木瓜蛋白酶水解海洋鱼鳞蛋白的工艺研究

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.12 1484 木瓜蛋白酶水解海洋鱼鳞蛋白的工艺研究

杨丽虹1，吴琴琴1，唐旭2，徐长安2，何建林2 （1.厦门大学海洋系，福建厦门 361005）（2.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门 361005） 摘要：研究了木瓜蛋白酶水解鱼鳞蛋白的单一影响因素，并采用L9(34)正交实验，考察了温度、时间、酶量、底物浓度等因素

对水解鱼鳞蛋白的影响。确定了木瓜蛋白酶水解鱼鳞蛋白工艺条件，即温度65 ℃，时间75 min，酶量0.04 g/g鱼鳞，底物浓度10%，适合规模化生产。 关键词：木瓜蛋白酶；海鱼鳞蛋白；水解 文章篇号：1673-9078(2011)12-1484-1486 Hydrolysis Process of Sea-fish Scale Protein Catalyzed by Papain

YANG Li-hong1, WU Qin-qin1, TANG Xu2, XU Chang-an2, HE Jian-lin2 (1.Department of Oceanography, Xiamen University, Xiamen 361005, China) (2.Third Institute of Oceanography, SOA, Xiamen 361005, China) Abstract: Hydrolysis of the protein from sea-fish scales by papain was studied using orthogonal experiment method. Effects of several factors on hydrolysis were investigated. Based on the research work, the optimum treatment condition was summarized as follows: temperature 65 ℃, hydrolysis time 75 minutes, enzyme 0.04 g/g scale and substrate concentration 10%. The result indicated that the conditions were suitable for large-scale production. Key words: papain; sea-fish scales protein; hydrolysis

改革开放以来，海洋水产品加工方面取得了长足的进步。也产生了占30%的废弃物，其中有10%的左右鱼鳞资源未得到很好利用[1]。鱼鳞中含有丰富的胶原蛋白，是动物体内含量最丰富的蛋白质[2]。具有促进伤口癒合和组织修复的重要功能[3]。同时水解鱼鳞蛋白的主要产物胶原肽，也具有保护胃粘膜、抗溃疡、抑制血压上升，促进骨形成、皮肤胶原代谢等营养及生理功能，在食品及医药等领域具有巨大的开发前景[4]。由于目前，陆生动物资源的生物危险性不断增大，因此，水生动物资源特别是丰富的海洋生物资源越来越受到关注。利用生物酶方法水解鱼鳞比酸碱法条件要温和，效率更高，而且对环境污染小。其酶解产物中含有丰富的小分子肽，更容易被生物体吸收利用，可以有效地缓解细胞衰老，并且有抗菌、抗肿瘤等功效。本文主要探索木瓜蛋白酶酶解海洋鱼鳞蛋白的工艺条件，为进一步开发利用海洋鱼类资源，制造功能性食品发掘新的途径。 1 材料和方法 1.1 实验材料 收稿日期：2011-08-25 基金项目：国家海洋局第三海洋研究所科研基本业务费（海三科2009006） 作者简介：杨丽虹（1989-），女，本科生，海洋化学专业 美国红鱼鱼鳞：购自福建东山，经洗涤、脱脂和脱钙处理后干燥备用；木瓜蛋白酶：南宁庞博生物工程有限公司，酶活力80万U/g。 电子天平：METTLER TOLEDO AL104型；烘箱：上海恒一科学仪器公司，DHG-9240A型；酶标仪：美国分子仪器公司，SpectraMax M5型；pH计：Sartorius PB-10型。 化学试剂购：自汕头西陇化工有限公司。其中碳酸氢钠为食品级其他均为分析纯。 1.2 实验工艺流程 脱脂脱钙鱼鳞→前处理→酶解→灭酶→离心过滤→酶解液 1.3 分析方法[5]

氨基酸态氮：甲醛滴定法；粗蛋白：微量凯氏定氮法；氨基酸显色反应：茚三酮显色法；水解度[6,7]：

以水解液中的肽键数目与原料中总肽键数目的百分数表示，

即：%100DH×=原料总氮水解液氨态氮

1.4 酶解前处理 脱脂、脱钙[8]干鱼鳞称重，在稀碳酸氢钠溶液中

浸泡过夜，然后用清水洗至中性。80 ℃加热5 h预处理。 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.12 1485 1.5 pH对酶解效果的影响 5 g干鱼鳞经预处理后，分别加入不同pH的缓冲液150 mL，缓冲液的pH值分别为5.5、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00。分别加入0.20 g木瓜蛋白酶，于40 ℃酶解1.5 h。反应结束，待溶液冷却后，离心，取上清液测定酸溶性多肽得率。 1.6 温度对酶解效果的影响 取5 g干鱼鳞经预处理后，加50 mL蒸馏水和0.2 g木瓜蛋白酶，调pH值为6.0，分别于40、50、55、60、70 ℃下进行酶解，离心，测定鱼鳞水解后的多肽得率。 1.7 酶解时间对酶解效果的影响 取5 g干鱼鳞经预处理后，加50 mL蒸馏水和0.2 g木瓜蛋白酶，调pH值为6.0，于60 ℃下进行酶解，酶解时间分别为75、90、120、142 min，然后离心，测定鱼鳞水解后的多肽得率。 1.8 酶用量对酶解效果的影响 取5份5 g干鱼鳞经预处理后，加50 mL蒸馏水，调pH值为6.0，于60 ℃进行酶解，酶解时间为90 min，酶量分别为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g，离心，测定水解后的多肽得率。

2 结果与讨论 2.1 pH对鱼鳞酶解的影响 pH对酶解效果的影响见图1

图1 pH对鱼鳞酶解的影响 Fig.1 Effect of pH on fish scale hydrolysis 由图1可以看出，用木瓜蛋白酶酶解鱼鳞蛋白最适pH在6~6.5。随着pH值升高，酶解活力也随之下降。但是由于使用pH缓冲溶液，容易导致不必要的杂质引入，因此最终决定使用pH 6.0的稀盐酸溶液作为酶解溶剂。 2.2 温度对酶解效果的影响 温度对鱼鳞酶解效果的影响见图2。 由图2的结果可以看出，温度对木瓜蛋白酶水解

鱼鳞的影响随着温度的上升也在增大，当温度在60 ℃时，多肽浓度也随之达到最高。之后当温度上升，多肽浓度反而呈下降趋势，此时酶的活性受到抑制。

图2 温度对酶解效果的影响 Fig.2 Effect of temperature on fish scale hydrolysis 2.3 酶解时间对酶解效果的影响 考察了75、90、120、142 min不等的酶解时间，其对酶解效果的影响结果见图3。

图3 酶解时间对酶解效果的影响 Fig.3 Effect of time on fish scale hydrolysis 从图3可以得知，随着酶解时间的增加，最初多肽得率会有所增加，酶解90 min时，多肽浓度达到最高，之后随时间增加而降低。在90 min前，鱼鳞中的大分子不断被分解成多肽，因此随时间增加，多肽浓度变大。当达到90 min时，浓度达到最大值，此后，随酶解时间的增加，多肽浓度下降，这可能是由于副反应增多所致。 2.4 酶用量对酶解效果的影响 在进行了多次酶量实验之后，发现由于鱼鳞本身用量较低，个体差异显现较为明显，导致酶量与多肽浓度的关系曲线趋势不明显。因此改用鱼鳞酶解完成时间来判断最佳酶用量，结果见图4。 由图4可以看出，酶用量为0.08 g/g鱼鳞时酶解速度非常快，但此时该用量很大，成本较高。而0.04 g/g鱼鳞和0.06 g/g鱼鳞的酶解速度相当，从经济角度、反应时间综合考虑，最终选择酶用量为0.04 g/g。 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.12 1486 图4 酶用量对酶解效果的影响 Fig.4 Effect of enzyme amount to fish scale hydrolysis 2.5 正交实验结果 表1 鱼鳞蛋白水解条件因素水平表 Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment L9(34)

水平 A 温度/℃ B 时间/minC 酶量/ (g/g鱼鳞) D 底物 浓度/% 1 55 75 0.03 10 2 60 90 0.04 15 3 65 105 0.05 20 表2 L9(34)正交实验设计与水解度结果 Table 2 Results of orthogonal experiment L9(34)

实验号 A B C D 多肽浓度/(mg/mL)1 1 1 1 1 4.19 2 1 2 2 2 4.20 3 1 3 3 3 4.15 4 2 1 2 3 4.16 5 2 2 3 1 4.20 6 2 3 1 2 4.19 7 3 1 3 2 4.21 8 3 2 1 3 4.15 9 3 3 2 1 4.20 k1 4.181 4.184 4.178 4.194 k2 4.182 4.184 4.187 4.201 k3 4.186 4.181 4.184 4.154 R 0.005 0.003 0.009 0.047 在酶解鱼鳞蛋白工艺中，有诸多影响相互制约、

相互依赖。经过初步实验，选定温度、时间、酶量以及底物浓度为主要影响因素，pH设定为6.0。通过L9(34)

正交实验，确定鱼鳞蛋白水解最佳工艺条件。具体影响因素和实验水平见表1。 从表2实验结果可知，对酶解效果影响程度大小顺序为：D＞C＞A＞B，即：底物浓度＞酶量＞温度＞时间。经综合考虑，最终确定了木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为A3B1C2D1，即：酶解温度65 ℃；酶解时

间75 min；酶解时pH 6.0；底物浓度10%；酶量0.04 g/g鱼鳞。在上述确定的实验条件下，做两份平行实验，最终得到在此条件下的多肽含量可以达到4.35。

4 结论 鱼鳞蛋白经过加热预处理后，可被木瓜蛋白酶较好地水解。经实验优化选出较好的水解条件为：酶解温度65 ℃；酶解时间75 min；酶解时pH 6.0；底物浓度10%；酶量0.04 g/g鱼鳞，此时的水解度可以达到4.35。与文献报道[7]的结果相比，酶解时间缩短、