卵泡液蛋白质组学与体外受精不良妊娠结局相关性研究进展(2020完整版)

卵泡液蛋白质组学与体外受精不良妊娠结局相关性研究进展（2020完整版）

摘要 体外受精（IVF）是不孕不育疾病的常规治疗方法，但存在着妊娠成功率低以及相应不良妊娠结局问题。在后基因时代，基于蛋白质组学的人类卵泡液研究可提供有关IVF过程各个步骤的实质性信息，并有助于预测或改善IVF妊娠结局。通过检索PubMed、Scopus、Web of Science数据库，本文回顾了基于人类卵泡液蛋白质组学的IVF妊娠结局相关研究的最新进展，旨在总结可用于优化IVF结局的潜在标志物的同时提供IVF失败机制见解，以促进生殖医学的基础研究，进而加速临床转化。

【关键词】 受精，体外； 卵泡液； 蛋白质组学； 不良妊娠结局 不孕不育是全球范围内普遍的生育问题。20世纪70年代后期以来，越来越多的国家使用辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART），其包括用新鲜或冷冻胚胎进行体外受精（in vitro fertilization，IVF）以及卵胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）［1-2］。目前IVF适应证已经扩展到由排卵诱导失败、子宫内膜异位症、单侧输卵管病变、宫颈因素所致或原因不明的不孕不育［3］。然而，妊娠成功率以及相应妊娠结局仍然是临床IVF实践中关注的重要问题［4］。近年，人类卵泡液蛋白质组学常常用以研究生殖系统疾病，包括卵巢过度刺 激综合征［5］、子宫内膜异位症［6-7］、IVF反应不良［8-9］和多囊卵巢综合征（PCOS）［10-11］。卵泡液蛋白质组学技术不仅可鉴定卵泡液内特定成分，还能够为发现与IVF妊娠结局相关的蛋白标志物，以及解释IVF妊娠失败的具体机制提供思路。在此背景下，本文基于人类卵泡液蛋白质组学技术的IVF妊娠结局相关研究进展作一综述。

一. IVF及其妊娠结局 IVF是一种涉及体外操纵配子结合而受精的ART。IVF后妊娠首次报道于1976年［12］，并于1978年首例IVF婴儿出生［13］。随着技术的不断改良，IVF成功率不断提高，现已成为许多生殖疾病（例如双侧输卵管阻塞）的常规治疗方法。然而，据估计只有约30％的经IVF治疗受精卵会达到成功着床［14］。与IVF阳性结果（活产）相反的是，IVF不良妊娠结局表现为流产、无妊娠［7］。辅助生殖治疗获得的妊娠更容易导致死产、多胎妊娠、早产和低出生体质量，尤其在向宫腔内放置单个或多个胚胎后的不良结局发生率更高［15］。有研究表明，IVF/ICSI单胎妊娠与全球先天畸形儿的高出生率显著相关［16］。因而，妊娠结局不良是阻碍ART得到进一步应用的关键障碍。 最近一项研究表明，IVF结局与产妇和婴儿围产期受损相关，其影响因素包括高龄妇女、生育迟缓、超重和肥胖、低生育力、多胎分娩、特定不孕症等［17］。另一方面，研究表明女性年龄、不孕不育持续时间、基础卵泡刺激素（FSH）水平和卵母细胞数量均可反映卵巢功能并作为IVF妊娠 结局的预测因素［18］。鉴于IVF治疗过程中的复杂因素，更深入地理解分子过程将有助于临床医生通过个性化方法治疗特定类别的患者来提高IVF治疗的成功率［19］。 二. 卵泡液与蛋白质组学 人类卵泡液（human follicular fluid，HFF）是一种由血液蛋白通过卵泡毛细血管的扩散以及卵泡细胞和卵母细胞的分泌而产生的复杂体液，卵泡液为卵母细胞的发育和成熟提供了特殊的微环境［19］。由于卵泡液影响卵母细胞的发育，其组成已被作为卵母细胞和胚胎质量的潜在预测因子来研究［20］。HFF中含有多种成分，这些分子具有调节卵母细胞和卵泡成熟并保护滤泡细胞免受物理或氧化损伤的作用［19，21］。其中，蛋白质成分不仅能反映卵泡本身以及卵泡颗粒和卵泡膜的代谢状态，还能反映卵母细胞的功能状态。同时，HFF容易从IVF治疗周期中获得，并且是用于非侵入性诊断卵巢疾病、评估卵母细胞成熟、卵子受精以及预测IVF妊娠结局的理想依据［4］。 蛋白质组学（proteomics）是在一种细胞、组织乃至个体中所表达的全部蛋白质定性和定量的特征［22］。涉及蛋白质分离与鉴定的蛋白质组学技术主要包括传统的双向凝胶电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis，2-DGE）与新兴的液相色谱/质谱联用技术（liquid chromatography/mass spectrometry，LC-MS）。2-DGE理论上可通过蛋白质等电点和相对分子质量的差异将蛋白质样品分离，然而因为低丰度蛋白染色失败、翻译后修饰导致位置偏移等问题仍存在着一定局限性。 LC-MS/MS则是结合液相色谱不同相态中不同蛋白选择性分配与质谱仪测定离子质荷比（m/z）的原理，进而通过测量离子谱峰强度达到蛋白分析目的，分辨率与鉴定通量较2-DGE均有提高。 随着研究技术不断进步，蛋白质组学能够以高通量模式研究细胞或组织中蛋白质的组成、翻译后修饰和相互作用，不仅广泛运用于与男性和女性配子及衍生的受精卵和胚胎、子宫内膜等结构相关的研究［23］，还有助于阐明复杂生物过程，包括受精、胚胎移植、分化和妊娠［24-25］。HFF蛋白质组的动态变化反映内部和外部环境刺激，卵母细胞、卵丘细胞和卵泡液之间的蛋白质组对话在卵母细胞成熟、胚胎发育潜能及妊娠进程方面起着关键作用。通过分析卵泡液的蛋白质组学特征，将有助于寻找IVF失败背后的真正原因，从而减少重复的无效治疗［26］。 三. 与IVF不良妊娠结局相关的卵泡液蛋白质组学研究进展 我们分别在PubMed、Scopus、Web of Science数据库进行文献检索，所使用检索式为（“Follicular Fluid” AND “Proteogenomic” OR “Proteomics”） AND （“Fertilization In Vitro” OR “In Vitro Fertilization” OR “IVF”）。在与IVF治疗相关的卵泡液蛋白质组学文献中，部分研究涉及IVF最终妊娠结局，而另一部分研究卵泡液中影响卵母细胞状态的关键因子，在蛋白质组学水平上可以提供影响IVF最终结局的间接依据。在最终检索到的6项IVF妊娠结局相关研究中，所收集的样本主要来自接受IVF治疗后不同妊娠结局（妊娠成功或失败或流产）的患者［4，8，22，27］以及接受IVF治疗后不同卵泡受精结果（受精成功或 失败）的患者［28-29］。这些研究试图通过蛋白质组学技术找出卵泡液中决定IVF妊娠结局的有效标志物，或者探究不良妊娠结局的内在机制，从而有助于预测或改善IVF妊娠结局。 1. 补体/凝血/炎症级联 （1）补体级联：尽管一些研究表明补体在胚胎植入过程中有作用［7，30］，补体系统在卵泡液中的作用尚不清楚。补体级联分子如补体3（C3）、补体4b（C4b）、补体9（C9）的表达情况在各卵泡液蛋白质组学研究间存在分歧［8，22，28-29］。Chen等［29］研究表明，补体C3在IVF成功组相比妊娠失败组在卵泡液中表达增加。而另一项研究也表明与未受精的卵母细胞相比，受精卵的HFF中C3更丰富［31］。不仅补体C3存在着低水平的自发激活，而且许多蛋白酶如纤溶酶、凝血酶、弹性蛋白酶和血浆激肽释放酶可以切割和激活C3，从而通过替代途径激活补体系统［22］。随着卵巢进行性衰老，C3水平下降，这提示其对卵母细胞成熟有积极影响［32］。尽管也有研究表明IVF成功受精组中补体C3的表达下降［8］，补体C3可能通过促进卵母细胞成熟来影响IVF妊娠结局。有研究证实C3的衍生物C3b能够促进卵母细胞成熟［33］。补体系统的其他组分（C4、C6、C9、补体因子B和H等）也被发现在IVF成功组卵泡液中上调［4，22］，而C4、C9以及补体因子H可能通过抑制卵巢刺激后的补体激活来维持补体系统稳态。 （2）凝血级联：Shen等［4］在IVF成功妊娠的卵泡液中发现凝血外源途径和内源途径中的成分，提示凝血级联在IVF治疗中的重要作用。通过比较IVF结局成功与失败的蛋白质组学观察到，纤维蛋白原、凝血因子XII、 激肽原-1、凝血酶原、肝素辅助因子-2、维生素K依赖蛋白C等蛋白在IVF成功组中表达明显［8，22，27］，而凝血因子II、α2-抗纤溶酶、纤溶酶原在IVF流产组/未孕组中表达明显［27-29］。Severino等［22］研究显示纤维蛋白原、激肽原-1、凝血酶原和凝血因子XII在成功受精组卵泡液中上调，而3种凝血酶抑制因子抗凝血酶-III、维生素K依赖性蛋白C和肝素辅助因子-2在受精成功组样品中下调，提示排卵后在破裂的卵泡内发生凝血。其中，纤维蛋白原［22，28］、抗凝血酶（AT III）［8，22］在卵泡液中表达情况仍存在争议。有研究表明血栓形成倾向可能与重复的IVF失败相关［34-35］。人卵泡液纤维蛋白原水平已被证实是复发性自然流产的有效诊断指标［7］。Estes等［8］证实失败组卵泡液中抗凝血酶增加，这与以往研究一致。α2-抗纤溶酶是丝氨酸蛋白酶抑制剂，参与纤溶酶原激活的负调节，主要作用于纤溶酶，可能通过卵母细胞未成熟状态影响IVF结局［29］。 （3）炎性细胞因子：Severino等［22］研究显示细胞因子人白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α为急性期反应信号通路中的上游调节因子。而其中IL-6被认为是生殖过程中的重要调节因子，低水平的卵泡能够产生更好的胚胎和IVF更高的成功率［36］。Ostanin等［37］在卵泡液中检测到了广泛的细胞因子，其中卵母细胞较多的患者中IL-2、IL-4、IL-7和粒细胞集落刺激因子（GCSF）的浓度也较高，提示这些细胞因子参与卵母细胞成熟。总之，在临床中有望使用多种经过验证的细胞因子状态参数作为IVF临床疗效的早期诊断指标。 2. 脂质代谢：胆固醇体内稳态和类固醇生成，如维持正常妊娠的生长激素