水稻叶绿素含量的测定改良版
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定绿素含量的绿定叶一、绿绿目的1.了解分光光度绿的工作原理～2.掌握不同型分光光度绿的操作方绿～号3.通绿本绿绿的绿掌握绿素含量绿定的一绿常绿的方法学叶------分光光度法。
二、绿绿原理叶叶体体体叶绿素是脂溶性色素～主要存在于以绿绿首的色素中。
在活中～绿绿素脂蛋白绿合受到绿原系绿的保绿～绿和光是绿定的。
与并氧叶绿素的80%丙绿提取液在波绿663nm～645nm有吸收峰～绿素叶a和绿素叶b 的绿度符合以下公式,C=0.0127A-0.00259A a663645C=0.0229A-0.00467A绿度绿位是,g/Lb645663C=12.7A-2.59Aa663645C=22.9A-4.67A绿度绿位是,mg/Lb645663叶绿素绿绿度绿, C=C+CTab若以绿液中色素含量表示～绿来三、绿器、绿绿和材料1.绿器紫外-可绿分光光度绿、、研体25ml容量、璃漏斗、璃棒、皮绿滴管瓶玻玻2. 绿绿丙绿;分析绿,、85%丙绿、80%丙绿2.材料绿绿、石英砂、酸绿碳四、操作步绿1. 在遮光件下取出等绿绿品～剪碎～混～取绿绿条匀称0.1-0.5g～2. 绿品置于绿～加入少量酸绿和石英砂～加入一定绿的丙绿磨绿绿～再加研内碳体研匀85%丙绿适量绿绿磨至绿绿白色～研3. 绿绿有绿绿的漏斗绿液绿入将匀25ml的容量中～用瓶并80%的丙绿分次洗绿和绿绿清研～最后用80%的丙绿定容。
4. 以80%的丙绿绿比液～在参663和645nm波绿绿绿定吸光绿;A绿在0.2-0.8范绿～内绿度绿大绿用80%丙绿适稀绿,。
当五、绿果绿理按照公式绿算出绿素叶a和绿素叶b的绿度～再绿算出绿素的含量。
叶六、注意事绿1. 在活～绿合绿绿素是绿定的～绿绿一绿破～绿素易被光解。
因此～抽提和绿体内叶坏叶定工作绿可能避光快速完成。
尽2. 绿含有大量酸性液泡的绿品～绿首先加入微性的绿液～仔绿磨后加入丙绿绿行碱冲研抽提。
3. 分光光度绿的精度绿绿定的绿果有至绿重要的影～使用前绿绿器绿行校正。
叶绿素含量测定
实验五食品中叶绿素含量的测定一、试验原理叶绿素含量的多少对植物源食品的色泽有重要的影响，例如绿茶的外形色泽就与叶绿素含量有密切的关系。
叶绿素在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体，当细胞死亡后，叶绿体即被解离，随之叶绿素游离出来。
游离的叶绿素很不稳定，对光、热都较敏感，在酸性条件下很快生成褐色的脱镁叶绿素，加热可使该反应加速。
但在弱碱性条件下叶绿素会被水解为叶绿酸盐、叶绿醇及甲醇。
叶绿酸盐呈鲜绿色，这是一些果蔬产品加工时常用弱碱处理的原因。
高等植物体内叶绿素有a, b两种，二者都易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
叶绿素a, b分别对663nm 和645nm波长的光有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm处。
因此，将食品中叶绿素经适当提取，然后在645nm、663nm和652nm处测其光吸收值，从而求得叶绿素含量。
二、试剂与器材黄瓜丙酮，石英沙容量瓶：100ml烧杯：50ml量筒：10ml滴管，玻璃棒，玻璃漏斗，研钵可见分光光度计三、实验步骤1均匀称取黄瓜样品5g于研钵中，加入少许石英砂（约0.5～1g）和冷丙酮充分研磨后倒入100ml容量瓶中，然后用丙酮分次洗涤研钵并倒入容量瓶中，最后用丙酮定容至100ml。
2充分振摇后用滤纸过滤。
取滤液分别在645nm、652nm和663nm处测其光吸收值。
以95%的丙酮作空白。
3按下式分别计算叶绿素a 和叶绿素b 的含量以及叶绿素总量：结果计算()m V D D 100059.271.12645663⨯⨯⨯-⨯()mV D D 100067.488.22663645⨯⨯⨯-⨯()mV D D 100004.829.20663645⨯⨯⨯+⨯叶绿素a 含量(mg/g 鲜重) =叶绿素b 含量(mg/g 鲜重) =叶绿素总量(mg/g 鲜重) =如果只测定叶绿素总量，则测定652nm 处光吸收值，按下式计算即可：5.341000652⨯⨯⨯m V D 式中：D 645，652，663—表示在所指定波长下，叶绿素提取液的光密度值；V —叶绿素丙酮提取液的最终体积，ml ；m —所用果蔬鲜重，g 。
叶绿体色素的提取分离及含量测定
甄 毓 环境科学与工程学院
一、实验目的
掌握叶绿素的提取、分离和定量测定方法。 熟练掌握分光光度计的使用原理及其方法。
1. 2.
二、实验原理
1. 朗伯—比尔定律
某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即： D = kCL
9
式中：k为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1 cm 时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸 收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。
9
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于 各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。
2. 叶绿体色素的提取及分离
提取：叶绿体色素不易溶于水而易溶于有机溶剂特性--丙酮、 乙醇等有机溶剂提取。
色素分离：纸层析法分离。吸附剂对不同物质的吸附力不 同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动 相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度 不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
3. 定量测定
测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡 萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波 长下的光密度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜 素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。
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以80%丙酮为提取液测定663 nm和645 nm下吸光度即可用下 列公式计算出提取液中各色素的含量。 Ca=12.72D663 - 2.59D645 Cb=22.88D645 - 4.67D663 （ 1） （ 2）
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点样：取前端剪成三角形的滤纸条，用 毛细管取叶绿素提取液，如图点样于 “色 点”处，注意每次所点溶液不可过多，点 样后晾干，再重复操作2～3次。 分离：在大试管中加入推动剂，然后将 滤纸固定于胶塞上，插入试管中，使尖 端浸入溶剂内盖紧胶塞，直立于阴暗处 层析。 当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤 纸，风干，观察色带的分布。
植物叶绿体色素含量的测定
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将上式整理，可以得到下式：
Ca=13.95A665- 6.88A649 Cb=24.96A649 – 7.32 A665 CT= Ca + Cb =18.08A649-6.63 A665 CX.C=(1000A470-2.05Ca-114Cb)/245
植物叶绿体色素含量的测定
植物生理生化实验室
1
高
等 植
叶绿素
物
叶绿素b---C55H70O6N4Mg 叶绿素a---C55H72O5N4Mg
叶
绿 体 类胡萝卜 色 素
胡萝卜素---C40H56 叶黄素---C40H56O2Leabharlann 叶绿素吸收光谱：3
类胡萝卜素吸收光谱：
最大吸收区域在蓝 紫光部分（400-500nm）， 基本上不吸收黄光，
1、叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否 用这一吸收峰波长进行叶绿素ａ、ｂ的定 量分析？为什么？
2、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80 ％的丙酮或乙醇，而新鲜的材料可以用无 水丙酮或乙醇提取？
16
7
叶绿体色素的提取
叶绿体色素，不溶于水，易溶
于乙醇、丙酮等有机溶剂。同时，叶
绿体色素在植物细胞内是以色素蛋白 复合体的结构存在的。故通常用80% 的丙酮或95%乙醇提取叶绿素。
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为什么要用含有水的有机溶剂提取叶片 中的叶绿素？
这是因为叶绿素 分子结构的“头部” 是亲水的，与蛋白质 结合很牢，需要经过 水 溶解作用才可被 提取出来。
从而呈现黄色。
4
蓝光区
红光区
5
叶绿体色素提取液中各色素的吸收光谱虽有 不同，但又存在着明显的重叠，在不分离的情况 下同时测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓 度 ， 可 分 别 测 定 在 663nm 、 645nm （ 分 别 是 叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）和 475nm的光吸收，然后根据Lambert-Beer定 律，计算出提取液中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝 卜素的浓度。
实验5、叶绿体色素的提取及含量测定
思考题
• 1、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮， 而新鲜的材料可以用无水丙酮提取? • 2、叶绿素的提取中加入碳酸钙、石英砂各有什么作 用？ • 3 、叶绿素 a 、 b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一 吸收峰波长进行叶绿素 a 、 b 的定量分析 ? 为什么 ?
实验5 叶绿体色素的提取与含量测定
一、目的
掌握叶绿体色素的提取方法与含量测定方法
二、原理
1、提取原理：叶绿体色素是酯类化合物均不溶
于水，而溶于含有水的有机溶剂，故常用95％
的酒精和80％丙酮提取，或用酒精、丙酮和水
Байду номын сангаас
的混合液提取。叶绿体色素易受光氧化，提取
色素应在弱光中进行，并避光保存色素。新鲜 的叶片可用无水丙酮提取。叶干粉用85％丙酮 提取。
• 四、结果计算 • 求得色素的浓度后再按下式计算组织中各 色素的含量（用每克鲜重或干重所含叶绿 体色素的毫克数表示）： • （ mg/g ）
• [ 注意事项 ] • 1. 为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研 磨时间应尽量短些。 2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在 710 或 750 nm 波长 下测量消光度，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时消 光度值的 5 ％，否则应重新过滤。 • 3. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长 精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差 l nm ， 则叶绿素 a 的测定误差为 2 ％，叶绿素 b 为 19 ％，使用 前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器 说明书外，还应以纯的叶绿素 a 和 b 来校正。4. 在使用 低档型号分光光度计（如： 72 、 125 、 721 型等）测定 叶绿素 a 、 b 含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差， 单色光的纯度低（± 5 ～ 7 nm ），与高中档仪器如岛津 UV-120 、 UV-240 等测定结果相比，叶绿素 a 的测定值 偏低，叶绿素 b 值偏高， a ／ b 比值严重偏小。因此， 使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校 正。
[叶绿素含量测定]叶绿素含量测定
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[叶绿素含量测定]叶绿素含量测定[叶绿素含量测定]叶绿素含量测定篇一 : 叶绿素含量测定叶绿素含量的测定根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即A,aCL。
,)各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2 个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。
在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b的80 ,丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04 和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式:A663=82.04Ca +9.27Cb………………A645=16.75Ca+45.6Cb………………式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值;Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度。
解联立方程、可得以下方程:Ca=0.0127A663-0.00269A645…………Cb=0.0229A645-0.00468A663…………如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，、式则可改写为:Ca=12.7A663-2.69A645…………Cb=22.9A645-4.68A663…………叶绿素总量CT=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663……叶绿素总量也可根据下式求导A652=34.5×CT由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点，两者有相同的比吸收系数，因此也可以在此波长下测定一次吸光度求出叶绿素总量: CT=A652/34.5CT=A652×1000/34.5………因此，可利用、式可分别计算叶绿素a与b含量，利用式或式可计算叶绿素总量。
植物组织叶绿素含量的测定——浸提比色法
植物组织叶绿素含量的测定——浸提比色法叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。
当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离的叶绿素很不稳定，对光、热等较为敏感。
在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。
高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a和叶绿素b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
分光光度法测定叶绿素含量，就是利用叶绿素a和b吸收光谱的不同，测定各特定峰值波长下的光密度，再根据色素分子在该波长下的消光系数计算出浓度。
取植物从上往下数、第二个完全发育的叶子的中部和尖端，放入密封袋，于4℃的冰箱短暂保存，测量相对叶绿素含量。
1. 去除叶片的主叶脉，剪成1mm左右，称取新鲜样品0.1g于25mL刻度管中，加入10mL 95%的乙醇溶液，在黑暗中浸提过夜，直到组织完全漂白；2. 用95%乙醇溶液将提取物(上清液)稀释至15mL(浓度较大时需要稀释，一般0.2g的样品需定容至25mL)，叶绿素测试液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白对照，使用紫外分光光度计在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度；3. 计算公式。
95%乙醇计算公式：C a (mg·L-1) = 13.95A665 - 6.88A649C b (mg·L-1) = 24.96A649 - 7.32A665C T (mg·L-1) = C a + C b = 18.16A649 + 6.63A665C x + c (mg·L-1) = (1000A470 - 2.05C a - 114.8C b)/24580%丙酮Arnon计算公式：C a (mg·L-1) = 12.7A663 - 2.69A645C b (mg·L-1) = 22.9A645 - 4.68A663C T (mg·L-1) = C a + C b = 20.21A645 + 8.02A66380%丙酮Lichtenthaler修正公式：C a (mg·L-1) = 12.21A663 - 2.81A646C b (mg·L-1) = 20.13A646 - 5.03A663C T (mg·L-1) = C a + C b = 17.32A646 + 7.81A663C x + c (mg·L-1) = (1000A470 - 3.27C a - 104C b)/229色素含量(mg·g-1) = (C×V×N)/m × 1000式中：C为色素浓度(mg·L-1)；A为不同波长下的吸光值；V为提取液体积；N为稀释倍数；m为样品质量(g)。
叶片叶绿素的测定
植物叶片叶绿素的测定2014-12-121、目的：测定植物材料叶绿素的含量与组成2、操作2.1（快速）：取叶片0.5g左右与研钵中，加入少许碳酸钙、石英砂，研磨，加入少许80%丙酮或95%酒精，过滤，冲洗，定容50ml。
或者，将叶片放入试管中，加入80%丙酮或95%酒精完全浸没叶片，加胶塞，室温放置24小时，将浸提液转入50ml容量瓶，以溶剂冲洗叶片和试管后收集浸提液，最后定容。
2.2 （简单）：取叶片0.4g左右，记录重量，剪成2-5cm段，放入50ml带盖塑料瓶中，加提取液（80%丙酮或95%乙醇）40ml，使叶片完全浸入液体中，盖严，放入黑暗处，1天后 一次，48小时后，检查叶片是否完全褪绿。
未完全褪绿的，要继续浸泡，已经褪绿的，以分光光度计比色测定。
3、测定，以相应提取剂为对照。
3.1、80%丙酮提取：测定663、645nm下的吸光值Ca（mg/L）=12.72*D663-2.59*D645Cb（mg/L）=22.88*D645-4.68*D663含量mg/g=mg/L*0.05L/0.5g3.2、95%乙醇提取：测定665nm、649nm、470nm下的吸收值Ca（mg/L）=13.95*D665-6.88*D649Cb（mg/L）=24.96*D649-7.32*D665类胡萝卜素Cx =（1000*D470-2.05*Ca-114.8*Cb）/245类胡萝卜素、叶绿素含量mg/g=mg/L*0.04L/0.4g4、注意：一定要有Ca的保护，才能使测定稳定。
附：面粉胡萝卜素（黄色素）的测定：胡萝卜素以水饱和1-butanol室温震荡提取15分钟，14000离心后上清液435nm比色(1 mg of this pigment in 100 mL of watersaturated 1-butanol has an optical density of 1.6632 in a 1-cm)，以β-胡萝卜素表示。
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水稻叶绿素含量的测定
实验原理：根据叶绿素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在特定波长下
测定叶绿素提取物的吸光值，然后利用公式计算出样品中叶绿素的含量。
实验目的：可以检测水稻叶片中叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量。
试剂：
国药试剂（分析纯）
抽提Buffer配制：（体积比）乙醇：丙酮：H2O =4.5：4.5：1
仪器：
分析天平 (Adventurer，USA)
分光光度计DU640 (Backman，USA)
离心机 (Backman, USA)
磨样机
玻璃珠 直径6mm 精密型 淘宝网购买
操作步骤：
1. 取新鲜水稻叶片，擦干后去中脉。
2. 用分析天平称取0.02-0.035g的叶片到2ml离心管中，加一个直径6mm的
玻璃珠，盖紧盖子。
3. 在液氮中冻10min左右，装入液氮预冷的金属底座中，用磨样机打碎，55hz
for 30s。（此磨样机磨样的方法可以用到很多的实验当中，具体参数自己摸
索一下就可以了）
4. 从金属底座中取出样品，立即开盖放掉气化液氮，否则液氮受热会把离心管
炸开，毁掉样品。
5. 每管加入抽提Buffer 1.8ml，室温下避光摇15min。
6. 6000rpm离心30s。
7. 以抽提Buffer为空白，使用紫外分光光度计DU640在波长645和663下测
定叶绿素提取物的吸光值，DU640测量吸光值的量程在0.2-0.8之间，如果
样品太浓，可以稀释。
4. 结果分析：
根据Arnon（1949）法的公式加以修正计算叶绿素含量：
叶绿素a=(12.72A663-2.59A645)×v/w×1000
叶绿素b=(22.88A645-4.67A663)×v/w×1000
叶绿素总含量=(20.29A645+8.05A663)×v/w×1000
注意事项：
1. 为避免叶绿素见光分解，操作时尽量在弱光下进行，速度要快。
2. 样品不宜太多，否则加入抽提Buffer后，2ml离心管会装不下。
3. 若叶绿素抽提物浑浊，则可以短暂离心后测定吸光值，否则会对试验结果造
成误差。