卵黄抗体的应用研究进展

卵黄抗体的应用研究进展 【摘 要】卵黄抗体又称“卵黄免疫球蛋白（IgY）”，具有强大的免疫功能，目前研究最多、应用最广的是鸡源IgY。卵黄抗体以其化学性质稳定、制备简单、使用方便、成本低廉等优点，近年来逐渐引起学者的注意，在生物技术、医药卫生、食品科学等方面应用越来越广泛。随着特异性IgY研究的日益深入，在各个领域显示出令人振奋的应用前景。 【关键词】卵黄抗体；诊断；治疗 卵黄免疫球蛋白（egg yolk immunoglobulin）简称IgY，是从免疫后的禽蛋卵黄中提取出的针对某种特定抗原的抗体，多数为IgG，具有强大的免疫功能，因此又称之为“卵黄抗体”。目前研究最多、应用最广的是鸡源性的卵黄免疫球蛋白。鸡源性特异性IgY的制备先根据需要选定抗原对产蛋母鸡进行免疫，之后在蛋黄内就会产生抵抗该特定抗原的特异性抗体。IgY抗体的获取无需采血，只需收集免疫蛋鸡产下的鸡蛋即可大量制备质量均一的特异性抗体[1]。自20世纪50年代，研究学者就发现鸡卵黄中存在大量抗体，含量与鸡血清中的相当甚至更高；之后随着诸如标准IgY商品试剂的生产、IgY特异性纯化试剂盒的面市，开创了卵黄抗体应用的新时代。1996年，IgY抗体的生产和应用技术被统称为“IgY技术”[2]，现在它已被列为一个国际化的标准应用技术。另外由于亲缘关系较远以及结构差异，禽类的IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间血清学鉴定不会发生交叉反应[3]，这进一步扩展了IgY的应用范围。近年来卵黄抗体以其化学性质稳定、制备简单、使用方便、成本低廉等优点，逐渐引起人们的注意，在医药卫生、食品科学、生物技术等方面的应用越来越广泛。 1 IgY在医学疾病诊断方面的应用 1.1 细菌性疾病的诊断 Kim等人用单核李斯特菌的鞭毛蛋白作为抗原免疫蛋鸡，制备抗鞭毛蛋白抗原的特异性IgY，并通过ELISA法以抗鞭毛蛋白的单抗为包被抗体、特异性IgY为检测抗体进行该菌的检测，结果显示此特异性IgY的敏感度高，特异性强，并且不与其它菌种发生交叉反应[4]。Vasconcellos等人采用三种不同的测试方法对多克隆抗体和特异性IgY进行包被以检测人体血液中的钩端螺旋体，得出最佳包被模式的检测限为l0个钩端螺旋体/ml[5]。大肠杆菌O157：H7常存在于日常食品中，由于低剂量就会导致出血型大肠炎感染，严重危及生命，因此需要快速、精确、高灵敏度的检测体系；Sunwoo[6]等人采用灭活的大肠杆菌O157：H7为免疫抗原免疫蛋鸡，分离制备了抗大肠杆菌O157：H7的特异性IgY，以O157：H7的单抗为检测抗体，用此特异性IgY为包被抗体，进行分析，结果显示此检测体系可检测到的大肠杆菌O157：H7的最低剂量是40CFU/mL，大大提高了检测的灵敏度。 1.2 病毒性疾病的诊断 Juliarena等人表达制备了牛白血病病毒包膜糖蛋白gp51上的重要蛋白抗原-p24的融合蛋白，并用此蛋白来免疫蛋鸡制备特异性抗体，用于免疫诊断牛白血病病毒的存在，结果显示此IgY抗体在检测过程中避免了常规哺乳动物IgG所带来的交叉反应现象[7]。Ivano等人制备了抗蜱传脑炎病毒（TBEV）的鸡IgY抗体，并建立了ELISA方法用于检测TBEV抗原的存在[8]。SARS病毒的主要结构蛋白是核衣壳（NP），感染SARS病毒的病人在感染一周后在其血浆和鼻咽 呼出物中大量出现核衣壳，Kammilaa等运用重组表达的NP分别免疫小鼠和蛋鸡，获得NP特异性IgG及IgY，之后分别用作包被抗原和检测抗原进行免疫检测分析，结果发现特异性IgY对NP的检出限是10pg/mL[9]，显示此免疫拭子试验有效、方便、灵敏度最高，可以用于未来SARS流行时疑似病例的快速诊断。狂犬病是由狂犬病病毒所致的人畜共患病，潜伏期为数天至数年，该病毒会导致患者极度神经兴奋继之局部或全身麻痹而死亡，因此尽早诊断尽早治疗是关键。Motoi等学者用重组的狂犬病病毒核蛋白（rN）和磷蛋白（rP）免疫蛋鸡获得抗狂犬病病毒的特异性IgY，并通过免疫组化实验、免疫荧光、及Western-blotting等方法研究其特异性，发现抗rP和rN的特异性IgY可以特异性地结合狂犬病毒的蛋白，这表明抗狂犬病重组蛋白的特异性IgY可作为检测狂犬病病毒感染的有效工具进行快速诊断[10]。 1.3 寄生虫病的诊断 多数寄生虫病的症状在临床上很难做出诊断，很大程度上依赖于实验室检测，这就需要特异性强、灵敏度高、快速简便的检测手段。邵兆霞等用间接免疫荧光检测的方法用抗隐孢子虫IgY检测隐孢子虫卵囊，结果发现，以3%的BSA稀释抗体能有效减少非特异性染色，IgY的最佳稀释工作浓度在1：4000-1：8000范围内，能检测到的卵囊阈值为每毫升样品180-360个，该方法具有隐孢子虫属特异性和良好的敏感性[11]。Lei等运用免疫磁珠酶联免疫法，用抗可溶性虫卵抗原（SEA）IgY检测感染日本血吸虫小鼠血液循环中的抗原（CA），结果显示该法对血吸虫抗原血症的检测灵敏度很高，并可用于小鼠血吸虫病化疗效果的评价指标[12]。 1.4 其他诊断 张明娟在研究抗哇巴因鸡IgY与兔抗体IgG在酶联免疫检测中的比较中发现，鸡抗体IgY比兔抗体IgG的检测准确性高、特异性强，在一定程度上提升了哇巴因的检测水平[13]。Xizo等利用作为乳腺癌诊断标志因子的HER2和端粒酶为抗原免疫蛋鸡，产生抗HER2和端粒酶的IgY代替哺乳动物多抗进行诊断，结果发现IgY比哺乳动物的IgG和IgM更加灵敏[14]，有望作为癌症检测和治疗新手段。 2 IgY在疾病治疗方面的应用 2.1 细菌性疾病的治疗 Lee等用灭活肠炎沙门氏菌免疫蛋鸡制备出特异性IgY，体外实验表明特异性IgY浓度为0.9mg/mL时，对照组细菌增殖到1.2PFU/mL而实验组细菌仅增殖到0.3PFU/mL，说明该特异性IgY能显著抑制该病原菌的生长[15]。郭洁等用金黄色葡萄球菌灭活疫苗免疫蛋鸡获得抗金葡菌的特异性卵黄抗体，并通过体外抑菌实验研究该抗体的抑菌活性，结果表明，抗体抑菌活性随浓度的增加而增强，当特异性IgY的浓度为10mg/mL时就能完全抑制该病原菌的生长[16]。2.2 病毒性疾病的治疗 对虾白斑综合症病毒（WSSV）是危害对虾养殖业最严重的病毒，卢亚楠利用灭活的WSSV免疫蛋鸡获得特异性IgY并溶于饲养水体，研究抗WSSV特异性卵黄抗体对WSSV的治疗效果，结果显示，灭活疫苗的特异性IgY浸泡处理后累计死亡率降低至33.3%与对照组呈显著差异[17]。王昕等以强毒新城疫（VND）及禽流感（AI H5、H9型）高效价抗原对健康蛋鸡进行多次免疫，得到抗新城疫及禽流感（H5、H9）的多价二联高免特异性IgY；用该高免IgY对1月龄雔鸡进行预防免疫实验以及攻毒治疗实验，实验结果显示，预防VND和 AI的免疫保护率分别为87-100%和100%；治疗保护率达分别达到73%和80%以上[18]。 2.3 真菌性疾病的治疗 白色念珠菌主要攻击一些免疫功能低下的患者，如大面积烧伤患者或癌症患者等，临床常常用抗真菌药物进行治疗但是副作用明显，不适合长期使用。傅颖媛等在烧伤病人继发感染白色念珠菌的创面分离出白色念珠菌，并用该菌免疫蛋鸡获得特异性IgY，用于治疗感染白色念珠菌的烧伤大鼠，结果显示特异性IgY能显著抑制烧伤大鼠痂下组织继发感染白色念珠菌，与对照组比呈显著性差异[19]。El-Sayed等制备抗白色念珠球菌的特异性IgY用于治疗低免小鼠口腔白色念珠球菌感染，实验表明口服特异性IgY能显著减少小鼠口腔内的白色念珠球菌[20]。另外IgY用于阴道念珠球菌的治疗也取得了良好的效果[21]。 2.4 寄生虫病的治疗 郑明学研究发现，口服抗球虫IgY可使感染E.tenella鸡的死亡率降低33.34%，增重率提高39.19%，抗球虫指数提高73.50%，机理研究表明IgY对E.tenella孢子具有显著的溶解和致弱作用[22]。邵兆霞等研究了抗隐孢子虫特异性IgY治疗感染动物的效果，实验结果表明特异性IgY能显著改善和缓解病症，切片观察发现，实验组的虫荷数明显下降并且鸡群OPG值显著减少[11]。 3 IgY在其他方面的应用 IgY可作为保健品和功能性食品，美国食品药品监管局（US Food and Drug Administration，FDA）认为IgY作为功能性食品比作为药物更有利，已将IgY认定为“一般公认安全物质（Generally Accepted as Safe，GRAS）”，并将其确定为抗生素替代品的首选。IgY可以添加到中老年人、婴幼儿、及体弱多病者的食品中，用以提高人体的抵抗力。目前市售百贝宁（纯天然口服抗轮状病毒免疫球蛋白）为葫芦岛爱克生物工程有限公司与江西中德联合研究院共同生产的，自2001年上市以来，经临床试验发现在治疗轮状病毒性肠炎方面百贝宁具有疗效显著、服用方便等特点，并且在治疗过程中未发现毒副作用[23]。此外利用纯化的IgY作为亲和配基可以分离纯化抗原[24]。 目前IgY技术在医药、食品、生物等方面的应用已初见规模，许多研究成果已商品化，但在抗真菌领域的研究相对比较薄弱，随着IgY技术的推广应用，近年来在抗真菌方面不少研究正在开展中，并且有些取得了可喜的成果，相信在不长的时间内有望得到迅速发展。 【参考文献】 [1]Sehade R， Staak C， Hendriksen C， etal. The produetion of a vian（egg yolk） antibodies： IgY[J]. Alternatives to laboratory animals： ATLA， 1996， 24（6）： 925-934. [2]Sehade R， HlinakA. Egg yolk antibodies， state of the art and future prospects[J]. Alter- nativen zu Tierexperimenten， 1996， 13（Suppl）： 5-9. [3]那红，杨曜中，欧伶，等.鸡卵黄免疫球蛋白IgY的性质[J].华东理工大学学报，1998，24（2）：172-175. [4]Kim S H， Park M K， Kim J Y， et a1. Development of a sandwich ELISA for the detection of Listeris spp. using specific flagella antibodies[J]. Veterinary Science， 2005， 6（1）： 41-46. [5]Vasconcellos FA， Coutinho ML， da Silva EF， et a1. Testing different antigen capture ELISA formats for detection of Leptospira spp. in human blood