双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究
双水相体系提取欧李种仁蛋白的初步研究
与其它常用的纯化蛋 白的方法相 比， 双水相萃取
技 术分 离 纯 化 蛋 白 质 具 有 以 下 优 势 ： 体 系 含 水 量 高， 可达 ８ ０ ％ 以上 ； 蛋 白质在 其 中不 易变 性 ； 界 面 张力
Hale Waihona Puke 关键 词 ： 欧李 ； 种仁蛋 白 ； 双水相萃取 ； 优化 ；放大操作
ｍ ｉ ｎ ； 易于放大和进行连续性操作 ； 萃取环境温和， 生物 相容性高 ； 聚合物对蛋 白质 的结构有稳定和保护作用 等 。正是 由于双水相萃取技术 的诸多优势 ， 现 已被广 泛 用 于蛋 白质 、 核酸、 氨 基酸 、 多肽、 细 胞器 等 产 品的分
离和 纯化 。 在 蛋 白质 的分 析研 究方 面 ， 已做 了大 量 的工作 ， 蛋
的活性及 其 构象 ； 而 双 水 相 法 利 用 聚 乙二 醇 （Ｐ Ｅ Ｇ） ／
白质 的分 离纯 化方 法 比较 完善 ， 但 国 内对 欧李 蛋 白质 分 离 提取 工 艺 研 究 较 少 ， 所 以应 该 对 欧李 蛋 白质 分 离
提 取工艺进 行 系统 的研 究并 完 善 。本 实 验采 用 双 水相
中 图 分 类 号 ： Ｓ６ ６ ２ ． ５ 文献标志码 ： Ａ
远远低于水 ， 有机溶剂两相体 系的界面张力 ， 有助于强
化 相 际问 的 质 量 传 递 ； 分 相 时间短 ， 一 般 只 需 ５一ｌ ５
文章 编号 ： １ ０ ０ １ — ４ ７ ０ ５ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ３ － ０ ０ ８ ２ ０５ －
Ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ Ｅｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｓ ｅ ｅ ｄ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｐｒ ｕ ｎ ｕ ｓ ｈ ｕ ｍｉ ｌ ｉ ｓ ｂ ｙ
双水相萃取详细资料PPT(44张)
（四）影响物质分配平衡的因素
主要有聚合物的分子量和浓度/pH/演的种类 和浓度/温度等。适当的选择各参数即在最 适条件下，可达到较高的分配系数和选择 性
成相聚合物的相对分子质 量
当聚合物相对分子质量降低时，蛋白质易 分配于富含该聚合物的相中。
例如：PEG/DX系统中当PEG的分子量降低时，会
双水相萃取
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
• 高聚物与高聚物形成两相是由于高聚物的不相容 性
• 高聚物与无机盐溶液也能形成两相，这是由于盐 析作用。
• 生化工程中，多应用聚乙二醇—-葡聚糖和聚乙二 醇-无机盐系统。
盐类的影响
在双水相聚合物系统中，加入电解质，首 先阴阳离子会有不同的分配。
盐的正负离子在两相间的分配系数不同， 由于各相应保持电中性，因而在两相中形 成电位差，这对带电生物大分子的分配， 产生很大的影响。
K-＞1 分配在上相 K+≈1 分配在下相
在pH6.9时溶菌酶带正 电，卵蛋白带负电。当 加入NaCl时，其浓度低 于50mmol/L时可见上 相电位低于下相电位， 使溶菌酶分配在。
只有当P和Q达到一定浓度才能形成两相
《双水相萃取技术》课件
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
双水相萃取技术
双水相萃取技术D09生物张燊睿092203112 内容提要:本文主要叙述双水相萃取技术的概念，原理，操作，未来发展方向以及在生物、食品工业中的应用。
Abstract:This paper mainly describes the two aqueous phase extraction technology concept, principle, operation, the future development direction as well as in the biological, food industry application关键词：萃取、分离、双水相体系、提取、生物分离、未来发展、亲和作用。
引言：随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、、代谢工程等高新技术研究工作的广泛的开展，各种高附加值得食品生化新产品不断涌现，对食品、生化等分离技术提出了越来越高的要求。
包括精馏、吸取、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术的三大特点：分离过程伴随有相的变化；筛分过程不能实现分子级别的分离；精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术不相适应。
围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。
双水相系统：基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。
由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。
采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。
当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐（一种是离散盐且另一种是亲液盐）在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成的。
例如用聚乙二醇（PEG Mr为6000）/磷酸钾系统从大肠杆菌匀浆中提取β-半乳糖苷酶。
7双水相
二、体系中无机盐离子的影响
无机盐离子在两相中也有不同的分配，因此在两相间形 成电位差。由于各相要保持电中性，使得带电生物大分子， 如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
水相pH6.9时, （碱性） 溶菌酶带正电荷 （酸性） 卵蛋白带负电荷
双水相在细胞碎片分离中的应用：
细胞碎片的分布行为图
双水相组分表：
从图中可以看出，随着液相中无机盐浓度的 增加，细胞逐渐由下层向上层分配；先进入双 水相，最后完全进入上相。
从清除细胞碎片的角度考虑，在刚形成双水 相时细胞碎片的沉淀最完全，上清液最清，也 最有利于离心分离。
思考题： 1、双水相是怎样形成的？ 2、图7-2中，T、B各表示什么，BM、TM表示什么？ 3、结合图7-10、7-11，说明为什么细胞浓度对分配系
顺便提一下： 菌体细胞一般带负电荷，
指的是：中性水。但在 pH < 4.0以下，则带正电荷。
关键是要了解它的pI。
3、体系pH的影响
pH会影响蛋白质中可离 解基团的离解度，因而改变 蛋白质所带电荷和分配系数； 另外，pH还影响系统缓冲物 质磷酸盐的离解程度，影响 相间电位差，从而影响分配 系数。
根据这一原则测定蛋白质 等电点pI的方法，称为交错 分配法
当正负电荷完全中和时，即形成沉淀。 （5区）
（二）、双水相体系的相体积比：
对萃取分离体系而言，相体积比是影响萃取分 离效率的重要因素，正、负离子表面活性剂的配 比及总浓度对双水相体积比有很大影响：
1、正、负离子表面活性剂配比对相体积比的影响：
固定表面活性剂的总浓度为0.18mol/L，从图中 可看出，在能够形成双水相的两个浓度区间，随 着CTAB配比的增加，上相体积呈增加的趋势。这 主要是由于CTAB的极性较大，能够争夺更多的水 分子。
双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用
牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基。
分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。
其在血液中的主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。
在动物细胞无血清培养中，可起到生理和机械保护作用和载体作用。
目前，石家庄鼎晨科技有限公司致力于研究牛血清白蛋白的溶液标准物质。
此外，纽邦生物科技有限公司也专业提供牛血清白蛋白。
双水相萃取技术主要技术特征是条件温和，两相间界面张力小，生物相容性高，萃取后目标产物的后处理简便，一般不存在有机溶剂残留问题，易于放大工艺，可获得较高收率和纯度，已经在生物化学、细胞生物学以及生物化工等领域得到了广泛的应用。
国内双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用十分广泛。
邓凡政等建立了由亲水性离子液体四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪唑和KH2PO4形成的双水相体系萃取分离牛血清白蛋白(BSA)的新方法，结果表明,磷酸二氢钾盐浓度为80g/L,离子液体浓度在160~240 mL/L,BSA的浓度为30~50 mg/L,溶液酸度在pH 4~8范围,离子液体双水相体系对BSA有较高的萃取率；林潇利用双水相技术萃取牛血清白蛋白回收率为96.90%。
结果表明，此方法回收率、重现性好，且适用于牛血清白蛋白和牛血红蛋白混合样品的检测，为蛋白质分离提取提供了一种新思路；田明玉考察了多种单羟基的短链醇/无机盐双水相体系对牛血清白蛋白的萃取能力。
结果表明，多种体系对牛血清白蛋白都有较好的萃取效果，在磷酸二氢钾18%（W/W）/乙醇18%（W/W）、碳酸钠13%（W/W）/乙醇18%（W/W）时，收率达到最大分别为94.0%、93.6%，此时其分配系数分别为11.52、11.24，这与传统的低分子量聚乙二醇/磷酸氢二钾体系萃取效果相似。
国外在双水相提取牛血清白蛋白中也取得了长足的发展。
LouwrerA用乙醇/磷酸氢二钾体系萃取分离牛血清白蛋白,酪蛋白，核糖核酸酶等蛋白质，实验结果表明：被萃取物在该体系能得到较好的分离，而且部分稳定性较高的蛋白的生物活性得到了很好的保持；E-Kiss等人采用硫酸铵/叔丁醇双水相体系对牛血清白蛋白进行分离提取，结果表明，牛血清白蛋白能保持较高活性沉淀到两相界面处；据外文文献记载，牛血清白蛋白在聚乙二醇/葡聚糖双水相体系中分配特性的研究实验中，结果表明：pH对其影响主要为任一NaCl浓度下，pH=5.0处均出现一波峰。
萃取的原理过程及应用
萃取是在两个液相间进行。
大部分萃取采用一个是水相。
另一个是有机相。
但有机相易使蛋白质等生物活性物质变性。
最近，发现有一些高分子水溶液（如分子量从几千到几万的聚乙二醇硫酸盐水溶液）可以分为两个水相，蛋白质在两个水相中的溶解度有很大的差别。
故可以利用双水相萃取过程分离蛋白质等溶于水的生物产品。
例如用聚乙二醇（PEG Mr为6000）/磷酸钾系统从大肠杆菌匀浆中提取β-半乳糖苷酶。
这是一个很有前途的新的分离方法，特别适用于生物工程得出的产品的分离。
萃取技术是一种分离技术，主要用于物质的分离和提纯，这里将介绍几种常用的萃取技术，有溶剂萃取、双水相萃取、凝胶萃取三种，本文将分别从它们的原理、过程及应用三方面介绍，这些技术广泛应用于分析化学、原子能、冶金、电子、环境保护、生物化学和医药等领域。
关键字溶剂萃取双水相萃取凝胶萃取原理过程应用摘要--------------------------------------------------- 1 目录--------------------------------------------------- 2一、溶剂萃取------------------------------------------ 31 原理-------------------------------------------- 32 过程-------------------------------------------- 53 应用-------------------------------------------- 5二、双水相萃取---------------------------------------- 61 原理-------------------------------------------- 62 过程-------------------------------------------- 73 应用-------------------------------------------- 8三、凝胶萃取------------------------------------------ 81 原理-------------------------------------------- 82 过程-------------------------------------------- 103 应用-------------------------------------------- 11 参考文献----------------------------------------------- 11第一章溶剂萃取利用在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的产物）溶解度的不同，从而达到分离的目的。
双水相萃取
各种双水相系统
聚合物1 聚合物1 聚丙二醇 聚合物2 聚合物2或盐 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚 糖 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 聚乙烯醇，葡聚糖， 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 羟甲基葡聚糖， 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠， 石酸钾钠， 石酸钾钠，磷酸钾
4、电化学分配 、 i、盐的种类及浓度 、
pH 升高, H2PO4- HPO42- PO43在PEG / K2HPO4 系统使带负电蛋白 蛋白有较高的K。 蛋白
ii、 pH 值的影响 改变两相的电位差 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大， 则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH 值的变化也会导致组成体系的物质电 性发生变化，也会使被分离物质的电荷发 生改变，从而影响分配的进行。
6、双水相萃取的工艺流程 、 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取; 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取 PEG的循 的循 无机盐的循环。 环; 无机盐的循环。
一、目的产物的萃取： 目的产物的萃取： 第一步，匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进 和无机盐在萃取器中混合， 第一步，匀浆液与 和无机盐在萃取器中混合 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（ 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（PEG相）， 相 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（ 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐 相） 。 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系， 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系，将目标蛋白 质转入富盐相，从而将蛋白质与PEG分离，以利于使用超 分离， 质转入富盐相，从而将蛋白质与 分离 滤或透析将PEG回收利用。 回收利用。 滤或透析将 回收利用 的回收循环： 二、PEG的回收循环： 的回收循环 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG; ①加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 相通过离子交换树脂， ②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 相通过离子交换树脂 用洗脱剂先洗去PEG，再 ， 洗出蛋白质。 洗出蛋白质。 无机盐的循环： 三、无机盐的循环： 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。 相的盐。 膜分离法回收盐类或除去 相的盐
双水相萃取技术
新型功能双水相系统
温度敏感型双水 相体系
聚合物浓度的影响
聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的 长度为零，此时分配系数为1，即组分均 匀的分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合 物的总浓度增大，系统远离临界点，系线 长度增加，两相性质的差别(疏水性等)增 大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点 处的值(K=1)，即大于1或小于1。因此,成 相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质 越容易分配于其中的某一相。
盐的种类影响
在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数， 不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不 同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生 物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
盐浓度的影响
盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰 乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相 体积比。 例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸 盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl 浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变 直接影响蛋白质的分配系数，如图。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这 一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效 地萃取分离不同的蛋白质。
lnK=lnK0+lnKe+lnKh+lnKb+lnKs+lnKc
式中，下标e、h、b、s、c分别表示静电作用、疏水作用、生 物专一性、分子大小、形态结构对分配系数的贡献。lnK0是 包括其他因素（盐的水合作用、配体相互作用）在内的分配 系数。
静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影 响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表 达式： lnK=Mλ/RT M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数;R-玻尔兹曼常数；T-绝对温度。 生物大分子物质的M值一般很大，λ的微小变化 会引起分配系数很大的变化。因此利用不同的表面 性质，可以达到快速分离非电介质型的大分子溶质 的目的。
双水相萃取法的原理与应用
双水相萃取法的原理与应用1. 原理介绍双水相萃取法是一种分离提取化合物的方法，通过利用两种不相溶的溶剂构成两个水相层，达到从一个水相层向另一个水相层进行分配的目的。
双水相萃取法具有选择性强、操作简便、成本低廉等特点，已广泛应用于生物分离纯化、环境污染检测、食品安全等领域。
2. 原理步骤双水相萃取法的基本步骤如下：1.准备两种互不相溶的溶剂，一般常用的是极性和非极性的溶剂，如水和有机溶剂。
确保两种溶剂相分离的界面有尽可能大的接触面积。
2.将待提取物溶解在一个适宜的溶剂中，使其分布均匀。
3.加入两种溶剂，振荡或搅拌使两相充分混合并达到平衡分配。
4.待体系分层后，通过离心或重力沉淀将两相分离。
5.收集有机相或水相中的萃取物，进行进一步的分析或应用。
3. 应用领域双水相萃取法在以下领域有广泛的应用：•生物分离纯化：双水相萃取法可用于分离和纯化生物大分子，如蛋白质、酶等。
通过调节溶剂体系的性质，可以实现对不同生物大分子的选择性分离。
•环境污染检测：双水相萃取法在环境污染物的检测中有重要应用。
通过使用适当的溶剂和调节pH值，可以有效地富集和分离样品中的有机污染物，如农药、重金属等。
•食品安全：双水相萃取法被广泛应用于食品安全领域。
利用双水相萃取法可以快速、高效地提取食品中的有害物质，如农药残留、食品添加剂等，确保食品质量和安全性。
•药物研发：双水相萃取法在药物研发中起着重要作用。
通过双水相萃取法可以从复杂的生物样品中富集和分离药物分子，为药物研发提供重要的前处理步骤。
4. 优缺点双水相萃取法具有以下优点：•选择性强：通过调节溶剂体系的性质，可以实现对不同化合物的选择性分离。
•操作简便：双水相萃取法操作简单方便，不需要复杂的仪器设备。
•成本低廉：双水相萃取法所需的溶剂成本较低，适用于大规模应用。
然而，双水相萃取法也存在一些缺点：•萃取效率较低：双水相萃取法对于某些极性化合物的富集效果较差。
•溶剂耗量大：双水相萃取法需要大量的有机溶剂来保证分离效果。
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化学与生物工程2006,Vol.23No.10
Chemistry&Bioengineering
7
收稿日期:2006-04-17
作者简介:郑楠(1982-),女,陕西人,硕士研究生,主要从事生化制药方面的研究。E2mail:zhengnan1982@sohu.com。
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究郑 楠,刘 杰(南昌大学环境科学与工程学院,江西南昌330029)
摘 要:阐述了双水相萃取原理,详细分析了影响双水相萃取分离纯化蛋白质的各种因素,探讨了双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用并对其前景进行了展望。关键词:双水相;蛋白质;分离纯化;影响因素中图分类号:TQ02818 Q512
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11 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2006)10-0007-03
液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。与传统的液-液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5～15min;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等。正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。1 双水相萃取原理双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。高聚物-高聚物-水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物-盐-水体系一般认为是盐析作用的结果。双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,不同之处在于萃取体系的性质差异。当生物物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K等于两相中生物物质的浓度比,
由于蛋白质的K值不相同(大致在011～10之间),因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。
2 双水相萃取中影响蛋白质分配的因素211 聚合物的分子量同一类聚合物的疏水性随分子量的增大而增强[1],当聚合物的分子量减小时,蛋白质易分配于富含
该聚合物的相。如在PEG2Dextran系统中,PEG的分子量减小或Dextran的分子量增大都会使分配系数变大,相反PEG的分子量增大或Dextran的分子量减小会使分配系数变小。这是由于PEG分子量增大时,它的疏水性显著增强,使蛋白质在上相的表面张力增大,
从而易于向下相分配。同理,Dextran的疏水性随其分子量的增大而增强,使蛋白质在下相的表面张力增大,从而不断向上相分配。212 聚合物的浓度在双水相系统中,界面张力很低并且随结线长度呈指数规律的增大。当系统组成处于临界点时,系线长度为零,上下相组成相同,蛋白质均匀地分配在两相中,分配系数K=1。当成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增加时,系统远离临界点,系线长度增大,两相性质的差别也增大,同时蛋白质在两相中的界面张力差别增大,使其趋于向一侧分配,即K
值或增大超过1,或减小低于1。郑 楠等:双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究/2006年第10期8
213 添加剂21311 中性盐盐的种类对分配系数的影响主要反映在对相间电位的影响上[2]。中性盐的种类不同,其正负离子分配系数也不同,当它在双水相中电离时,为保持两相的电中性,产生了不同的相间电位,从而影响蛋白质的分配。如在PEG2Dextran体系中加入NaClO4或KI,可增加上相对带正电的蛋白质的亲和效应,并迫使带负电的蛋白质进入下相;若加入Li3PO4情况则相反[1]。故只要改变界面电势就可控制荷电蛋白质转入所需要的相中。盐的浓度对分配系数的影响主要反映在对蛋白质疏水性的影响上[2]。如UfukGunduz和 KoncaKorkmaz用PEG33502Dextran35000体系分配BSA时,保持体系NaCl浓度不等(0106mol・L-1、011mol・L-1、012mol・L-1、013mol・L-1、0134mol・L-1),发现在任一pH值下,随着NaCl浓度的增加,分配系数先减小后增大,且在012mol・L-1处达到最小。这是由于BSA在上下相的相对疏水性随NaCl浓度的变化呈先大后小的趋势,当NaCl浓度为012mol・L-1时达最大,分配在下相的BSA也就最多,因而分配系数最小[3]。21312 有机溶剂在双水相体系中添加少量有机共溶剂,使得体系中的一部分水被有机共溶剂所取代,导致两相界面处的疏水性能差异发生变化,同时界面张力以及电位差也随之改变,从而影响了蛋白质的分配[4]。通常认为,有机共溶剂对被分配物质分配行为的影响更主要是有机溶剂和成相高聚物相互作用的结果[5]。如在PEG40002Dextran40000体系中分别加入相同量(2%)的乙醇、异丙醇、丙酮,均使BSA的分配系数显著降低,且加入乙醇后分配系数达到最小。这一现象完全符合以上理论:由于乙醇有较大的水化能,体系中的水较多地被乙醇所取代,使两相界面处的疏水性能差异、界面张力以及电位差较其它有机溶剂大,因此蛋白质分配系数的变化较大;再者乙醇与PEG相相互作用较强,使得蛋白质受排斥而易于向Dextran相富集。21313 表面活性剂Bodhankar和Gaikar等研究了四类表面活性剂,即阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性表面活性剂在PEG2Dextran体系中对物质分配的影响。实验表明,添加表面活性剂可以改变界面张力、上下相组成等两相特性,从而对物质的分配行为进行调节[6]。214 pH值体系pH值会影响蛋白质分子可离解基团的离解度,从而改变蛋白质的表面电荷数来影响分配。同时pH值还会影响缓冲离子如HPO2-4、PO3-4等的分配,以改变相间电位来达到改变分配系数的目的。另外在研究分配系数与pH值的关系时,若加入不同种类的中性盐,由于电位差的不同,其相应关系也不同[1]。215 温度温度的变化影响相物理性质的变化,例如粘度和密度等,从而影响蛋白质的分配[7]。但总的来说,温度对分配系数的影响是通过对相图的影响来间接达到的。在临界点附近,温度对相图的影响最显著,对分配系数的影响最强。当远离临界点时,温度对相图的影响较小,分配系数对温度的变化也不敏感。这是由于远离临界点时,成相聚合物的浓度增大,对蛋白质的稳定作用增强。216 荷电PEG作为成相聚合物在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差,
故可在PEG或葡聚糖上引入带电基团来改变蛋白质的分配。因相间电位差与电荷数成反比,而每个葡聚糖分子上可引入的带电基团较多,故效果较差。相反,
每个PEG分子只含两个羟基,只需引入两个荷电基团,电场增大的效果就较好。Johansson等已制得以下四种荷电PEG:带正电的三甲胺基2PEG(TMA2PEG)、氨基2PEG(PEG2NH2)和带负电的PEG2磺酸盐(S2PEG)、羧基2PEG(PEG2COOH)[8]。因此可以根据蛋白质的带电情况来选择荷电PEG,以达到改变蛋白质分配的目的。如红血球蛋白在pH值较小时带正电(等电点为7),若将PEG接上三甲胺基基团后,由于上相带正电,红血球蛋白就不断向下相富集;同理,
当pH值较大时,由于受上相正电TMA2PEG的影响,带负电荷的红血球蛋白则开始向上相富集。217 疏水基团在聚合物上接枝疏水基团后,疏水性成为影响蛋白质分配的主要因素。这种疏水性的影响由连接在高聚物上疏水基的大小和蛋白质分子疏水区域的数量以及疏水区的粘结强度所决定。Shanbhag和Axelsson
认为,通过比较蛋白质在PEG2Dextran体系和存在部分P2PEG(Palmitoyl2PEG)的PEG2Dextran体系中的分配系数,可以衡量蛋白质的疏水性。实验表明,在P2PEG浓度很低的情况下,血清白蛋白和乳球蛋白因易于同非极性的P2PEG结合,所以不断向上相富集[8]。218 亲和配基郑 楠等:双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究/2006年第10期9
在聚合物上接上一定的亲和配基,不仅能提高萃取分配的专一性,而且能增大处理量。例如:NADH2PEG衍生物引入PEG2Dextran体系后使乙醇脱氢酶的分配系数与其分子上结合位点数密切相关;另Ciba2cronblue2PEG衍生物引入PEG2Dextran体系后使磷酸果糖激酶的分配系数成千倍地提高。也可同时使用以上两种配基,从而增加系统的选择性,完成多种酶的分离和回收[7]。3 双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用和展望 双水相萃取技术已成功地用于分离和提纯蛋白质、提取抗生素和分离生物粒子、电泳分离氨基酸等方面。双水相萃取分离技术还有很多可开拓的领域:(1)新型双水相体系的开发。新型双水相体系主要有两类:廉价高聚物/高聚物体系及新型功能双水相体系。廉价双水相体系的开发目前主要集中在寻找一些廉价的高聚物取代现用昂贵的高聚物。例如:牌号PPT的变性淀粉和牌号为Reppa/PES的淀粉衍生物以及牌号为Pulluan的微生物多糖等[9]。研究发现由这些聚合物形成的双水相体系的相图与PEG2Dextran形成的双水相体系相图非常相似,其稳定性也比PEG2盐双水相体系更好,并且具有蛋白质溶解度大、粘度小等优点[10]。另外,特别要提到只有一种成相聚合物的新的双水相体系,上相几乎100%是水,聚合物绝大部分集中在下相,该体系不仅操作成本低、萃取效果好,还为蛋白质等生物物质提供了更温和的环境[11]。(2)后续色谱纯化工艺研究。高聚物/高聚物双水相萃取同离子交换层析技术结合可以解决双水相萃取技术在蛋白质粗分离纯化中的工业化问题。PEG2盐体系具有价廉和分相容易的优点,而疏水色谱可在高盐浓度下操作,故PEG2盐体系与疏水色谱的结合有很大的发展空间。如Schutte已成功利用疏水色谱从盐相中分离纯化蛋白质。(3)金属亲和双水相萃取技术。金属亲和双水相萃取和普通亲和双水相萃取相比,具有亲和配基价廉且再生容易、可用于PEG2盐体系的优点。Arnold提出了金属离子亲和双水相萃取技术,利用金属离子和蛋白质中精氨酸、组氨酸的亲和作用,以达到分离纯化蛋白质的目的。目前金属离子亲和双水相萃取已应用于多种酶的分离纯化。影响双水相萃取的因素比较复杂,主要包括静电作用、疏水作用及界面张力等。通过对各个因素的调节,可以极大地提高蛋白质的选择性,达到向一相富集的目的。参考文献: