重组仿刺参超氧化物歧化酶在大肠杆菌中表达条件的优化及分离纯化
重组大肠杆菌中NTA的发酵与表达优化
重组大肠杆菌中NTA的发酵与表达优化
重组大肠杆菌中NTA的发酵与表达优化
研究诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间、锌离子以及在发酵培养基中组合添加乳糖对提高重组新型溶栓酶外源蛋白的表达效率的作用,结果表明:IPTG诱导效果优于乳糖,IPTG诱导浓度选择1.5 mmol·L-1,诱导时机选择菌体OD600接近4.0时,诱导后的最佳培养时间为6h,加入1.0g·L-1的ZnCl2后,外源蛋白表达可提高40%,发酵结果提高29.8%.在培养基中组合加入微量的乳糖,可以使外源蛋白的表达效率提高10%～15%.
作者：顾建雅夏杰陆兵徐殿胜 GU Jian-ya XIA Jie LU Bing XU Dian-sheng 作者单位：华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237 刊名：宁波大学学报（理工版）英文刊名：JOURNAL OF NINGBO UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE & ENGINEERING EDITION) 年，卷(期)：2009 22(3) 分类号：Q789 关键词：重组新型溶栓酶发酵表达优化。
超氧化物歧化酶
超氧化物歧化酶的药用价值
• （ 1 ）可抑制心脑血管疾病： 机体的衰老与体内 可抑制心脑血管疾病： 氧自由基的产生与积累密切相关， SOD 可清除 人体内过多的有害的氧自由，是对健康的有益的 功效成分。具有调节血脂的保健作用，可预防动 脉粥样硬化，预防高血脂引起的心脑血管疾病。 降低脂质过氧化物的含量。 • （ 2 ）抗衰老作用 抗衰老作用：年龄的增长和某些体外因素 会造成机体和皮肤组织自由基产生超过机体正常 清除自由基的的能力，从而使皮肤组织造成伤害， 导致衰老。由于 SOD 能够清除自由基，因而可 以延缓衰老。
啤酒废酵母中SOD的制备工艺 的制备工艺 啤酒废酵母中
酵母泥 洗涤 酵母菌复壮 酵母培养基 灭菌
离心收集细胞
SOD纯化 纯化
离心取上清液
破壁提取
提取条件的研究 1.细胞破壁方法 细胞破壁方法 分别对比了甲苯法、乙醇-氯仿法 异丙醇法。 氯仿法、 分别对比了甲苯法、乙醇 氯仿法、异丙醇法。异 丙醇法得到的 得到的SOD酶活最高。 酶活最高。 丙醇法得到的 酶活最高 2.异丙醇浓度的确定 异丙醇浓度的确定 90%的异丙醇提取得到的酶总活力最高 的异丙醇提取得到的酶总活力最高 的异丙醇 3.最佳提取时间 3.最佳提取时间 SOD的释放量随着提取时间的增加而增加到一定 的释放量随着提取时间的增加而增加到一定 的数量后， 的数量后，增加量减慢 。120min提取量和设备利用 提取量和设备利用 率都得到保证。 率都得到保证。 4.最适提取 的确定 最适提取 最适提取pH的确定 在pH7 .0时总酶活最高 时总酶活最高
工艺优点
工艺优点 工艺优点
•采用异丙醇破壁、丙酮二次纯化提取 采用异丙醇破壁、 采用异丙醇破壁 SOD生产工艺，可得到 生产工艺， 产品， 生产工艺 可得到SOD产品，且 产品 酶比活达3050．2 u/mg。胞内 酶比活达 ． 。胞内SOD提 提 取纯化老工艺一般要经过细胞破碎、 取纯化老工艺一般要经过细胞破碎、离 工艺优点 盐析、透析、离子交换层析、 心、盐析、透析、离子交换层析、凝胶 层析五至六个步骤。 层析五至六个步骤。才能达到酶比活大 的水平。 于3000u/mg的水平。因此该工艺步骤 的水平 设备少、操作简单、成本低。 少、设备少、操作简单、成本低。
生命体中的超氧化物歧化酶_综述_
心超滤浓缩 H 冷冻干燥得淡蓝色成品。 从 一 些 植 物 和 微 生 物 中 提 取 )*% 可 使 用 >?;@;A?8 法，它的特点是采用经典的硫酸铵分级沉 淀 提 取 粗 酶 ， 它 可 避 免 ’77/89 4 :8;9/<;7= 法 使 ’I 4 )*% 失活的缺点。亲和层析法和高压液相色 谱法 （ $P25）均具有提纯步骤少，专一性好，自 动化和纯化率高等特点，但所需试剂和仪器较复 杂昂贵，目前多在科研中使用。利用生物技术生 产 )*% 在 国 外 引 起 重 视 ， 是 一 个 很 有 前 途 的 方 向。日本选用耐草快 （ G+ G 4 二甲基 4 CQC 4 双吡啶 姆，简称 PR）除草剂的烟草愈伤组织为材料生产 )*%，在叶绿素中光系统 S 产生的电子使 PR 还原 成 PR 游离基，后者与 *, 直接反应产生 *, 4 ，故可 制备 PR 的愈伤组织并诱导产生 )*%。来自 PR 愈 伤组织的 )*% 为单一电泳区带，分子量为 , T G+ 万，与一般烟叶相比，活性高很多。 C+ )*% 的活力测定 据报道 H )*% 活性在糖尿病 H 慢性肾功能不全 与正常者间有显著差异 H 吸烟者红细胞 )*% 和精浆 )*% 含量均较非吸烟者低 H 而这与不育可能有关 U 在 )*% 的分离纯化过程中 H 活力监测也至关重要 H 可见适宜的 )*% 活力测定方法的研究具有重要的 现实意义。 脉冲辐射分析法，快速冷冻法结合的 L)V 分 析法，截流光谱分析法，极谱氧电极法和极谱法 可直接获得 )*% 与 *, 4 反应的动力学信息，测定 反应过程中 *, 4 浓度的变化，因而称之为直接法。 因受试剂和仪器的限制，此类方法一般难于在实 验室推广。 )*% 活性测定的另一大类方法是间接法。由 于 )*% 的作用底物是 *, 4 ，它的存在寿命很短， 而上述直接法又不能得到普遍推广，因此一般常 用间接的活力测定方法。其原理是：有一产生 *, 4 的系统，使 *, 4 再产生一个便于检测的反应，通过 监测 )*% 对这个反应的抑制程度间接测定 )*% 活 力。此类方法有经典的邻苯三酚自氧化法，改良 的邻苯三酚自氧化法，四氮唑蓝法，肾上腺素自 氧 化 法 H 联 二 茴 香 胺 法 以 及 黄 嘌 呤 氧 化 酶 4 W(& 法，碱性二甲基亚砜 4 鲁米诺法，化学发光免疫 法 （ 52S6）等。 )*% 活性测定方法已较成熟，近年来国内外 仍有一些报道和专利。杜鸣等 B ! D 合成了 C 种硫代碳 酰胺化合物，这些化合物具有试剂稳定，与 *, 4 反
大肠杆菌重组蛋白表达流程
大肠杆菌重组蛋白表达流程大肠杆菌重组蛋白表达流程主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达载体：通常选择含有启动子、转录终止子、选择标记和适当的表达调控元件的表达载体。
启动子用于驱动基因转录，转录终止子用于确定转录产物的结束位置，选择标记有助于筛选含有目的基因的转化子，而表达调控元件可以调节基因的表达水平。
2. 构建表达载体：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。
在此过程中，需要考虑目的基因的orientation（方向）、阅读框（ORF）以及表达调控元件的活性等因素。
3. 转化大肠杆菌：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌中。
转化方法有多种，如化学法（如CaCl2法）、电转化、热激转化等。
转化后，大肠杆菌吸收了外源DNA，成为重组菌株。
4. 筛选重组菌株：在含有选择性抗生素的培养基上培养转化后的菌落，筛选出含有目的基因的重组菌株。
此外，可以通过鉴定菌落的形态、颜色等特征进行初步筛选。
5. 诱导表达：将筛选出的重组菌株接种到含有诱导剂（如IPTG）的培养基中，诱导目的基因的表达。
诱导剂IPTG可以与表达载体中的启动子结合，增强基因转录和翻译的效率。
6. 收集和纯化重组蛋白：诱导表达后，菌体中会含有目的蛋白。
可以通过离心、破碎细胞、柱层析等方法分离和纯化重组蛋白。
常用的纯化标签有His标签、GST标签等，这些标签可以帮助分离和纯化目的蛋白。
7. 蛋白活性检测和应用：对纯化的重组蛋白进行活性检测，如酶活测定、蛋白互作实验等。
确认蛋白活性后，可应用于生物学研究、药物研发等领域。
需要注意的是，大肠杆菌重组蛋白表达过程中可能会遇到表达量低、蛋白包涵体等问题。
为了解决这些问题，可以尝试优化表达载体、改变诱导条件、使用融合标签等策略。
重组包涵体蛋白Cry1Ab_Ac在大肠杆菌中的的表达_纯化及复性_曹思硕
农业生物技术学报1530Journal of Agricultural Biotechnology科学通讯—蛋白体外表达Science Communication—Protein Expression重组包涵体蛋白Cry1Ab/Ac在大肠杆菌中的的表达、纯化及复性Expression,Purification and Refolding of Recombinant Cry1Ab/Ac Ob-tained in Escherichia coli as Inclusion Bodies苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种普遍存在的革兰氏阳性菌，可以孢子繁殖，能产生特定的杀虫晶体蛋白δ-内毒素。
根据氨基酸序列相似性可将这种毒素主要分为两种，分别为Cry和Cytδ-内毒素。
研究证明Cry蛋白对各种昆虫是有毒性的，例如多种鳞翅目、双翅目昆虫的幼虫、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目、线虫等，所以Cry蛋白可以作为一种新型的生物杀虫剂以减少化学广谱杀虫剂的使用。
本实验通过聚合酶链反应(PCR)从转基因水稻(Oryza sativa)的基因组中克隆到了重组的苏云金芽胞杆菌基因Cry1ab/ac。
由于转基因过程中，为了提高Cry1ab/ac基因在水稻中的表达量，将其密码子修改成水稻偏爱的密码子，因此该基因含有大量的大肠杆菌(Escherichia coli)利用率较低的密码子，本研究通过PCR技术对Cry1ab/ac前20个密码子进行了优化，提高了Cry1ab/ac基因在大肠杆菌中的表达量。
Cry1Ab/Ac蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得了高效表达，并且可以溶解于8mol/L的尿素，在变性条件下用亲和层析色谱柱(His Trap TM FF crude column)进行纯化。
将纯化的Cry1Ab/Ac蛋白在复性缓冲液中透析以获得具有可溶性和生物活性的蛋白质。
为了达到更高的生物活性，用肠激酶消化Cry1Ab/Ac 蛋白的His-标签，使用AKTA净化器Superdex75HR10/30柱将Cry1Ab/Ac蛋白进一步纯化。
SOD
实验四植物中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化一、实验目的1通过超氧化物歧化酶的分离纯化，了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换柱层析方法的原理。
2掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。
二、实验原理（一）SOD的性质超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。
SOD金属蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。
它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn—SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn—SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe—SOD)。
SOD催化如下反应： O2-+ O2-+2H+一H202+O2（二）SOD的分离提取蛋白质包括酶的分离纯化方法很多，主要有：①根据蛋白质溶解度不同的分离方法，蛋白质的盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法；②根据蛋白质分子大小的差别的分离方法，透析与超滤、凝胶过滤法；③根据蛋白质带电性质进行分离，电泳法、离子交换层析法。
④根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法。
1、酶的提取纯化：在分离制备时首先将植物细胞破碎，用提取液制备粗酶液。
经加热变性、有机溶剂沉淀除去大量杂蛋白，再用DEAE-纤维素柱层析或DEAE-葡聚糖柱层析纯化，可得到更纯的酶。
经过以上分离纯化步骤后，酶可提纯100倍以上。
大部分酶都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用水溶液提取分离和纯化酶。
稀盐和缓冲系统的水溶液对酶稳定性好、溶解度大,是提取酶最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于酶的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数酶的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使酶变性失活，因此，基于这一点考虑提取酶时一般采用低温（5℃以下）操作。
超氧化物歧化酶(SOD)研究进展
一、超氧化物歧化酶( SOD)概述:超氧化物歧化酶( Superoxide dismutase, SOD)是一种广泛存在于生物体内,能清除生物体内的超氧阴离子自由基(O-2 ) ,维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶。
具有保护生物体,防止衰老和治疗疾病等作用。
1938年, keilin从牛血中分离出一种含Cu的血铜蛋白。
1969年Mccwrd及Fridovich发现血铜蛋白、肝铜蛋白、脑铜蛋白均有O2- 歧化活性,因此,将该酶命名为超氧化物歧化酶。
此后,对超氧化物歧化酶的研究逐步深入。
超氧化物歧化酶广泛存在于生物体中,是属于结合酶类。
目前已发现SOD的三种同工酶,其特征见表一。
表一三种SOD的特征种类颜色分子量分子构象亚基数分布Cu. /Zn. SOD 蓝绿色32000 β- 折叠2 真核细胞Mn. SOD 粉红色80000 α- 螺旋4 真核细胞、原核细胞Fe. SOD 黄色40000 α- 螺旋2 原核细胞超氧阴离子自由基(O2- )是机体不同反应产生的重要的自由基,对机体有害,会导致机体的衰老。
超氧化物歧化酶是机体内天然的自由基清除剂,催化超氧阴离子自由基(O2- )发生歧化反应,清除的超氧阴离子自由基(O-2 )对机体的作用。
SOD催化O2- 的反应如下:2O -2 + 2H+ SOD H2O2 + O22H2O2 CAT 2H2O + O2 (CAT为过氧化物酶)H2O2 + 2GSH GSHPX GSSG + 2H2O (GSHPX为谷胱甘肽过氧化物酶)二、SOD在医学上的应用1SOD在抗衰老中的作用人体随着年龄的增加,皮肤会变得粗糙、发皱、变黑和形成老年斑,其中老年斑是皮肤衰老的典型现象,即在老年人的面部、手部皮肤上出现黑褐色斑块或斑点。
老年斑主要由黑色素组成,而自由基在黑色素形成、反应和组成中起重要作用。
在有空气存在时,光照黑色素可使其耗氧增加,产生O-2 和羟自由基。
重组TaqDNA聚合酶在大肠杆菌中的表达与纯化
文章编号:10069798(2004)01009304重组Taq DNA 聚合酶在大肠杆菌中的表达与纯化Ξ汪靖超,李荣贵(青岛大学理工学院生物学系,山东青岛266071)摘要:从嗜热菌Therm us aquaticus 中分离出的Taq DNA 聚合酶由于其热稳定性,在聚合酶链式反应(PCR )中得到广泛的应用,我们根据编码Taq DNA 聚合酶的基因序列,设计出一对引物,通过PCR 扩增出Taq DNA 聚合酶基因,并将其克隆到表达载体p ET -15b 中,转化大肠杆菌 E.coli BL21(DE3),经IPTG 诱导后,重组Taq DNA 聚合酶在大肠杆菌中实现了大量表达。
经过热变性、亲和层析、阳离子交换层析获得了电泳纯的重组Taq DNA 聚合酶。
本研究的生产程序可作为Taq DNA 聚合酶生产的一种新方法。
关键词:重组Taq DNA 聚合酶;表达;纯化中图分类号:Q786 文献标识码:ATherm us aquaticus 是一种水生嗜热菌,从该菌中分离出的DNA 聚合酶(Taq DNA 聚合酶)具有催化以DNA 为模板合成DNA 的功能[1],由于该酶具有良好的耐热性,使其在聚合酶链式反应(polymerase chain re 2action ,PCR )中得到广泛的应用。
随着PCR 技术在医学诊断、分子生物学、农业、环保等领域应用的日趋广泛,Taq DNA 聚合酶的用量正逐年增加。
由于T.aquaticus 培养困难,并且其Taq DNA 聚合酶的产量也不高,现在市售的Taq DNA 聚合酶大都是基因工程产品。
Taq DNA 聚合酶的编码基因最初是由Lawyer 等[2]利用噬菌体展示技术从T.aquaticus 的基因组DNA 中分离出的,该基因全长为2499bp ,编码832个氨基酸残基。
为了获得重组Taq DNA 聚合酶,国内外已有多家实验室将Taq DNA 聚合酶基因转至大肠杆菌进行了表达并纯化了该蛋白,Lawyer 等[2]利用Lac 启动子表达了该蛋白,但表达量很低;Engelke 等[3]从T.aquaticus 中克隆了Taq DNA 聚合酶基因,重组到p TTQ18质粒中,转化到大肠杆菌中表达,但产量较低,且纯化耗时较长;Jin 等[4]将该基因克隆到pBV221载体上,由P R P L 启动子控制表达,表达量很高,表达产物主要以包含体的形式存在,随后的纯化过程也比较复杂。
超氧化物歧化酶(SOD)
工艺流程
酵母泥
洗涤 灭菌 酵母菌复壮 SOD提取
•
酵母培养基 •
SOD纯化
实验过程
• 啤酒酵母的预处理 • 酵母的复壮培养 • 酵母SOD的提取
• SOD纯化
酵母培养基配方
葡萄糖8% 蛋白胨1% 酵母膏1% 蒸馏水 1000ml
121℃灭菌20min
按30％ห้องสมุดไป่ตู้种量接入 经过洗涤后的酵母
恒温摇床培养 28℃140r/min 2h
妆品等方面的应用将更加广泛。
从众多研究者的研究中我们可以得出，微生 物类群SOD含量的基本规律是：革兰氏阳性菌和革 兰氏阴性菌的SOD含量没有明显差异，放线菌和细 菌的SOD 含量没有明显的差异，真核微生物的SOD 含量一般高于原核微生物，好氧微生物的SOD 含 量显著高于厌氧微生物。
鉴于SOD在微生物中的含量的分布，
常用以下七种SOD高产菌株进行研究。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase， SOD)是一种生物体防御氧化损伤的、对机体具有
显著保护作用的生物酶，它广泛分布于动物、植 物与微生物体内。由于SOD具有清除体内O2-的能 力，且能较好地抵御氧自由基和基他氧化物自由 基对细胞质膜的毒性，维持细胞正常的生理代谢， 所以其在机体保护方面起着重要作用，也因此SOD 被广泛应用于医药、食品和化妆品工业，作为抗 衰老、抗炎症、治疗自身免疫疾病的药品以及食 品、化妆品的添加剂等，被专家称为21世纪最有 前途的药用酶。
扩大培养， 得到含SOD的湿菌体
返回
每1 g酵母湿细胞 中加入9 mL异丙醇
浸泡120 min 抽滤除去溶剂
SOD粗提液
搅拌120min 离心除去菌体
加入三倍体积的50mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH7.0）
SOD(超氧化物歧化酶)
• 我们的身体有个缓冲系统 SOD 成分，可以帮助 分解自由基，防止对身体其它部位的伤害，在 25 岁之前，人体的SOD 指数很高，所以不会 有被自由基影响的衰老现象， 但在 2 5 岁之后， SOD 指数 逐渐下降， SOD 无法全部分解 体内 的自由基 ，自由基就会弥漫在体内 ，不断攻击 身体细胞， 所以说 大约在 25 岁后就要为抗老 化抗氧化做准备了.也有专家呼吁，因目前的空 气环境恶化，生活和工作的压力大，我们抗氧 化的护理需要再提前，应该在 25 岁之前。 • 另外，有医学报告指出， 抗氧化能力的衰退期 已提前至35岁左右 。
09 生 物 工 程 宁 春
SOD（超氧化物歧化酶）
• 是一种源于生命体的活性物质， 能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。 对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离 得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研 究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新 发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄 清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所 以正式将其命名为超氧化物歧化酶。
• • SOD
是 健 康 之 本
• 全 球 118 位 科 学 家 发 表 联 合 声 明 ：
自 由 基 是 百 病 之 源
• n55!w!nao ˆ 7!npaau!
• （ 4 ）肺气肿：肺气肿患者亦可使用 SOD ， 但应在病变初期肺弹性纤维尚未受到损害 时使用，疗效较好。 • （ 5 ）辐射病及辐射防护：本品可用来治 疗因放疗引起的膀胱炎、皮肌炎、红斑狼 疮及白细胞减少等疾病，对有可能受到电 离辐射的人员，也可注射 SOD 作为预防措 施。 • （ 6 ）老年性白内障： 对这类疾病应在进 入老年期前即开始经常服用抗氧化剂，或 者说经常注射 SOD 。如果一旦形成白内障， 则除摘除外，用 SOD 治疗无效。
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第３８卷第２期２ ０ １ ９年３月大连工业大学学报Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｌｉａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＶｏｌ．３８Ｎｏ．２Ｍａｒ．２ ０ １ ９
收稿日期：２０１８－０４－１４．
基金项目：辽宁省自然科学基金重点项目（２０１７０５２００４３）．
作者简介：黄君（１９９２－），女，硕士研究生；通信作者：李成（１９８５－），女，讲师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｃｈｅｎｇｈｉ＠１２６．ｃｏｍ．
ＤＯＩ：１０．１９６７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｄｌｇｙｄｘｘｂ．２０１９．０２０４
重组仿刺参超氧化物歧化酶在大肠杆菌中表达条件的优化及分离纯化
黄 君１， 张晓天１， 李 月２， 穆 贤１， 丛丽娜１， 李 成１
（１．大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 １１６０３４；２．营口市环境监测中心站，辽宁营口 １１５０００）
摘要：利用基因工程菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ３０ａ（＋）－ＳＯＤ１，
优化表达重组仿刺参超氧化物歧化酶蛋白
（ｒＡｊ－ＳＯＤ１）。采用摇瓶发酵优化ｒＡｊ－ＳＯＤ１可溶性表达的条件，提高蛋白的表达产量。结果表明，在温
度３０℃、转速２００ｒ／ｍｉｎ、０．１ｍｍｏｌ／
Ｌ ＩＰＴＧ诱导８ｈ条件下，菌体中ｒＡｊ－ＳＯＤ１蛋白表达量最大，达到
３１５．５９ｍｇ／Ｌ。电泳检测结果表明，ｒＡｊ－ＳＯＤ１的纯度为９６．７％，符合后续酶活要求。纯化后ｒＡｊ－ＳＯＤ１质量浓度为９８．７３ｍｇ
／Ｌ，收率为３１．２８％。邻苯三酚法对ｒＡｊ－ＳＯＤ１蛋白进行活性分析，结果表明，纯
化的ｒＡｊ－ＳＯＤ１蛋白具有明显的抗氧化活性
。
关键词：仿刺参；超氧化物歧化酶；抗氧化活性
中图分类号：ＴＳ２５４；Ｑ７８６文献标志码：Ａ文章编号：１６７４－１４０４（２０１９）０２－００９２－０５
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ＳＯＤ１ｉｎ
Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＵＡＮＧ Ｊｕｎ１， ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏｔｉａｎ１， ＬＩ Ｙｕｅ２， ＭＵ Ｘｉａｎ１， ＣＯＮＧ Ｌｉｎａ１， ＬＩ Ｃｈｅｎｇ
１
（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄａｌｉａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ １１６０３４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｙｉｎｇｋｏｕ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｙｉｎｇｋｏｕ １１５０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ３０ａ（＋）－ＳＯＤ１ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓＡｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ｒＡｊ－ＳＯＤ１）．Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ ｒＡｊ－ＳＯＤ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｒＡｊ－ＳＯＤ１ｃｏｕｌｄ
ｒｅａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ（３１５．５９ｍｇ／Ｌ）ａｔ ３０℃，２００ｒ／ｍｉｎ ａｎｄ ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ８ｈ．
Ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｒＡｊ－ＳＯＤ１ｗａｓ ９６．７％，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｍｅｅｔ ｔｈｅ
ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｔｈｅ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒＡｊ－ＳＯＤ１ｗａｓ ９８．７３ｍｇ／Ｌ ａｎｄ
ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ３１．２８％．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒＡｊ－ＳＯＤ１ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒＡｊ－ＳＯＤ１ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ；ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ
０ 引
言
海参具有降血脂、抗菌等多种生物功能和十分重要的药用价值
［１－２］。
其显著的抗氧化性能有
效减轻自由基对机体的损伤［３－４］。
铜锌超氧化物歧化酶（Ｃｕ／Ｚｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ１）是一种广泛存在于生物体内抗氧化损伤的金属酶［５－６］。自由基是机体多种生化过程正常代谢的产物，过多的积累会造成机体的氧化损伤［７－８］。Ｃｒｕｚ［９］和Ｃｈｅｎ等［１０］的研究表明，补充外源性抗氧化酶能有效清除机体过多的氧自由基，在一些疾病的治疗中有良好的疗效，因此研究开发ＳＯＤ１倍受人们的重视。近年来，ＳＯＤ１的应用和开发有了很大的发展，但大多是从天然动植物中提取，来源受到很大的限制［１１－１２］。用基因工程方法制备重组ＳＯＤ１可获得大量廉价而又安全的制品，但在无脊椎动物中还未见报道。因此，外源表达海参种属的ＳＯＤ１具有广阔的应用前景［１３］。实验室已成功构建大肠杆菌原核表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋）－ＳＯＤ１，并利用ＢＬ２１（ＤＥ３）成功表达了可溶的、具有抗氧化活性的重组ｒＡｊ－ＳＯＤ１蛋白，但其表达量较低，无法满足现阶段自由基氧化损伤相关疾病的治疗需求。为了获得高纯度的抗氧化活性的重组ｒＡｊ－ＳＯＤ１蛋白，本实验对发酵条件进行了优化并利用亲和层析柱Ｎｉ ２＋－ＮＴＡ分离纯化，以期为仿刺参功能性蛋白超氧化物歧化酶的研发提供一定的理论基础。１ 材料和方法１．１ 材 料１．１．１ 菌 种基因工程菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ３０ａ（＋）－ＳＯＤ１，本实验室构建并保藏。１．１．２ 试 剂ＩＰＴＧ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇ公司；Ｎｉ ２＋－ＮＴＡ填料，ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ公司；咪唑，Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；低分子质量蛋白Ｍａｒｋｅｒ，ＴａＫａＲａ生物（大连）公司；其他试剂均为国产分析纯。１．２ 实验方法１．２．１ 重组ｒＡｊ－ＳＯＤ１蛋白的诱导表达将从－８０℃冰箱保存的Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ３０ａ（＋）－ｒＡｊ－ＳＯＤ１菌株活化，挑取单菌落于ＬＢ／Ｋａｎ＋液体培养基中，３７℃过夜培养。活化后进行摇瓶发酵培养，至菌体ＯＤ６００为０．６时按照１％体积比例接种于５０ｍＬ的ＬＢ／Ｋａｎ＋培养基中，３７℃扩大培养至ＯＤ６００达到０．６时，加入ＩＰＴＧ进行诱导表达。１．２．２ 发酵条件的优化选用ＬＢ／Ｋａｎ＋基础培养基，对菌体的发酵条件进行优化处理。诱导时间分别为４、６、８、１２ｈ；
诱导温度分别为２３、３０、３７、４２℃；
摇床转数分别为
１５０、１８０、２００、２２０ｒ／ｍｉｎ，ＩＰＴＧ浓度分别为０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．５０ｍｍｏｌ／Ｌ。按
照“１．２．１”的方法，分别对ＢＬ２１（ＤＥ３）／
ｐＥＴ３０ａ
（＋）－ＳＯＤ１进行诱导表达
。
将收集的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤２次后，沸水浴１０ｍｉｎ，离心收集上清，
检测可溶性蛋白
表达情况。根据ＳＤＳ电泳结果，利用
Ｂａｎｄｓｃａｎ
５．０软件进行分析，并确定可溶重组ｒＡｊ－ＳＯＤ１
蛋
白的表达量。１．２．３ 重组ｒＡｊ－ＳＯＤ１蛋白的提取纯化１．２．３．１
发酵菌体预处理
在最适发酵条件下对目的蛋白进行诱导表达后，收集菌体，ＰＢＳ洗涤菌体３次，冻融处理后于
冰浴中超声破碎菌体，超声条件：功率，２２０Ｗ；
工
作时间／间隔时间，３ｓ／３ｓ；超声１５ｍｉｎ。
将上清
液用０．２２μｍ滤膜过滤
。
１．２．３．２ Ｎｉ ２＋－ＮＴＡ分离纯化用４０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑、２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠
、
ｐＨ
７．４的平衡缓冲液平衡Ｎｉ ２＋－ＮＴＡ层析柱。将处理后的上清液以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的体积流量上样
，
再用１０倍柱体积的结合缓冲液冲洗未结合的蛋白，用
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑、２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠、
ｐＨ
７．４
５
倍柱体积的洗脱液洗脱目的蛋白，收集并
取样进行ＳＤＳ电泳检测
。
１．２．４
蛋白质量分数的测定
采用考马斯亮蓝法测定总蛋白质量浓度［１７］，
用Ｂａｎｄｓｃａｎ软件分析粗提液重组ｒＡｊ－ＳＯＤ１占菌体总蛋白质量分数，据此计算ｒＡｊ－ＳＯＤ１的质
量浓度。１．２．５ 邻苯三酚自氧化法检测海参ＳＯＤ１活性通过邻苯三酚自氧化法［１８］检验纯化后重组ｒＡｊ－ＳＯＤ１的抗氧化活性，以ＶＣ
作对照。检测条
件如表１所示
。
表１ 海参ＳＯＤ１活性检测条件Ｔａｂ．１ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ
ＳＯＤ１ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ
试剂Ｖ／ｍＬ
１ ２ ３ ４５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ３．５０ ３．３５ ２．３５ ２．３５
０．０１ｍｇ
／ｍＬ Ｖ
Ｃ１．００
０．１ｍｇ
／ｍＬ ｒＡｊ－ＳＯＤ１ １．００
４．５ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯三酚０．１５ ０．１５ ０．１５
３９第２期黄君等：重组仿刺参超氧化物歧化酶在大肠杆菌中表达条件的优化及分离纯化