不同年龄大鼠脂肪组织移植后存活率比较研究

不同年龄大鼠脂肪组织移植后存活率比较研究目的：建立不同年龄大鼠来源的脂肪组织注射移植的动物模型，对比观察研究年龄因素对移植脂肪存活的影响，为临床脂肪移植应用提供依据。

方法：取年轻（4周龄）、中年（10月龄）、老年（18月龄）三个年龄组的雌性SD大鼠的皮下脂肪组织，注射移植到同一只SD大鼠（10周龄）的背部皮下，在移植术后24h，48h，72h，96h，5d，7d，14d，4周，8周，分别对脂肪移植物进行超声造影检查，然后取移植物标本，行形态学观察，并制作HE染色、Perilipin免疫荧光染色切片，行组织学观察，比较不同年龄来源的脂肪组织移植后的早期脂肪组织存活情况及远期存活率。

结果：SD大鼠的颗粒脂肪组织在移植后出现从缺血退化到再生的动态组织重塑过程，早期仅有移植物最外层的脂肪细胞存活，随后出现血运重建、脂肪细胞再生等组织重塑过程，最终形成正常脂肪组织样结构。

4周龄组的脂肪组织在移植后3d内存活脂肪细胞数目，移植后1周时脂肪存活区面积比，血流灌注恢复时间，新生的脂肪细胞数量，移植后8周时移植物存活指数明显优于10月龄、18月龄组（P＜0.05）；而10月龄与18月龄组间无明显差异（P>0.05）。

结论：年轻大鼠的脂肪组织在移植后，脂肪组织的早期存活、血运重建、脂肪细胞再生、远期脂肪组织存活率明显优于中、老年组；而中、老年组的脂肪组织在移植后远期存活率较低，且两者间无明显差异。

Abstract：Objective To expore the effect of donor age on the retention of fat grafting in rat modle，so as to supply evidence in clinical cases. Methods Fat grafts were obtained from young，middle-aged and aged（4 weeks，10 months，and 18 months old）female SD rats，and then injected into the back of a 10-week-old female SD rat.Ultrasonography and Contrast-enhanced ultrasound exam were taken on each fat grafts at 24h，48h，72h，96h，5d，1st week，2nd week，4th week and 8th week after operation，to record tissuse reperfusion dynamically，then samples were harvested and analyzed histologically for adipocyte viability，adipocyte regeneration，and fat grafting retention in different groups. Results Fat grafts from all ages underwent dynamic tissue remodeling after grafting，ischemic degeneration at early stage，then regeneration，approaching to normal adipose tissue finally. Fat grafts from 4-week-old SD rats showed signifiantly more vital adipocytes in 72h，larger survival zones at 1st week，and larger engraftment scores at 8th week，more new adipoctyes at 4th week，and more rapid reperfusion rate，respectively，than 10-month-old or 18-month-old SD rats（P＜0.05）.The discrepancy between 10-month-old and 18-month-old SD rats was not significant（P>0.05）. Conclusion Fat grafts from young rats showed better adipocyte survival，regeneration，and final retention，than middle-aged and aged rats.Final fat grafting retention were similarly low in middle-aged and aged rats.Key words：age；fat grafting；retention；tissue remodeling；contrast-enhanced ultrasound（CEUS）自体颗粒脂肪移植因其良好的组织相容性、取材广泛、对机体创伤小、成本相对低廉等优势，被整形美容外科医师越来越广泛地应用于组织填充和重建、修复[1]。

随着抗衰老治疗理念的推广，自体脂肪移植在中老年人群的应用需求显著增加。

然而，虽然整形外科医师已经作出了很多努力来完善和标准化脂肪移植的手术操作流程，但脂肪组织移植后存活率的仍不确定，仍可能出现囊肿、钙化等并发症，使得其临床应用受到限制。

移植脂肪的远期存活率除与手术操作、受区情况相关外，与脂肪来源本身亦存在关联。

对人类皮下脂肪组织的研究发现[2]，在不同年龄阶段，皮下脂肪组织的分布、代谢状态不同。

人类皮下脂肪组织从胚胎发育组织发生后开始增长，至出生后第9个月停止，直至6～8岁又开始。

但青春期后男女脂肪组织增长出现差异，20多岁时女性躯体脂肪稳定增长，而男性停止；老年后则出现皮下脂肪萎缩。

可见，不同年龄机体的皮下脂肪组织代谢活性不同。

那么供体的年龄是否影响移植脂肪的远期存活率？对此目前尚未有明确研究报道。

因此，本实验观察比较不同年龄来源的大鼠脂肪组织注射移植后的存活情况，通过形态学、组织病理学检查、超声学检查等方式研究脂肪组织移植后的动态转归过程，初步探讨年龄因素对移植脂肪存活率的影响及可能机制，以期对脂肪移植在临床应用中的可能出现的问题提供参考依据。

1 材料和方法1.1 实验材料无特定病原体级（SPF级）SD大鼠，雌性，4周龄（70～80g），10周龄（200～220g），10个月龄（400～420g），18个月龄（340～360g），购买于湖北省实验动物研究中心【许可证号SCXK（鄂）2008-0005】。

实验过程中对动物的处置遵守《关于善待实验动物的指导性意见》相关要求。

16G脂肪注射针，彩色多普勒诊断仪（GE，LOGIQ E9，美国），六氟化硫微泡（SonoVue）超声造影剂，兔抗鼠Perilipin多克隆抗体（Santa），Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG抗体（Invitrogen，美国）。

1.2 实验方法1.2.1 建立大鼠颗粒脂肪注射移植的动物模型：根据人类皮下脂肪的代谢活性变化特征[2]，以及人类与大鼠年龄的换算公式[3]，选取大鼠的4周龄、10月龄和18月龄，相当于人类8岁（少年），25岁（中青年），50岁（中老年）三个年龄段，为研究对象。

无菌操作下分别取三个年龄组大鼠的背部皮下的脂肪组织，分别制备成颗粒脂肪后，各取1ml，注射移植到同1只10周龄SD大鼠（受体）的背部皮下，以该大鼠脊柱线及其中垂线为界，将大鼠背部分为四个象限，将三组颗粒脂肪随机移植在其中一个象限，各组间距不少于2cm。

建模（n=36只）成功后，分笼饲养于SPF级动物实验间，自由饮食，每日观察三组移植物的变化，包括移植物的大小、质地、有无出现局部感染、坏死等并发症，并记录。

于移植术后24h，48h，72h，96h，5d，7d，14d，4周，8周，各分别随机选取4只造模成功的大鼠，对三组脂肪移植物进行超声学检查，然后处死大鼠，获取三组脂肪移植物标本行形态学及病理组织学检查。

1.2.2 脂肪移植物的超声学检查：将随机选取的脂肪移植受体大鼠经腹腔麻醉（2%戊巴比妥钠按4mg/kg）后，尾静脉穿刺，留置24G套管针，背部备皮。

麻醉状态下，由华中科技大学附属同济医院超声科医师，对每只大鼠背部的三组移植物，采用彩色多普勒诊断仪分别行超声学检查，检查项目包括：1.2.2.1 观察脂肪移植物，区分其边界，并观察其内部回声，根据回声强度特征判断组织构成，如纤维包膜层，脂肪组织，水肿、可能的坏死、液化、囊性变、钙化等。

1.2.2.2 脂肪移植物超声造影（CEUS）检查：自大鼠尾静脉留置针快速推注六氟化硫微泡造影剂（0.3ml/kg），记录六氟化硫微泡造影剂在移植物内显影至代谢的全过程，并对超声造影图像定量分析。

移植物内造影剂显影区域即为有血流供应、血流灌注恢复的区域，于轴线上测量有造影剂显影区域的厚度，记录造影剂完全充盈的时间。

分别选取移植物整体（a）、移植物内造影剂显影区（b）、移植物中心区（c）、大鼠皮下脂肪组织（d）、无组织区（e）为ROI（感兴趣区Region of interest），绘出时间-强度曲线（time-intensity curve，TIC），对TIC定量分析，记录各ROI的信号强度峰值，达峰时间，并进行比较分析（见图1）。

1.2.3 脂肪移植物的形态学观察1.2.3.1 标本采集：在完成超声学检查后，将麻醉状态下的受体大鼠，俯卧位固定，背部备皮，从皮下层游离掀起背部皮肤，显露三组脂肪移植物，观察其大小、血管长入情况、与周边组织关系等，并拍照记录，然后沿着移植物包膜边缘将其完整切取。

1.2.3.2 形态学观察：对切取的脂肪移植物标本进行形态学的观察和对比。

应用精密电子天平测量移植物重量，每个样本测量三次，取平均值；应用排水法测量移植物样本的体积。

大体标本测得移植物存活率=移植后样本体积/移植前体积。

1.2.4 脂肪移植物的组织学观察：将切取的标本用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，然后沿着标本纵轴制成4?m厚的石蜡切片，分别行HE染色，及perilipin 免疫荧光组织化学染色。

1.2.4.1 HE染色切片的镜下观察：在病理学专家指导下，对以下观察指标评分[4]：①脂肪组织的完整性：指存活的脂肪细胞（直径小于120μm）占整体面积的比例；②坏死的程度：组织坏死所占的面积比；③囊腔和空泡程度：指异常的、破坏融合的脂肪细胞所占面积比；④纤维化程度：纤维结缔组织的面积比；⑤炎症反应强度：炎性细胞浸润的程度；⑥毛细血管计数【个/高倍视野（HPF）】：在低倍显微镜下（×100）下随机选取5个不重叠的视野，然后在高倍显微镜（×400）下分别计数5个视野的毛细血管数，取均值为该片的毛细血管计数。