验（初筛试验）确定样品最大不干扰浓度 正式干扰试验
干扰实验
当Es 在0.5λ～2λ（包括0.λ和2λ）及Et 在0.5Es～2Es（包 括0.5Es和2Es）时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用， 可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。 当Et不在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）时，则认为供 试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜方法排除干扰，如 可将供试品进行更大倍数稀释（不超过MVD ）。
干扰实验
4、当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验有效。 当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对 照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此 稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数 进行正式干扰实验。 5、当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供 试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂 的反应存在干扰，则应对供试品进行更大稀释倍数（不得 超过MVD=CL/λ0.03 ），或通过其他适宜的方法（如过滤、 中和、透析或加热处理等）排除干扰。 6、当供试品的内毒素限值单位为EU/mg或EU/U活性单位 时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即 稀释倍数下溶液的浓度），以mg/ml或活性单位/ml表示。
实验原理
利用鲎试剂与微量内毒素产 生凝集反应的现象，以判断 供试品中细菌内毒素的限量 是否符合规定的一种方法。
6.细菌内毒素检查
细菌内毒素检查王文洁一、试剂及仪器注射用头孢他啶鲎试剂（λ—标示灵敏度），细菌内毒素标准品，细菌内毒素检查用水（BET水），仪器（严格消毒）质量标准：《中国药典》（2005年版）第二部p135细菌内毒素检查法：附录Ⅺ二、实训内容1.细菌内毒素标准溶液的制备15015 1.00.50.250.1250.21.8BET 0.22.8BET 0.90.9BET 0.90.9BET 0.90.9BET 2λλ0.5λ0.25λ2.供试品溶液的制备供试品的最大有效稀释倍数（MVD）MVD＝C×L／λC--为供试品的浓度（当L以EU/ml表示时，C取1.0ml/ml）L--为供试品的细菌内毒素限值，EU／mlλ--鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml ）3.对照PC－阳性对照－－2λ内毒素溶液PPC－供试品阳性对照－－含2λ内毒素溶液的供试品NC－阴性对照－－BET 水4.检查S PC PPC NC各两支将安瓿瓶中溶液轻轻混匀后，封口膜封口，垂直放入37±1℃水浴中，保温60±2分钟。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。
细菌内毒素检查－－鲎试剂法美国药典近800种药物要用细菌内毒素检查法来做为质量控制手段。
我国药典至2005年版正式收载了需“细菌内毒素检查法”品种达234种。
2005版《中国药典》二部收载的细菌内毒素检查法部分品种表药品名称限值页码甘露醇注射液 2.5 EU/g720.5 EU/ml91右旋糖酐70氯化钠注射液甲硝唑注射液0.35 EU/mg124注射用头孢他啶0.1 EU/mg 135注射用苄星青霉素0.25 EU/1000单位228谷氨酸钾注射液0.012 EU/mg269维生素C注射液 2.5 EU/ml6712005版《中国药典》三部收载的细菌内毒素检查法部分品种表药品名称限值页码乙型脑炎灭活疫苗100EU/微克34人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）100EU/每1次人用剂量95重组乙型肝炎疫苗（酵母）成品10EU/ ml115注射用重组人干扰素γ成品10EU/每1次人用剂量225注射用重组人白介素-2成品10EU/每1次人用剂量227鲎试剂法优点快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品。
细菌内毒素检查标准程序
细菌内毒素检查标准程序1.目的：建立细菌内毒素检查标准程序，指导规范操作。
2.范围：适用于各种供试品的细菌内毒素—凝胶法检查。
3.职责：检验人员对本规程的实施负责。
4.编制依据：2010年版《中华人民共和国药典》二部附录细菌内毒素检查法中的“凝胶法”。
5.原理：凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
6.程序：6.1试验材料与用具6.1.1仪器与用具：①可调式微量移液器（50～250μl、200～1000μl）；无热原枪头（250μl、1000μl）无热原空安瓿瓶或用经250℃干烤至少60分钟刻度吸管（1ml）、10mm³75mm 试管。
②恒温水浴锅、快速混匀器、砂轮、温度计、试管架、封口膜。
6.1.2细菌内毒素检查用水：凝胶法细菌内毒素检查用水是指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
6.1.3细菌内毒素标准品：细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品6.1.4鲎试剂6.2鲎试剂灵敏度复核：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。
注意：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
6.2.1取细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，用砂轮轻轻在要开启处划痕，用75%酒精擦净后开启。
6.2.2用可调式微量移液器或刻度吸管取定量的细菌内毒素检查用水沿细菌内毒素标准品瓶壁加入，用封口膜将瓶口封严，在旋涡混合器上混匀15分钟。
6.2.3根据鲎试剂的标示值（λ），用细菌内毒素检查用水对上述已溶解混匀的细菌内毒素工作标准品溶液进行倍比稀释，制成2.0λ，1.0λ，0.5λ,0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。
每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
6.2.4取标示量为0.1ml的鲎试剂18支或其他标示量的鲎试剂适量，轻轻敲打瓶壁，将附着在瓶颈上的内容物弹下，用砂轮在瓶颈处划痕，用75%酒精擦净后开启。
细菌内毒素检查操作规程
细菌内毒素检查操作规程1.目的：建立一个测定细菌内毒素的检查方法。
2.范围：适用于需测定细菌内毒素的药品等。
3.责任：质检科检验员对实施本规程负责。
4.程序4.1原理4.1.1本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4.1.2细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
4.1.3细菌内毒素的量用内毒素单位（EU表示。
4.1.4细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.1.5 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
4.1.6凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
光度测定法的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于 0.005EU/ml。
4.1.7 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
常用的方法是在250E干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
试验操作过程应防止微生物的污染。
4.2供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的pH值在6.0〜8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pHfi,可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH®。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
4.3内毒素限值的确定4.3.1药品、生物制品的细菌内毒素限值(L) 一般按以下公式确定：L = K/M式中：L――供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/m或EU/U (活性单位)表示；K ――人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/ (kg • h)表示，注射剂K= 5EU/(kg • h),放射性药品注射剂K= 2.5EU/ (kg • h),鞘内用注射剂K= 0.2EU/ (kg • h)0 M ------ 人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以 ml/ /kg • h)、mg/ /kg • h)或U/ /kg • h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
细菌内毒素检查SOP
细菌内毒素检查SOP1.适用范围本标准适用于细菌内毒素的检查。
2.职责QC负责人监督检验员按SOP检查检验员严格该SOP检查3.内容3.1.原理用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定，内毒素的量用内毒素的单位(EU)来表示。
3.2.实验材料及用具3.2.1.电热干燥箱温度应能达到250℃。
3.2.2. 恒温水浴箱（37±1℃）。
3.2.3.温度计，精度在1℃以下。
3.2.4. 旋涡混合器。
3.2.5. 鲎试剂应具有国家主管部门批准文号。
3.2.6. 细菌内毒素工作标准品，应使用中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。
3.2.7. 细菌内毒素检查用水（含内毒素小于0.015EU的灭菌注射用水）。
3.3.准备工作3.3.1.试验所用器皿，250℃干烘至少≥60分钟。
3.3.2.鲎试剂灵敏度复核，按《中国药典》2005版三部287页进行。
3.3.3.供试品干扰试验，按《中国药典》2005版三部287页进行。
3.4.操作方法3.4.1. 试验准备将试验所用器皿用洗涤剂和自来水洗净除去水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余洗液洗净，在用新鲜蒸馏水冲洗干燥后，用锡箔纸密闭玻璃器皿口，放置适宜的密闭金属容器中，置烤箱中在250℃干烤至少1小时，容器在不打开包装的情况下可在一周内使用，否则须再加热除去热源。
3.4.2.内毒素标准溶液的制备3.4.2.1. 取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用75%酒精棉球擦拭后开启，防止玻屑落入瓶内。
3.4.2.2. 按使用说明书用移液管加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。
置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准品溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。
3.4.3. 供试品溶液的制备3.4.3.1 供试品最大有效稀释倍数的计算：MVD=λLC⨯L为供试品的细菌内毒素限值；λ为使用鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）；C为供试品的浓度，当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml。
[整理]中国药品检验标准操作规程版细菌内毒素检查法.
细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于《中国药典》2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中或国家标准有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L＝K∕M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U等表示。
K为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(kg·h) 表示。
其中注射剂，K＝5EU／(kg·h)；放射性药品注射剂，K＝2.5EU／(kg·h)；鞘内用药品，K＝0.2EU／(kg·h)。
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml／(kg·h)、mg／(kg·h)、U／(kg·h) 等表示。
药品人用最大剂量可依据药品使用说明书或参阅《临床用药须知》，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1h的按1h计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量［即M：（最大给药剂量／(m２·h)×1.62m２）／60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：MVD＝C·L／λL为供试品的细菌内毒素限值，当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／u表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／ml或U／ml。
λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
供试品如为无菌粉末或原料药，供试品最小有效稀释浓度（MVC）按下式计算：MVC＝λ／L。
sop细菌内毒素检查操作规程
1 目的规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。
2 范围适用于本厂质监科化验室对注射用水的细菌内毒素检验。
3 责任化验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。
4 内容本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4.1仪器、用具4.1.1旋涡混合器、注射器（2.0ml、1.0ml）、注射针（6号、9号）、保鲜纸、试管（10×75 mm）、镊子（金属）、金属盒。
4.1.2用具除去外源性内毒素：将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。
4.2试剂4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.2.2细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价应不小于2EU，不大于50EU。
4.2.3细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
4.2.4鲎试剂：0.1ml/支（λ=0.5EU/ml）。
4.3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，1EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。
λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。