α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法

2.2实验方法

2.2.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法

2.2.1.1 反应溶液的制备

（1）配制底物PNPG溶液：精确称取 0.3766gPNPG，加适量0.1mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶准确定容到50mL，配制成25mmol/L的母液。将母液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7个不同梯度的标准品溶液，备用。

（2）配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/mg）用0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。

（3）配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取 0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000μg/mL DNJ标准母液。将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60μg/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。

（6）0.2mol/L的 Na2CO3：称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。

2.2.1.2 PNP标准曲线的绘制

精确称取0.0278g对硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100μmol/L的标准溶液。取100μl上述标准液，各加入150μL 0.2mol/L的Na2CO3，混匀 1 min ，再于405 nm处测定其吸光度，得标准曲线方程：y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998)，其中y 为浓度，x为吸光值。

2.2.1.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

测定方法参照Masao Hattori等试验条件，并做调整。实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按表中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。按表依次加入PBS缓冲液、抑制剂溶液和底物，混合均匀，于37℃水浴保温10min，结束后，取出，加入37℃水浴的酶溶液，充分混匀，于37℃水浴反应20min，结束后加入150μL 0.2mol/L的Na2CO3溶液中止反应。由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP，PNP在405nm处有最大吸收，其测定其吸光度，根据公式便可计算出各样品α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50值。

2 %100AAAAAA%BCSBSBC抑制率公式

表 4 各反应物添加计量和顺序（单位：μL）

Table 4 The respective reactants add measurement and sequence ( Unit: μL )

试剂空白组对照组样品空白组样品组

PBS溶液 80 70 60 50

抑制剂 0 0 20 20

PNPG底物 20 20 20 20

充分混匀，37℃下孵化10min

酶溶液 0 10 0 10

充分混匀，37℃下反应20min

碳酸钠 150 150 150

150

2.2.2单因素试验设计

以底物浓度、酶浓度、酶促反应时间和添加顺序为考察因素，以DNJ的α-葡萄糖苷酶抑制率为衡量指标，进行单因素试验。固定反应顺序为抑制剂+酶再加底物、底物浓度为2.0mmol/L，酶浓度0.3u/mL，缓冲液pH为6.80，反应时间为20min。

2.2.2.1反应物添加顺序

分别考察如下三种不同的反应顺序对抑制活性的影响。

a、抑制剂+底物→37℃温育10min→+酶，反应20min→碳酸钠终止反应→测定

b、抑制剂+酶→37℃温育10min→+底物，反应20min→碳酸钠终止反应→测定

c、底物+酶→37℃温育10min→+抑制剂，反应20min→碳酸钠终止反应→测定

2.2.2.2 底物浓度

选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察0.5、1.0、2.0、4.0、5.0mmol/L这5个不同梯度的底物对抑制活性的影响。

2.2.2.3酶浓度

选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察0.1、0.3、0.5、0.7、0.9u/mL5个不同浓度的酶对抑制活性的影响。

2.2.2.4缓冲液pH

选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，分别考察不同pH6.6、6.8、7.0、7.2和7.4的缓冲液对抑制活性的影响。

3 2.2.2.5 反应时间

选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察10、20、30、40和50min不同反应时间对抑制活性的影响。

参考文献

[1] Ma C M, Hattori M, Daneshtalab M, et al. Chlorogenic acid derivatives with alkyl chains of different

lengths and orientations: potent alpha-glucosidase inhibitors[J]. J Med Chem, 2008,51(19):6188-6194.

合集下载

α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展

厦门市第一医院(361003)　张文婷　综述　方青枝　审校

【中图分类号】R97711+5　【文献标识码】A　【文章编号】100222600(2009)0220085203

糖尿病是一种多病因引起、以高血糖为特征的内分泌代

谢紊乱性疾病。高血糖是由胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗,

或二者共同存在而引起。世界上,糖尿病患者已超过117

亿,已成为继心血管疾病和肿瘤之后第三大严重威胁人类健

康的非传染性疾病[1]。临床上,根据糖尿病发病机制不同,

主要分为1型糖尿病(胰岛素依赖型)和2型糖尿病(非胰

岛素依赖型),我国以2型居多。治疗2型糖尿病的药物主

要分为:(1)胰岛素及类似物:如赖脯胰岛素等;(2)促胰

岛素分泌剂:如磺酰脲类;(3)胰岛素增敏剂:如噻唑烷类

衍生物;(4)α2葡萄糖苷酶抑制剂:如阿卡波糖等。本文就

α2葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展作一综述。

1　α2葡萄糖苷酶抑制剂的作用机制

α2葡萄糖苷酶主要由唾液和胰液中α2淀粉酶及小肠刷状

缘上皮细胞上的麦芽糖酶、异麦芽糖酶、α2临界糊精酶、蔗

糖酶和乳糖酶等组成。食物中的碳水化合物,如淀粉先经α2

淀粉酶水解成麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖和α2临界糊精

等,食物在口腔中停留时间短,所以该过程主要在小肠内进

行。而后,寡糖经小肠刷状缘上皮细胞上各种酶的作用生成

葡萄糖及其他单糖,经小肠黏膜细胞吸收而被机体利用。

2型糖尿病患者因胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗或二者

的共同作用,血液中的葡萄糖进入肝、肌肉和脂肪等组织细

胞及在细胞内的氧化利用发生障碍,同时,肝糖输出增多导

致高血糖。由于血糖水平超过肾小管吸收葡萄糖的能力,部

分血糖随尿排出而形成糖尿病。因此,可以通过降低α2葡萄

杨桃不同部位提取物抑制α-葡萄糖苷酶的作用

- 36 - 杨桃不同部位提取物抑制α-葡萄糖苷酶的作用廖彭莹李承曼黄志祥杨小妹唐丽娟（广西中医药大学，广西南宁 530001）【摘要】目的：比较杨桃根、叶和果实三个部位不同极性溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。方法：建立高效液相色谱法测定体外抑制α-葡萄糖苷酶作用，对杨桃不同部位提取物的抑制作用进行评价筛选。结果：同等质量浓度下，杨桃根各提取物均对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，杨桃叶乙醇冷浸提取物的抑制活性较强，而杨桃果实各提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用较差。结论：杨桃根各提取物对α-葡萄糖苷酶均有较强抑制作用，其作为α-葡萄糖苷酶抑制剂具有潜在开发价值。【关键词】杨桃；α-葡萄糖苷酶；抑制作用【中图分类号】R284.2 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1151(2018)10-0036-02 α-Glucosidase Inhibitory Activities of the Extracts from Different Parts of Averrhoa Carambola Abstracts: Objectives: To study α-glucosidase inhibitory activities of the extracts from the roots, leaves and fruits part of Averrhoa carambola using different polar solvent. Methods: By establishing high-performance liquid chromatography method to evaluate α-glucosidase inhibitory activities in vitro, the activities of the extracts from different parts of Averrhoa carambola were screened. Results: All of the extracts from the root part of Averrhoa carambola showed inhibitory activities against α-glucosidase. The ethanol extracts obtained under room temperature showed stronger inhibitory activities of α-glucosidase. The extracts from fruit part showed very weak inhibitory activities against α-glucosidase. Conclusions: All of the extracts from the root part of Averrhoa carambola showed inhibitory activities against α-glucosidase, which showed a potent value to develop as α-glucosidase inhibitors. Key words: Averrhoa Carambola; α-glucosidase; inhibitory activities α-葡萄糖苷酶抑制剂是临床上治疗II 型糖尿病的主要药物之一，可减缓葡萄糖的生成和吸收，降低血糖水平[1]。天然药物中已经筛选出大量具有α-葡葡萄糖苷酶抑制活性的成分，种类繁多、结构复杂[2]。杨桃（Averrhoa carambola），又名阳桃、五敛子、三廉子等，是一种产于热带、亚热带的植物，广泛分布在广西、广东、云南及台湾地区，《中华本草》记载其叶祛风利湿、清热解毒，果实消热生津、利尿解毒，根祛风除湿、行气止痛、涩精止带[3]。药理学研究表明，杨桃部分部位提取物有降血糖效果，如杨桃根多糖有降血糖[4]和抗氧化活性[5]，杨桃根乙醇提取物和水提取物有降血糖活性[6]，此外杨桃叶总黄酮也有降血糖活性[7,8]。从杨桃根中已经获得2个活性单体2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2，5-diene-1，4-dione[9]和Lyoniresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside[10]，降糖效果显著。杨桃不同部位提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性研究未见国内（外）相关报道。本研究应用石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇和水对杨桃根、叶、果不同部位进行提取，建立高效液相色谱法评价所得提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，从新的角度探讨了杨桃提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发价值，可为该资源的深度利用研究提供相关依据。 1 材料与仪器 1.1 材料杨桃根、叶和果实均采于广西壮族自治区南宁市，经广西中医药大学朱意麟实验师鉴定，分别为酢浆草科五敛子属植物杨桃（Averrhoa carambola L.）的根、叶和果实，药材均经自然阴干后粉碎。 α-Glucosidase（α-葡萄糖苷酶）、4-Nitrphtnyl-α-D- glucopyranoside（4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷，纯度99%，pNPG）均购于Sigma公司；Acarbose（阿卡波糖）购于阿拉丁生化科技股份有限公司；石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、超纯水、乙腈、无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等其他化学试剂，总第20卷230期大众科技 Vol.20 No.10 2018年10月 Popular Science & Technology October 2018

苦苣菜α-葡萄糖苷酶的抑制活性

江正样

【期刊名称】《科技资讯》

【年(卷),期】2010(000)029

【摘要】采用索氏提取法提取苦苣策全草,以96微孔板法测定苦苣菜不同极性提取物体外α-葡萄苷糖苷酶掏作用,并与阳性对照Acarbose进行比较,发现苦苣菜石油醚和乙酸乙酯提取物均有较好的α-葡萄糖苷酶抑制作用.苦苣菜的石油醚提取物的抑制效果最好(IC50=33.25μg·mL-1).其次为乙酸乙酯提取物(IC50=1909.14,1μg·mL-1).石油醚提取物远远大于阳性对照Acarbose(IC50=1103.01μg·mL-1)的抑制活性.不同溶剂的提取物比较,苦苣莱石油醚提取物对时α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果很好,具有良好的潜在开发价值.

【总页数】3页(P220-222)

【作者】江正样

【作者单位】上海现代哈森(商丘)药业有限公司,河南商丘,476000

【正文语种】中文

【中图分类】Q55

【相关文献】

1.五种苦苣苔科植物α-葡萄糖苷酶抑制活性研究 [J], 康文艺;张丽

2.裙带菜α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的制备 [J], 李艳敏;郁书怀;仝艳军;杨瑞金;赵伟

3.睡菜环烯醚萜苷类成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性 [J], 陈静文;林芳;金冠;何芷芸;张志麒;刘呈雄;陈剑锋;邹坤;程凡

4.黔产五种卷柏黄酮含量测定及其对α-葡萄糖苷酶抑制活性研究 [J], 晏英;王丹;陈洁;唐攀;陈文章;廖伟科;杨小生

5.芋头球蛋白的提取纯化及其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究 [J], 马二兰;林莹;涂连;张帆;王伟良

因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买

青稞麸皮提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究及成分分析

※成分分析食品科学 2017, Vol.38, No.06 179

青稞麸皮提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性

研究及成分分析

龚凌霄1，曹文燕1，张英2，张慧娟1，刘英丽1，王静1,*

（1.北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310027）

摘要：研究青稞麸皮的正己烷、乙酸乙酯和甲醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明，3 种不同极性的提取物均显示抑制效果，其中正己烷提取物和乙酸乙酯提取物的抑制活性强于市售α-葡萄糖苷酶抑制剂——阿卡波

糖。进一步采用气相色谱-质谱联用法对正己烷提取物中脂肪酸、不皂化物、甾醇进行定性定量分析。正己烷提取

物中的脂肪酸主要为亚油酸、油酸、棕榈酸、α-亚麻酸，占总脂肪酸的96.5%，这几种脂肪酸被证实对α-葡萄糖苷

酶具有混合型抑制的活性。从不皂化物中分离得65 个质谱峰，鉴定出甾醇类、三萜类、高分子脂肪醇等生物活性

成分。同时对已鉴定的几种主要游离甾醇进行含量分析，结果显示β-谷甾醇和菜油甾醇为主要甾醇，两者共占总

游离甾醇的83%，提取物中的甾醇、三萜类对α-葡萄糖苷酶抑制活性可能有一定贡献。由此可见，青稞麸皮是筛选 α-葡萄糖苷酶抑制剂的优质天然资源。

关键词：青稞麸皮；α-葡萄糖苷酶抑制剂；气相色谱-质谱联用；脂肪酸；不皂化物

Anti-α-Glucosidase Activities and Bioactive Components of Tibetan Hull-Less Barley Bran Extracts

GONG Lingxiao1, CAO Wenyan1, ZHANG Ying2, ZHANG Huijuan1, LIU Yingli1, WANG Jing1,*

(1. Beijing Innovation Center of Food Nutrition and Human Health, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

银合欢种子总黄酮对小鼠小肠α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用研究

。５６。　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇ￣Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　２００９，Ｖｏ１．１２　Ｎｏ．１　

银合欢种子总黄酮对小鼠小肠　一葡萄糖苷酶　

‘活性的抑制作用研究　

廖冬燕，覃振林，李学坚　

（广西中医学院，广西南宁５３０００１）　

摘要：［目的］研究银合欢种子总黄酮（ＴＦ）对实验性糖尿病小鼠小肠　葡萄糖苷酶活性的抑制作用。［方法］，Ｊ、鼠腹腔　

注射链脲佐茵素制作成实验性糖尿病小鼠模型。以蔗糖和麦芽糖为反应底物，测定小鼠小肠　葡萄糖苷酶催化生成葡萄糖　

的量，计算出银合欢种子总黄酮对小鼠小肠ａ一葡萄糖苷酶的抑制率。［结果］１、Ｆ对糖尿病小鼠小肠ａ一葡萄糖苷酶活性具有抑　

制作用，并呈剂量效应关系；对蔗糖酶和麦芽糖酶的半数抑制浓度（ＩＣ５０）分别为１７８、３１５　ｔ￣ｇ／ｍｌ。［结论］ＴＦ具有抑制糖尿病　小鼠小肠粘膜　葡萄糖苷酶作用。　

关键词：银合欢；总黄酮；ａ一葡萄糖苷酶；实验研究　

中图分类号：Ｒ２８５．５文献标识码：Ａ文章编号：１００８—７４８６｛２００９）０１—００５６—０２　

糖苷酶是生命体正常运转的必需酶，也是糖尿病、艾滋　

病、癌症等许多疾病的相关酶。抑制糖苷酶的活性，已成为　药物筛选研究领域的热点…。银合欢Ｌｅｕｃａｅｎａ　ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ　

（Ｌａｍ．）ｄｅ　Ｗａｉｔ为多年生豆科木本植物，文献Ｌ２ｊ记载银合欢　

种子可用于治疗糖尿病；笔者的研究表明，银合欢种子的总　

黄酮（ＴＦ，ｔｏｔａ　ｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｌｅｕｃａｅｎａ　Ｓｅｅｄｓ）具有降血糖作　用＿３　Ｊ。为了进一步探讨ＴＦ的降血糖作用机制，我们通过体　

外实验研究ＴＦ对实验性糖尿病小鼠小肠粘膜ａ一葡萄糖苷酶　

的抑制作用，结果报道如下。　

１实验材料　

１．１实验动物ＮＩＨ种小鼠，体重２０～２５　ｇ，雄性，广西中　

医学院实验动物中心提供，动物合格证：桂医动字第１１００４　号。　

α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选方法的研究

生物工程　食品研究与开发　

Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｏｍｅｎｔ　２０１２年８月　第３３卷第８期　ｌ　７１　

一葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选方法的研究　

朱文佳１，寇自农２，张曦　，付绍平　，朱靖博ｌＩ　，，萧伟　ｌ４　

（１．大连工业大学食品学院，植物资源化学与应用研究所，辽宁大连１１６０３４；２．大连工业大学现代教育技术部，辽　

宁大连１１６０３４；３．中药制药过程新技术国家重点实验室（筹），江苏连云港２２２００１；４．江苏康缘药业股份有限公　

司。江苏连云港２２２００１）　

摘要：以对一硝基苯一　一Ｄ一吡喃葡萄糖苷为底物，通过高效液相色谱定量分析水解产物对一硝基苯酚，确定ＯＬ一葡萄　糖苷酶的活性，建立新的　一葡萄糖苷酶抑制剂的体外筛选方法，为了提高筛选方法的灵敏度，对酶促反应条件进行　

了优化，并用阿卡波糖验证筛选方法的可靠性，结果测得阿卡波糖的ＩＣ　为２．０７ｍｇ／ｍＬ，与文献报道相近，说明该法　可替代传统的Ｔｒｅｍｂｌｙ法，并可用于　一葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选。　关键词：　一葡萄糖苷酶抑制剂；高效液相色谱；筛选模型；糖尿病；酶动力学　

Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ仅一ｇｌｕｃＯｓｉｄａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　

ＺＨＵ　Ｗｅｎ－ｊｉａ　，ＫＯＵ　Ｚｉ—ｎｏｎｇ。，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉ　，ＦＵ　Ｓｈａｏ－ｐｉｎｇ　，ＺＨＵ　Ｊｉｎｇ－ｂｏ。，　，ＸＩＡＯ　Ｗｅｉ　’　

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ　Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ　

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ　１　１６０３４，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．Ｍｏｄｅｒｎ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｂｒａｎｃｈ，Ｄａｌｉａｎ　Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　

纸色谱法用于α-葡萄糖苷酶抑制动力学跟踪的研究

检测分析　ｌｌｌ　０　ｌｌ　｜　＿＿　２ｏｏ６．ｖｏ｜２７．Ｎｏ．８　

纸色谱法用于　一葡萄糖苷酶　

抑制动力学跟踪的研究　

马庆一，陈丽华，李娜　

（郑州轻工业学院食品与生物工程系，河南郑州４５０００２）　Ｊ『　＿－一一　

摘要：将纸色谱测定微量葡萄糖的方法移植到ｄ一葡萄糖苷酶活性测定及其抑制动力学筛选跟踪，优化了以麦芽糖　为底物的反应条件，并以甘草　一葡萄糖苷酶抑制剂筛选为例证实了该法的可行性。试验结果表明：１）酶反应最佳条件：　底物浓度１０ｍｇ／ｍＬ、酶用量为１００　Ｌ、反应时间８　ｈ；２）纸色谱法测定微量葡萄糖最佳条件：．占、样量７０　Ｌ、展开体系正　丁醇一丙酮～水（２：７：１）、展开方向为径向、比色波长为３６５　Ｄｍ；３）甘草水提物及其多糖、皂甙、黄酮组分均为ｄ一葡萄　糖苷酶抑制剂，其中水提物和黄酮组分抑制效果较好。该法堪为传统Ｔｒｅｍｂｌｙ法的可靠替代，尤其是在天然植物色素　难以脱除，严重干扰比色时更是如此。　关键词：糖尿病；ｄ一葡萄糖苷酶；纸色谱；甘草；抑制剂　

ＡＰＰＬ　Ｙｌ　Ｇ　ＯＦ　ＰＡＰＥＲ　ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ　ＭＥＴＨＯＤ　ＴＯ　ＴＨＥ　ＭＯＮｌ　ｌｌ【ＪＲｌ　Ｇ　ＯＦ　ＯＬ—ＧＬＵＣＯＳＩＤＡＳＥ　ＩＮＨＩＢＩＴ１０Ｎ　ＫＩＮＥＴＩＣＳ　

ＭＡ　Ｑｉｎｇ－ｙｉ，ＣＨＥＮ　Ｌｉ－ｈｕａ，ＬＩ　Ｎａ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｉｇｈｔ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　４５０００２，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｐｅｒ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ａ　ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　

ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ＯＬ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉ—　ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｏｆ　ｍａｈｏｓｅ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　

知母中α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取及性质研究

ＮＱ．４　Ｖ０１．２８　陕西科技大学学报　Ｊ（）ＵＲＮＡＩ　ＯＦ　ＳＨＡＡＮＸＩ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　Ａｕｇ．２０１０　・４１・　

文章编号：１０００—５８１１（２０１０）０４—００４１—０４　

知母中．）【一葡萄糖苷酶抑制剂的提取及性质研究　

杨秀芳，陈　梅，闫倩茹　

（１．教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室，陕西科技大学化学与化工学院，陕西西安７１００２１）　

摘　要：研究了从知母中提取分离口一葡萄糖苷酶抑制剂．将水提物用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇　

萃取，测定了各部分的酶抑制活性，并对活性最强部分进行了酶抑制的动力学研究．结果表明：　

抑制剂ＨＧＩ热稳定性好，ｐＨ适应范围广，表现为一种既能快速结合，又能产生较强抑制效果　的竞争性抑制类型，Ｋ　一３．８６　ｍｇ／Ｌ．　

关键词：ａ一葡萄糖苷酶；抑制荆；分离纯化；竞争性抑制；知母　中图法分类号：ＴＱ４６Ｏ，６：Ｒ９２７．１　文献标识码：Ａ　

０　引言　

糖尿病是一种常见的有遗传倾向的内分泌系统疾病，预防和治疗糖尿病目前已成为医学界十分关注　

的课题［１。］．ａ一葡萄糖苷酶在机体的许多代谢过程中起着关键的作用，并与许多因代谢紊乱失调而引发的　

疾病有密切关系，如糖尿病、癌症、病毒感染等［３］．因此，人们试图寻找合适的抑制剂用于控制和调节ａ一葡　

萄糖苷酶的活性，以期对有关疾病进行防治．目前研制的此类抑制剂有些已成为治疗糖尿病的新药，我国　

传统中医学治疗糖尿病已有２　０００多年的历史，近年来国家确认了一批具有降血糖活性的中药，为筛选ａ一　

葡萄糖苷酶抑制剂类药物提供了良好的背景．　

知母为百合科植物知母Ａｎｅｍａｒｒｈｅｎａ　ａｓｐｈｏｄｅｌｏｉｄｅｓ　Ｂｇｅ．的干燥根茎，现代药理研究结果表明知母　具有清热泻火、生津润燥等功效［４］．有研究报道知母水提物亦具有一定的ａ一葡萄糖苷酶抑制剂作用［５］．在　

前人筛选工作的基础上，作者进一步研究了知母总水提物的ａ一葡萄糖苷酶抑制作用，旨在从中提取分离出　

糖苷酶实验指导

α-糖苷酶抑制剂抑制活性测定

实验原理：

食物中的淀粉（多糖）经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖（或称寡糖）以及双糖与三糖，进入小肠经α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖，为小肠吸收。在生理状态下，小肠上，中、下三段均存在 α- 葡萄糖苷酶，在服用α- 葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制, 而糖的吸收仅在中、下段，故吸收面积减少，吸收时间后延，从而对降低餐后高血糖有益, 在长期使用后亦可降低空腹血糖, 估计与提高胰岛素敏感性有关。

对硝基苯-α-D-葡萄糖苷（pNPG）经α-葡萄糖苷酶水解可产生对硝基苯酚，其在405nm呈特异性吸收，因此可以通过检测对硝基苯酚的生成量检测α-葡萄糖苷酶的活性。

仪器与试剂

缓冲液：0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）--每100ml中1mol/l磷酸氢二钠4.6 ml，1mol/l磷酸二氢钠5.4 ml。

酵母α-葡萄糖苷酶：将100U/ml酶原液用0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）稀释为1U/ml的酶溶液，冷冻备用。

底物pNPG配制：2mM的pNPG溶解于0.1M的磷酸钠缓冲液中。

阿卡波糖抑制剂配制：200μg/ml溶于0.1M的磷酸钠缓冲液中。

实验内容

1. 分组：空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、阳性对照组空白、待测样品大、中、小剂量组、待测样品组空白

空白对照： 170μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG

阴性对照组：10μl酶溶液+160μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG

阳性对照：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂+30μl 2mM的pNPG

阳性对照空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂

待测样品组：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl待测样品+30μl 2mM的pNPG

待测样品空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl待测样品

2. 实验步骤 96孔酶标板上依次加入除底物外的所有反应液，37℃温浴10分钟，然后迅速加入底物,并测定反应初始吸光值（405nm）；之后，用塑料膜密封酶标板，37℃保温，每隔15分钟测定一次吸光值，以吸光值对时间做反应曲线。