细胞系的建立及鉴定
3. 体外无限生存的能力: 细胞系连续传代60或80代次。
肿瘤细胞的生物学特征
干系细胞：每个肿瘤内都含有一个或几个具有相对 稳定特性的自我保持的（Selfmaintaining）细胞 系。肿瘤的生长就是这些细胞系的增殖；
非干系细胞：除了干系瘤细胞，肿瘤还具有失去自 我保持能力的细胞的后代，可称为“肿瘤的非干系 细胞”。
细胞系的建立及鉴定
2012.2.28
细胞系：
有限细胞系，人的正常组织多数可以建立有 限细胞系。如间充质来源的成纤维细胞，牙 髓细胞、牙髓干细胞、牙周膜细胞等
无限细胞系，永生化细胞系，肿瘤细胞系
细胞系/细胞的鉴定
细胞系的建立：
1.组织块方法
2.单层细胞法
原代培养
传代培养
大量扩增细胞后用于实验研究
动物肿瘤移植实验证实，肿瘤结节在新宿主身上多 次传代之后仍具有原来肿瘤的主要特征，包括形态、 生化、抗原及细胞遗传的标志。所有恶性肿瘤的转 移瘤结节的细胞都具有与亲代原发病损类似的形态 学及生物学性质。
培养中的肿瘤细胞特性
1．致瘤性： 培养的肿瘤细胞移植到敏感动物后，可获得 形成肿瘤的能力。证明细胞在体外能经过类 似于体内肿瘤发生过程中出现的变化。
120 100 80 60 40 20
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
培养天数
肿瘤细胞系的特征：
特殊标记、癌基因、抑癌基因的表达、病毒 感染等；
以上各项指标中异种体内移植致瘤性最 为主要,如果一个细胞系接种到免疫缺陷动 物体内的适当部位后不能生瘤,则不能证明 其具有肿瘤细胞的特征。
恶性转化细胞对密度依赖性抑制的敏感性在肿瘤演 化的过程中自动丢失。
3．获得永生性
正常细胞原代培养物经过数次传代就逐渐停止 增殖。在肿瘤性演化过程中，细胞可能获得生长无 限代数的能力。永生性是肿瘤演化的一个特征。
成纤维及上皮细胞的原代培养经过初期的适应 培养条件之后，便进入较稳定的生长时期，生长速 度逐渐下降，进入退化期即衰老期。细胞系的寿命 差别很大，取决于培养细胞来自的动物种属。
影响移植瘤生成的因素
（1）植入细胞与宿主的免疫不相容：如接种 的培养细胞来自纯种动物，接种时产生的抗 原变化可能会产生致癌的阴性结果。可以将 细胞接种到 “不受免疫影响”的部位（如 眼前房） 用射线或免疫抑制剂抑制宿主的免疫反应； 将细胞接种到免疫反应有先天性遗传缺陷的 动物：（如无胸腺裸小鼠）。
肿瘤细胞系的一般生物学性状:
培养细胞的形态和/或超微结构 细胞生长及增殖能力的检测:
细胞生长曲线； 细胞分裂指数； 细胞倍增时间； 细胞周期,DNA合成； 遗传性状检测： 染色体分析:倍体性、染色体众数、核型分析； 同工酶； 集落形成能力；
细胞数 104/ml
图 -1 细胞生长曲线
目前，多用裸小鼠评价培养细胞的致瘤性。
（2）植入部位 ，例如，将瘤细胞接种到小鼠 躯干接近头部位置的皮下，生瘤的阳性率及 生长的速度比植到尾部高2－4倍。
（3）植入部位微环境的潜在因素，某些细胞 只有在植入部位找到最佳的微环境时才形成 肿瘤。
生瘤性与细胞其它性质的关系
细胞在基质上铺展的面积与生瘤性有关。 微丝束的结构破坏。许多生瘤细胞系均有大
永生化细胞系的鉴定：
除一般生物学性状外
1. 不死性，代次， 2. 细胞特性的改变： 3. 转染基因的鉴定：PCR, Southern blot ,
证实HPV-16/18 DNA 4. 成瘤性实验：免疫缺陷动物皮下细胞移
细胞悬液的制备
要求：5个浓度的细胞悬液分别是： 10000个；8000个；6000个；4000 个；2000个/100ul/孔 每个浓度3个复孔
量的微丝束变化，它与形态转化有关。 停泊依赖性与生瘤性联系最密切。
在动物体内不形成肿瘤的细胞系，在半固体 培养基内形成集落的能力也低；与之相反， 而大多数能在动物体内生瘤的细胞系，形成 集落的效率也高。
2．生长参数和细胞行为的变化
丧失停泊依赖性（anchorage dependency）
一般情况下，原代成纤维及上皮细胞悬浮 培养时不能增殖，它们只有铺展在固体基质 上才能增殖。在肿瘤性演化过程中，相当一 部分的细胞群体获得在悬浮状态形成集落的 能力，并不需贴附在基质上。
动物接种形成的肿瘤Байду номын сангаас进行组织学、染色体 及其它生物学标志的检查并与原接种细胞进 行比较。
致瘤性的判断
移植瘤是判断细胞性质的关键步骤。 首先，移植瘤的组织形态应与原肿瘤组织一
致。但有例外，细胞群体的性质可以与植入 前不同，因为在植入的细胞中，只有特殊变 异的细胞具有致瘤性，这些变种可能原来就 存在于植入群体内，也可能是植入后产生的。 在这种情况下可以确认接种的致瘤性。
破骨细胞含有丰富的酸性磷酸酶和抗酒石酸 磷酸酶（tartrat resisitant acid phosphatase,TRAP），TRAP染色阳性是 破骨细胞的重要标识。另外破骨细胞表面有 降钙素（calcitonin）受体，也可以作为标 志物。
形态学：多核细胞
牙髓干细胞：需多少个指标证实
牙周膜干细胞：
干细胞表面标记物: 多潜能功能－－组织细胞分化及功能鉴定
分化为脂肪细胞： 油红O 染色阳性
肿瘤细胞系的生物学鉴定
肿瘤细胞系建立后,要对其生物学性状进行 鉴定,以便日后的研究有可比较的科学依据
肿瘤细胞系的基本特性
1.细胞系的来源符合原供体组织的病理学诊断 原供组织的组织病理形态； 动物接种肿瘤组织的组织形态；
丧失生长抑制性
当培养细胞所需任何一种关键性营养物质或生长因子 降到阈值以下时,正常细胞的生长即受到抑制,如异 亮氨酸,磷酸盐,上皮生长因子等。
转化的细胞对一些生长因子需求降低,或失去了对激素 和生长因子的需求，在营养不足的情况下可继续生 长,它们甚至可以杀死一些自身的细胞,以便在不可 能生存的环境下继续生长。或者由于某些转化产生 了生长因子类似物,为自身提供了生长因子。
使用前对细胞的组织特异性进行鉴定
成骨细胞：没有唯一的特异性标志物 需数个指标联合证实
表面标志： 表达ALP。 Gomarri 法
合成Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨钙素、骨粘 蛋白、骨桥蛋白等骨基质蛋白。
组织功能： 体外形成矿化结节。 von Kossa染色法
体内成骨。免疫缺陷鼠皮下移植。
破骨细胞：唯一特异性标志物
密度依赖性抑制
正常贴壁性细胞的增殖率,随着每单位基质面积 内的细胞群体的局部密度增加而下降。这一现象称 为密度依赖性抑制(density dependent inhibition) 。或生长接触抑制(contact inhibition of growth),但二者并不等同。当一个对密度依
赖性抑制敏感的培养细胞达到某种密度，即所谓饱和密度时便停 止生长。此时细胞停止增殖，但并不死亡。这种抑制可以由于液 体培养基中的营养物质耗尽,生长抑制物质的累积所引起。
4.计算500ul培养基内需加入多少
ml1X105个/ml的细胞悬液
① 500ul原液 ② 4X104 / 10X104 =0.4ml原液+0.1ml培养液 ③ 3X104 / 10X104 =0.3ml原液+0.2ml培养液 ④ 2X104 / 10X104 =0.2ml原液+0.3ml培养液 ⑤ 1X104 / 10X104 =0.1ml原液+0.4ml培养液
干细胞表面标志：CD44,STROL 1,MUC18 ,alpha-SM actin
多潜能功能鉴定： 成骨细胞功能： 细胞碱性磷酸酶（ALP）活性检测：采用 Gomarri 法测定细胞内碱性磷酸酶的活性。
细胞体外矿化能力的检测：细胞经矿化诱导
剂处理后，用von Kossa染色法观察细胞在体外 形成矿化物沉积的能力。
1.细胞悬液的计数 得到1X105个/ml
2.确定各实验浓度所需的细胞悬液总量 要求：100ul/孔X（3孔+2孔）＝500ul
3.计算各浓度细胞悬液所需的细胞数
① 104/孔/100ulX5孔＝5X104/500ul ② 0.84/孔/100ulX5 ＝4X104/500ul ③ 0.64/孔/100ulX5 ＝3X104/500ul ④ 0.44/孔/100ulX5 ＝2X104/500ul ⑤ 0.24/孔/100ulX5 ＝1X104/500ul
奶牛乳腺上皮细胞系的建立
文献标识码：Ａ
文章编号：０３６６—６９６４（２００９）０５－０７４３—０５
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｃｏｗ Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ
ＣＨＥＮ Ｊｉａｎ－ｈｕｉ，ＴＯＮＧ Ｈｕｉ—ｌｉ，ＬＩ Ｑｉｎｇ－ｚｈａｎｇ，ＧＡＯ Ｘｕｅ－ｉｕｎ’ （Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
应用免疫荧光细胞染色法检测纯化后乳腺上皮 细胞角蛋白１８的表达情况，激光共聚焦显微镜下观 察，一抗染细胞角蛋白，ＰＩ染核，细胞中的角蛋白１８ 染成绿色，细胞核染为红色，方法参考文献［９］。 １．７奶牛乳腺上皮细胞生物性状的检测
根据每天对细胞生长情况的观察，记录奶牛乳 腺上皮细胞的生长特性和细胞形态的差异，对乳腺 上皮细胞做生物学性状的检测。细胞形态学观察、
根据成纤维细胞和乳腺｝皮细胞对胰蛋白酶的 敏感性不同，可得到纯化的奶牛乳腺上皮细胞（图 ｌ－Ｃ）和纯化的成纤维细胞（图卜Ｄ）。 ２．３奶牛乳腺上皮细胞的鉴定
应用激光共聚焦显微镜观察，结果显示分离培 养的乳腺上皮细胞角蛋白１８的表达呈阳性（图２， 图３）。 ２．４奶牛乳腺上皮细胞生物性状的检测 ２．４．１ 细胞形态学观察 在细胞进行传代过程中， 出现了不规则的多边形奶牛乳腺上皮细胞（图１一 Ｅ）、长形乳腺上皮细胞（图１一Ｆ）、蜂窝状的乳腺上皮 细胞（图ｌ－Ｇ）、圆顶型的乳腺上皮细胞（图１一Ｈ）、含 有丰富乳滴的乳腺上皮细胞（图１－Ｉ，１一Ｊ）和细胞出 现含有２～６个核仁的乳腺上皮细胞（图１－Ｋ）、拉网 结构的乳腺上皮细胞（图卜Ｌ）、岛屿状的乳腺上皮 细胞（图１一Ｍ），当细胞生长非常紧密时，出现细胞抑 制现象（图１－Ｎ），当细胞传到２０代时，细胞为长梭 形（图ｌ一０）。 ２．４．２细胞生长曲线 以培养时间为横坐标，３孔 细胞数的平均值为纵坐标绘制奶牛乳腺上皮细胞生 长曲线（图４）。细胞生长曲线显示：奶牛乳腺上皮 细胞生长延迟期为Ｏ～５ ｄ，对数生长期为５～９ ｄ，９ ｄ后进入平台期。结果表明，培养的奶牛乳腺上皮 细胞具有正常的分裂增殖特性，符合细胞生长的生 物学规律。 ２．４．３细胞接种存活率用对数生长期的细胞，通 过消化法制成细胞悬液，ＣＡＳＹ细胞活力分析仪计 数后，按每平皿５．７×１０５个细胞接种，每组３平皿。 每２ ｈ消化计数１组已贴壁细胞，共观察２４ ｈ，分１２ 次进行。结果表明，细胞贴壁率及存活率在２４ ｈ内 逐渐升高，并达到最高值９２％以上，说明细胞的生 存及贴壁能力较强（表１）。
细胞系的建立及鉴定共28页文档
16、云无心以出岫，鸟倦飞而知还。 17、童孺纵行歌，斑白欢游诣。 18、福不虚至，祸不易来。 19、久在樊笼里，复得返自然。 20、羁鸟恋旧林，池思故渊。细胞系的建立及鉴定
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
细胞工程原理-第一章 动物细胞的培养
（二）合成培养基
主要是指通过人工设计、配制而成的，使用时需 添加一定量血清的一类培养基，可在体外较好用 于动物细胞培养。目前已经设计出适合不同类型 细胞的培养基，如DMEM、TC199等。 优点：创制出与体内相似的生存环境，又便于控 制，实现标准化。
主要成分：氨基酸、糖、无机盐、维生素及其他 辅助物质。
定 1.鉴定指标 ① 纯度： 何种细胞为主 ② 细胞学特征： 细胞形态、结构、染色体组型、生长曲线、分 裂指数、倍增时间等
③ 稳定性：传代过程中，细胞学特征是否发生变化 ④ 污染情况： 是否有微生物和其他细胞系污染
2.鉴定方法
① 细胞形态学观察： 光镜和电镜观察形态特征 ② 绘制生长曲线，计算分裂指数 ③ 进行染色体组型和带型分析 ④ 检测同工酶酶谱
人心肌成纤维细胞 成纤维细胞
人乳腺
（3）游走细胞型
特点：细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游 走或变形运动，一般不连接成片。 举例：人单核细胞、巨噬细胞以及某些肿 瘤细胞。
人单核细胞
（4）多行型细胞
特点：呈多角形，是一些形态上不规则的细胞 ，不规则形态是由宽扁的胞质突起所致，细胞 一举般 例分 ：胞 神体 经和 元胞细突胞两、部神分经。胶质细胞。
（一）细胞的冷冻保存
细胞超低温保存的基本原理：细胞在-70℃以下时 ，细胞内的酶活性降低，代谢处于完全停止状态 ，故可长期保存。
细胞低温保存的关键：通过-20-0℃阶段的处理过 程。因为在此温度范围内，易造成细胞的严重损 伤，因此，常常在培养液中加入保护剂来减少对 细胞的伤害。
细胞冷冻过程：将对数期细胞用冻存液（DMSO+血 清或者+培养基+血清）、甘油+血清等）重悬，分
（二）建立细胞系、株
基因突变细胞系的构建
基因突变细胞系的构建英文回答：Building a cell line with gene mutations requires several steps and techniques. First, we need to identifythe specific genes that we want to mutate. This can be done through various methods, such as genetic screening or studying the genetic profile of cancer cells. Once we have identified the target genes, we can proceed to introducethe desired mutations.One common method for introducing gene mutations is through the use of CRISPR-Cas9 technology. Thisrevolutionary tool allows us to precisely edit the DNA sequence and introduce specific mutations. By designing guide RNA molecules that are complementary to the target genes, we can guide the Cas9 enzyme to the desiredlocations and induce double-strand breaks in the DNA. The cell's natural repair mechanisms then kick in, and duringthe repair process, the desired mutations can be introduced.Another approach is to use chemical mutagens or radiation to induce random mutations in the cells. This method is less precise but can be useful when studying the effects of multiple mutations or when specific genes are difficult to target using CRISPR-Cas9.Once the mutations have been introduced, the next step is to select and isolate the cells that carry the desired mutations. This can be achieved through various methods, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by using selective media that only allows the growth of cells with specific mutations.After isolating the mutant cells, it is important to verify the presence of the desired mutations. This can be done through DNA sequencing or by using specific assaysthat detect the mutated genes or their protein products. It is also crucial to confirm that the mutant cells exhibit the expected phenotypic changes, such as altered growth characteristics or increased resistance to certain drugs.Once the mutant cell line has been established and validated, it can be used for further studies, such as investigating the effects of the mutations on cellular processes or testing the efficacy of potential therapeutic interventions.中文回答：构建基因突变细胞系需要几个步骤和技术。
细胞系质量检测方法
细胞系质量检测方法常见的细胞系质量检测方法包括鉴定、微生物污染检测和细胞功能检测。
首先，细胞鉴定是确定细胞系特定属性的方法，例如细胞类型、起源和物种。
常用的鉴定方法包括形态学观察、细胞异质性检测、免疫细胞化学和分子生物学技术。
形态学观察可以通过显微镜观察细胞形态、大小和有无分化等特征，但此方法存在主观性，且一些细胞具有相似的形态特征。
细胞异质性检测通过染色体分析来确定细胞的遗传背景，但此方法通常需要复杂的样本准备和数据分析。
免疫细胞化学是利用特定抗体与目标细胞表面分子结合来鉴定细胞类型，然而，不同抗体对同一细胞的结合具有差异性。
分子生物学技术包括多态性分析、特定基因扩增和DNA测序等方法，可以确定细胞的基因型和物种起源，但此方法对实验条件和技术要求较高。
其次，微生物污染检测是确定细胞系是否受到细菌、真菌或病毒等微生物污染的方法。
细胞培养需要在无菌条件下进行，以确保细胞系的纯度和稳定性。
常用的微生物污染检测方法包括培养基上的菌落形成、荧光染色、PCR和细胞培养活力检测。
菌落形成可以依靠培养基上的微生物进行观察，但此方法需要较长时间，且不适用于一些微生物的检测。
荧光染色方法利用荧光标记的抗体或化学物质来检测微生物污染，具有高灵敏度和特异性，但需要特殊仪器和试剂。
PCR技术通过扩增微生物DNA的特定序列来进行污染检测，具有高灵敏度和快速反应时间，但此方法对实验条件和技术要求较高。
细胞培养活力检测是通过观察细胞的形态和增殖能力来判断细胞系是否受到微生物污染的影响，但此方法对培养条件和经验要求较高。
最后，细胞功能检测是评估细胞系在特定功能上的表现的方法。
常用的细胞功能检测方法包括细胞增殖分析、细胞凋亡检测、细胞迁移和侵袭性分析以及细胞分化能力评估。
细胞增殖分析可以通过细胞计数、半胱氨酸酶活性测定和代谢活性测定等方法来评估细胞的增殖能力，但此方法受细胞生长状态和培养条件的影响。
细胞凋亡检测通过观察DNA断裂和细胞膜破裂等指标来评估细胞凋亡程度，但此方法需要特殊试剂和检测仪器。
小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立
Ｌ ｏｇ，Ｇ ０ Ｘ ｎ ，Ｃ Ｅ ｉａｇ．１Ｑａｆｓｍ ｏｐｔ ｈｎ ｏｇＰｏｉ ｅ Ｊ ｎ ２ ０１ ，Ｃ ｂ ２ Ｃｎｅ ｆｒ Ｕ Ｈ ｎ ￣ Ａ ｕ Ｈ Ｎ Ｚ ｉ ２ ｉ ｏｈ Ｈ ｓｉｌｏ ａ ｄｎ ｒｖ ｃ ， ｉ 吼 ５ ０ ４ ｈ７ ｅｔ ｏ ｊｎ ｎ ａ ｆＳ ｎ ｒ
用 畸 胎 瘤试 验 检 测 其 多 向分 化 能 力 。 果 结
该 细 胞 株 为孤 雌 来 源 ， 现 为 正 常二 倍 体 核 型 ， 达 Ａ Ｋ， 面标 载 体 Ａ ３ ８ ２ １ ７和
４ ＳＥ — 、 Ｓ Ａ ｌ阳性 ，Ｓ Ａ ４阴性 。体 内注 射 后 ， 局 部 形 成 含 三个 胚 层 组 织 的 畸 胎瘤 。结论 ＳＥ － 在
Ｒ ｐｏｕ ｔｅＭｅｗｉ ， ｈ ｎｏ ｇＰｏｉｃ ｌ ｏ ｉｌ ｆ ｌｔｄｔ Ｓ ａｄ ｎ ｎｖ￣ｉ； ｎｎ２０ ２ ， ｈｎ． ｏｒ ｐ ｎ ｉｇ ｅｒｄｃｉ ｄ ｎ Ｓ ａｄ ｎ ｖｎｉ ｓ ｔ ｉ ｉ ｅ ｈｎ ｏｇＵ ｉｅ ｔ ａ ５ ０ １ Ｃ ｉａ Ｃ ｒ ｓｏｄｎ ｖ ｅ ｒ ａ Ｈ ｐ ａＡ ａ Ｏ ？ ｅ
ｏ ｃ ｔ ｓｗｅｅ ｔｅ ｔ ｄ ｗｉ ３ ｎ － ｏ ｙ ｅ ｒ ａ ｅ ｔ Ａ２ ７ ａ ｄ ６ ＤＭＡＰ ａ ｄ ｔ ｅ ｕ ｔｒ ｄ ｔ ｂａ ｔｌ ｍｂ ｙ ｓｆｒ ｄ Ｔ ｅ ｈ ｎ ｅ ｅｌｍａ ｓ ｒ ｈ １ ８ ． ｎ ｈ ｎ ｃ ｌ ｅ ｍ ｌｓｕ ａ ｅ ｒｏ ｍｅ ． ｈ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ ｒｃ ｌ ｕ ｏ ｓ
６ Ｄ Ｐ化 学激 活 小 鼠卵母 细胞 ， 以得 到 具 有胚 胎 干 细 胞 特性 的细 胞 株 。 － ＭＡ 可
【 键 词 】 孤 雌激 活 胚 胎 干 细胞 钙 离 子 载 体 Ａ ３ ８ ６ 二 甲基 氨 基 嘌 呤 关 ２ １７ － 【 中图 分 类 号 】 Ｑ １．＋ 【 献标 识 码 】 Ａ 【 章 编 号 】 １７ — ３４ ２ １ ）３ ０ ３ — ４ ８ ３１ ｌ 文 文 ６ ３ ０ ６ （０ ００ — １２ ０
抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定
ｍ Ａｂ ｇ ｉ ｓ ｂ ｉ ａ ｖｙｉ ａ ａｎ ｔＶｉ ｒｏ ｈ ｒ ｅ
Ｈ Ｏ Ｇ ｉｉ， Ｈ Ｎ ｉ—ｕ Ａ ｈｎ ， Ａ Ｘａ —／ Ａ ｕ－ｅ Ｓ Ｅ Ｊｎｙ ，Ｃ Ｏ Ｚ ｅｇ Ｐ Ｎ ｉｏｙ ｊ
Ｉｓ ｔｔ ｏ Ｆ ｅｈ ａ ｒ Ｆｓ ｅ ｅ ｆ Ｚ ｅｉ ｇ Ｈ ｚ ｏ １ ０ １ ｎｔ ｕ ｆ ｒｓｗ ｔ ｉ ｒ ｓ ｏ ｈｊ ｎ ， ｕｈ ｕ ３ ３ ０ ， ｉ ｅ ｅ ｈｉ ａ
ｈ ｒ ｅ ｉＧＹＣ１ ０ — ．ｗｈ ｃ ｓ ｉｏａ ｅ ｒ ｍ ｈ ａ ｖ ｙ ８１ １ ｉｈ ｗａ ｓ ｌｔ ｄ ｆ０ ｔ ｅ
其 中某些 种类 会使 水产 动 物致病 ，给渔 业 生产造
ｄｓ ａ ｅ ｒａ ｅｌｗ ｃｏ ｋ ｒｉ Ｚ ｅｉｎ ｈｎ ｎ ２０ ． ｉ ｓ ｄ ｇｅ ｔｙ ｌ ｒａ ｅ ｎ ｈ ｊ ｇ Ｃ ｉ ｉ ０ ３ ｅ ｏ ａ ａ
成 损 失 ，其致 病 性 受 宿 主 的 生存 状 态 及 水 质 环 境 条
件 等综 合 因 素 的 影 响 较 大 ，属 条 件 致 病 菌 。其 中哈
维 氏弧菌 （ ｉｒ ｎ Ｖｂｉ ｏ
） 引起水 产 动物 发病 的一 种 是
重要病 原 ，能 引 起 鱼 、虾 等 多 类 海 水 养 殖 动 物 发
维普资讯
８ ３８
Ｃｈ ｎ ｅｌ ｏ Ｉ ｍ ｎ１２ ０ ２ （ ＩＳ １０ ８ ３ Ｓ Ｎ ０ ７— ７ ８细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 （ ｉ ＪＣ ｌ Ｍ ｌ ｍ ｕ ｏ） ０７， ３ ９
— —
・
论著 ・
文章 编 号 ：１０ ８ ３ （ ０ ７ ０ ０ ３ ０ ０ ７— ７ ８ ２ ０ ） ９－ ８ ８— ３
８ ｗｅ ｋ－ ｌ ｅ － ｅ － ｄ ｆ ｍａ ｅ ＢＡＬ ／ ｃ ｒ ｏ ｌ Ｂ ｃ ｍｉｅ ｗｅ ｅ ｉ ｍｍ ｕ ｉ ｅ ｔ ａ ｈ－ ｎｚ ｄ ｗｉ ｐ ｔ － ｈ
CRISPR实验流程详解
CRISPR/Cas9 实验流程交流企鹅: 2621697472（大家做哪块？）一、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程1.1 确定待敲除基因的靶位点1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）1.3 构建表达sgRNA的质粒1.4 sgRNA活性检测1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。
找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。
按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。
对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。
如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。
一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。
而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。
因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。
不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。
因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
细胞培养技术的发展历程
细胞培养技术的发展历程细胞培养技术是指将单个细胞或组织细胞在合适的培养基中进行体外培养，以便研究细胞的生物学特性和进行相关实验。
随着科学技术的进步，细胞培养技术得到了长足的发展，为生物医学研究、药物筛选和组织工程等领域提供了强有力的支持。
本文将从细胞培养技术的起源开始，梳理其发展历程，并介绍一些重要的应用。
一、起源细胞培养技术的起源可以追溯到19世纪末，当时德国生物学家埃尔恩斯特·埃尔门德尔首次成功地将组织细胞培养于离体环境中。
他利用鸟胚的细胞培养实验，为后来细胞培养技术的发展奠定了基础。
二、早期发展20世纪初，细胞培养技术得到了进一步的发展。
1912年，美国生物学家亨利·麦克莱兰（Ross Granville Harrison）成功地将脊椎动物的神经细胞培养了数天，并观察到了神经细胞的生长和分化。
这一突破为后来的组织细胞培养提供了有力的依据。
随着培养基的改良和培养条件的优化，细胞培养技术在20世纪中叶取得了长足的进展。
1948年，美国细胞生物学家乔治·盖雅在培养基中添加鸡胚液，成功地培养出了人类胚胎肾细胞。
这一突破标志着细胞培养技术进入了一个新的阶段。
三、细胞系的建立20世纪50年代，细胞系的建立成为细胞培养技术的重要发展方向。
细胞系是指从原代细胞中分离出来的、能够在体外长期生长和繁殖的细胞群。
1951年，美国生物学家乔治·盖雅与吉斯特·萨尔特成功地建立了人类胚胎肾细胞系，被称为“Hela细胞”。
这一细胞系的建立对于研究细胞生物学和药物筛选具有重要意义。
四、培养技术的改进随着细胞培养技术的发展，人们对培养条件进行了不断的改进。
1960年代，美国细胞生物学家菲利普·拉斯克和约翰·哈米尔顿开发出了一种新的培养基，被称为“DMEM”，为细胞培养提供了更适宜的生长环境。
此后，培养技术的改进主要集中在培养基的配方和培养条件的优化上。
人们通过添加多种生长因子、维生素和抗生素等物质，使细胞在培养基中能够更好地生长和分化。
用G418建立稳定细胞系
实验步骤1
1. 转染：
用CHO或者N2a细胞转染BACE-HA后培养48小时，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；
2. 加G418:
去掉培养液，PBS洗一次，加入浓度为800ug/ml的G418筛选培养基。
3. 换液：
根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。
筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；
4. 挑单克隆：
制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/5ul。
在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液5ul/孔。
待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。
5. 单克隆鉴定：
细胞大量扩增后，同时用原细胞系转染PCDNA3.1,并设置对照组即空白对照，提蛋白，做western blot检测。
实验步骤2
1. 将处于对数生长期的CHO或者N2a细胞按比例接种于12孔板，待细胞长到60%时转染。
转染方法同瞬时转染。
2. 待24-48小时后换为含800ug/mlG418的选择性培养基，将细胞按1:10稀释后稳定培养两周换为含600ug/mlG418的选择培养基
3. 将混合细胞吹打成单细胞悬浮计数，调整细胞数为每孔20个/孔，加入100ul含200ug/mlG418的选择培养基，待抗性克隆长出后挑选良好的克隆，逐步放大，压力由含200ug/mlG418的培养基增加至含800ug/mlG418的培养基继续筛选，最后稳定用含800ug/mlG418培养基培养。