(完整版)ABO血型鉴定正反定型试验方法
ABO血型的鉴定
反向定型 标准红细胞+被检查血清
A型红细胞 _ + _ + B型红细胞 + _ _ + C型红细胞 _ _ _ _
结果判断
A型 B型 AB型 O型
鉴定方法及评价
1、生理盐水凝集法； 2、微柱凝胶法； 3、血型定型试剂卡法。
1、生理盐水凝集法
2、微柱凝胶法
• 一种新的免疫学检测方法 • 采用单克隆抗体 • 结果可直接观察，也可用血型分析仪 • 灵敏度高
3、血型定型试剂卡法
• 利用免疫检测和分子排阻层析原理 • 能同时进行正反向定型和Rh（D）血型鉴定 • 结果重复性好
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ABO血型的鉴定
ABO血型鉴定的原理
• ABO血型鉴定主要利用抗原与抗体之间的反
应来完成，包括正向定型和反向定型，正 向定型是用已知特异性抗体（标准血清） 检查红细胞上的未知抗原，反之反向定型 是利用已知血型的标准红细胞检查血清中 的未知抗体。
ABO血型正向、反向鉴定及结果判断
正向定型 标准血清+被检查红细胞
• 是临床最常用的方法 • 可以用试管法和玻片法测定 • 玻片法不适用于反定型 • 标准血清来源有两种途径
人血清ABO血型抗体
• 高度特异性； • 高效价； • 高亲和力； • 无冷凝集素； • 无菌。
人ABO血型单克隆抗体
• 来源； • 特异性； • 亲和性； • 效价； • 稳定性； • 无菌； • 灭活补体。
ABO 血型鉴定操作规程
1.0 原理ABO 血型鉴定操作规程2.03.04.05.0 5.1 5.26.0 6.16.2 6.36.4 6.5 6.66.77.0 7.1 根据红细胞上和血清（或血浆）中有无 A 抗原和（或）B 抗原及其抗体，将血型分为A 型、B 型、AB 型及 O 型。
可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型鉴定 ABO 血型。
正定型正定是指用已知抗-A、抗-B 血清来检测受检红细胞上有无相应的 A 抗原和（或）B 抗原；反定型反定是指用已知 A1型、B 型红细胞来检测受检血清（或血浆）中有无相应的抗-A 和（或）抗-B。
原始样品要求5 mL 静脉全血。
样品容器和添加剂真空试管，EDTA.K2抗凝/普通试管，不抗凝。
检测环境要求温度：18℃～27℃，湿度：30%～70%。
所需材料和设备设备普通离心机、免疫血液学离心机、显微镜、恒温水箱、定时器。
材料抗-A、抗-B 血清、ABO 标准抗原红细胞试剂、移液器、加样吸头、生理盐水（NS）、干净空试管。
检测操作过程将受检标本以 1000g 离心 5min，使标本血浆/血清与红细胞分离，吸取红细胞，用 NS洗涤三次后，配成 3%～5%红细胞悬液。
取 6 支小试管，分别标记“-A”、“-B”、“自身”、“Ac”、“Bc”、“Oc”。
在“-A”、“-B”管中分别加入抗-A 和抗-B 血清各 50 L ，其余管加入受检血浆/血清各100 L 。
在“-A”、“-B”、“自身”管中加入受检者 3%～5%红细胞悬液各 50 L ，摇匀。
在“Ac”、“Bc”、“Oc”管中分别加入 A1、B、O 红细胞试剂各 50 L ，摇匀。
1000g 离心 15sec，轻轻悬浮红细胞，观察结果并记录。
根据实验需要，除室温下观察结果外，另可增加在 4℃、37℃下观察结果。
结果判断凝集强度判断标准见表 1。
表1 凝集强度判断标准表凝集强度4+3+2+1+±-或θMFpHH判断标准红细胞凝集成一大块，液体背景透明，无游离红细胞数个大凝集块，液体背景透明，无游离红细胞有很多小凝集块，液体背景透明，无游离红细胞有许多很小的凝集块，肉眼可见，液体背景不透明，有游离红细胞微小的凝集块，肉眼很难看清，需要用显微镜观察无凝集，无溶血，全是游离红细胞混合凝集外观，镜下可见少数红细胞凝集，而大部分是游离红细胞部分溶血完全溶血7.2 ABO 血型结果判断见表2：正定型抗-A 血清血抗-B 血清血Ac表 2 2 血型结果判断表反定型定Bc Oc自身对照血型＋――＋―＋―＋―＋＋―＋―＋―――――――――ABOAB7.37.48.09.010.0注：“＋”表示凝集或溶血；“―”表示不凝集。
ABO血型正 反定型
ABO血型正、反定型操作规程[目的]保证ABO血型鉴定准确，确保临床输血安全。
[适用范围]XXX医院输血科[职责]具有专业技术的工作人员主要负责本院输血（或备血）标本的ABO血型鉴定（但只对该单份标本负责）。
[相关文件]试剂采购、保存和使用管理程序设备采购、使用管理程序消毒与清洁管理程序标本采集、运输、保存和报废管理程序紧急用血管理程序[相关记录]仪器设备的采购、使用和维护记录仪器的温度记录恒温水温箱的换水和消毒记录消毒液的配置记录清洁消毒记录试剂采购、使用记录标本交接和报废记录紧急用血记录[实验原理]ABO血型是根据红细胞表面存在的凝集原决定的。
存在A凝集原的称为A型，存在B凝集原的称为B型。
而血清中还存在凝集素。
当A凝集原与抗A凝集素相遇或B凝集原与抗B凝集素相遇时，会发生红细胞凝集反应。
一般A型血清中含有抗B凝集素，B型血清中含有抗A凝集素，因此可以用标准血清中的凝集素与被测者的红细胞反应（称为正定型），用标准红细胞与被测者血清中的凝集素反应（称为反定型），以确定其ABO血型。
[仪器器械]玻璃试管、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、普通离心机、试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。
[试剂]抗A标准血清、抗B标准血清、A型标准红细胞、B型标准红细胞、O型标准红细胞、生理盐水。
以上试剂均为有合格证件的正品。
[标本收集与处理]1．受检者血清：采集受检者静脉血2~3ml，经1000r/min离心1分钟或室温静置1小时后取上清。
2．2~5%的受检者红细胞：采集受检者静脉血或末梢血，用生理盐水制成2~5％红细胞盐水悬液备用，制备方法见本节质量控制和注意事项。
3．标本出现中度以上溶血者，为不合格标本，不能用于检测。
[实验方法与步骤]血型的正定型（试管法）：⑴、取2支试管，分别标上抗A 和抗B ；⑵、制备待测标本2~5%的红细胞悬液（取1支试管，加入2ml 生理盐水，再加入1滴待测标本红细胞，混匀备用）；⑶、在抗A 管中加入2滴抗A 标准血清，在抗B 管中加入2滴抗B 标准血清；⑷、在抗A 和抗B 管中分别加入1滴已制备好的待测标本2~5%红细胞悬液； ⑸、混匀后，立即对称放入离心机中进行1000r/min 离心1分钟，或室温静置1小时，再轻轻摇动试管，使沉于管底的红细胞浮起，先肉眼观察有无凝集现象，如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。
试管法鉴定ABO和RhD血型标准操作规程
试管法鉴定ABO和RhD血型标准操作规程一、目的为规范ABO和RhD血型鉴定的技术操作，保证鉴定结果准确及临床输血安全有效。
二、适用范围适用于试管法进行ABO和RhD血型鉴定。
三、原理1、单克隆抗-A、抗-B试剂与受检者红细胞反应作为正定型，A、B、O型试剂红细胞与受检者血清（血浆）反应作为反定型，以检测受检者红细胞上的A、B抗原及血清（血浆）中抗-A、抗-B。
根据受检者红细胞表达的A、B抗原及血清（血浆）中抗-A、抗-B情况判断ABO血型。
2、单克隆抗-D试剂与受检者红细胞反应，检测受检者红细胞是否表达D抗原，根据结果判断RhD血型。
四、设备与试剂设备：普通离心机，血型血清学专用离心机，显微镜试剂：单克隆抗A抗B抗D试剂，3%-5%的A、B、O红细胞五、环境条件室温控制在18-27℃，湿度保持在30%-70%。
六、步骤和方法1、将受检者血标本离心分离血清（血浆）及压积红细胞，取压积红细胞30—50微升加生理盐水1毫升稀释成3%—5%红细胞悬液。
2、取干净试管6支，正定型分别标记为抗-A、抗-B，反定型分别标记Ac、Bc、Oc另标记抗-D，在标记为抗-A、抗-B、抗-D的3支试管中分别加入相应的单克隆试剂2滴约100微升，再各加入受检者3%—5%红细胞悬液1滴约50微升；在标记为Ac、Bc、Oc的3支试管中各加入受检者血清（血浆）2滴约100微升，再分别加入相应的A、B、O型试剂红细胞1滴约50微升，轻摇使试管内反应物混匀。
用血型血清学专用离心机120g离心1 min后观察结果。
3、首先观察有无溶血现象，然后轻轻转动试管，边转动边观察有无凝集，使沉于管底的红细胞全部悬浮。
如肉眼观察不能确定有无凝集时须在显微镜下观察确定。
4、结果判断4.2 ABO血型鉴定结果判定规则，如下表：4.3 RhD血型判定：红细胞与单克隆-D试剂凝集为RhD阳性，无凝集为RhD阴性。
七、质量控制单克隆抗-A、抗-B、抗-D试剂在有效期内使用，每批次在使用前应检测特异性和效价。
ABO疑难定型
ABO疑难定型一、ABO疑难血型鉴定的方法（一）正反定型：正定型：-A, -B，-AB, -H, -A1反定型：Ac, Bc, Oc, 自身对照1. ABO正定型中各种试剂用途疑难定型中正定型用抗血清抗-A及抗-B抗-AB:确认弱A和弱B抗原,与弱A及弱 B抗原亲和力强,会产生强反应抗-H:用于检查亚型及孟买型, A亚型红细胞上的H抗原多于正常A型抗-A1: 用于A亚型(如A2, A3)检测2. H抗原在红细胞上的分布3. ABO反定型中各种试剂的用途反定型中试剂红细胞的意义A及B细胞: 确认抗-A或抗-B抗体O型红细胞:检查是否存在ABO系统以外抗体干扰ABO反定型自身对照: 用于确认正反定型结果的有效性,排除自身抗体对定型的干扰(如冷凝集等)A2细胞: 用于亚型的鉴定, 尤其是在怀疑是A亚型且又存在抗-A1抗体的情况下（二）型物质测定型物质准备：1~2ml唾液，沸水煮10分钟，离心后得到的上清。
标清的调制：标清用盐水稀释至其效价为1：16中和：将0.5ml型物质与调制后的标清0.5ml等体积混合,室温放置30分钟检测：用Ac检测中和后的抗-A, Bc检测中和后的抗-B.结果判断：如果抗-A被中和，则被检者为A型，如果抗-B被中和，则被检者为B 型。
（三）吸收放散吸收用RBC：盐水洗涤5次的被检者压积RBC 1ml。
吸收用的标准血清将压积RBC和标清按等体积比例混合，在相应的温度条件下（4℃）孵育1小时，每隔15分钟混匀一次用盐水洗涤孵育后的细胞6次，得到压积RBC，加入等量盐水。
56℃水浴震荡10分钟，离心获得上清即为放散液。
用标准试剂红细胞检测放散液。
（四）O型筛选红细胞的应用抗原组成:三组合细胞,要求必须具备全部的Rh因子I: O型R1R1(CDe/CDe); II:O型 R2R2(cDE/cDE); III: O型rr(cde/cde)用途: 用于受血者、献血员及孕产妇等的ABO系统以外不规则抗体的筛选目的: 在配血之前,有针对性、按比例的去寻找与带有抗体的病人相配合的血（五）自家冷凝集血样的ABO定型正定型用红细胞的准备:血样采集后,立即离心,获得压积红细胞用37℃温盐水洗涤红细胞45℃热放散3分钟巯基试剂处理: 破坏IgM抗体自家冷凝集血样的ABO定型反定型用血浆或血清的准备血样采集后放置4℃冰箱静置24小时,使红细胞充分吸收自身冷凝集抗体用自身红细胞吸收去除自身冷抗体用O型红细胞吸收去除ABO系统以外的非特异性及特异性抗体（六）获得性B1. 获得性B及多凝集现象获得性B:肠紊乱及感染病人, 细菌酶影响A抗原的受体肠内壁通透性增加,而后细菌多糖吸附在红细胞表面多凝集现象:异常或变形的RBC被所有正常人的血清凝集(微生物酶作用暴露或激活膜隐蔽受体多凝集血样中的血清不与自身反应)2. 获得性B产生的主要机理二、ABO正反定型不符的问题分析（一）ABO定型问题经常发生的情况为：1. 明显缺失应该出现的抗-A或抗-B：(1) 新生儿血样(2) 免疫缺陷、免疫紊乱(3) 前带现象(4) 血型型物质过多(5) 抗原太弱，常规方法检查不出来，相应血清中无抗体(6) 亚型，反应是混合视野2. 由于试剂被污染，或试剂中有额外抗体3. 明显多出抗原(或多出抗体)(1) 亚型，如A2型可能血清中有抗-A1(2) 自家凝集(3) 获得性B（二）引起ABO正反定型不一致的原因分析1. 技术因素：(1) 试剂贮存不当(2) 使用技术错误(3) 使用错误的试剂(4) 使用污染或失效的试剂(5) 离心速度不当2. 存在IgM性质的自家冷抗体由于自家冷抗体(冷凝集病,CHD)而导致自家溶血的病人，在低于37℃时血细胞自发凝集，影响正反定型。
血型鉴定试管法的应用
目录
• 试管法血型鉴定的操作及注意事项 • ABO正反定型不符的原因分析及解决
方法
试管法ABO血型鉴定的操作步骤
• 试管法测定ABO血型 1、正定型 在2只分别标记抗A、抗B干净试管中分别加入相应的试剂；在每个试管中
各加1滴2-5%受检者的红细胞悬液；轻轻混匀，离心15秒（3400转/分），轻 轻重悬细胞扣，检查凝集情况；判读结果，与反定型结果比较。 • 2、反定型
ABO定型常见问题的解决方法
冷自身抗体 ➢ 用37℃温盐水洗涤红细胞、56℃热放散。 ➢ 巯基试剂(DTT、2-Me)处理红细胞。 ➢ 将血浆和红细胞分别在37℃孵育5-10分钟后 再进行试验。 ➢ 自身吸收、O型红细胞吸收吸收去除血浆中的 冷自身抗体
ABO定型常见问题的解决方法
室温反应的同种抗体 ➢ 用谱细胞做抗体鉴定。 ➢ 选择没有相应抗原的A、B细胞做反定型。 ➢ 常见抗体：MN、Lewis、P血型系统抗体。
蛋白凝集
蛋白凝集
盐水法——蛋白凝集
• 加生理盐水前
盐水法——蛋白凝集
• 加生理盐水后，凝集消失
ABO定型常见问题的解决方法
ABO亚型 ➢ 正定：抗-A、抗-B、抗-AB、抗-A1、抗-H ➢ 反定：A1c、A2c、Bc、Oc、自身对照 ➢ 吸收放散试验 ➢ 唾液型物质检测 ➢ 血型基因检测 ➢ 有条件者可作家系调查
实验程序
反应
条件
-A
IS
二次
多次
人源
ABO正定型
反应
-B
-A1
-AB 条件
Ac
4oC
ABO反定型
Bc
Oc
自身c
ABO血型定型试剂
抗-H
抗-H 用于检测ABO亚型及孟买、类孟买型。 ( A或B亚型H抗原增强，孟买 、类孟买H抗原阴性。) 注意：
ABO卡式
2红细胞标本一定不能被细菌污染。否则出现假阳性结果，应尽可能用当日采集的新鲜血做本试验。
3如果在微柱凝胶管中出现溶血，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致，对此标本认真分析并向上级主管技术人员报告并讨论原因。
操作方法：1将试剂卡做好标记。
2将待检者0.5％红细胞悬液分别加入第一，第二，第四微管中（即－A,－B,对照），每管50ul。
3将待检者血清加入第五和第六微管中（即A细胞，B细胞管中），每管50ul。
4将已知A型和B型标准红细胞0.5％的红细胞悬液分别加入第五和第六微管中（即A细胞，B细胞管中），每管50ul。
5用专用离心机离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟），取出肉眼判定结果。
6结果判定：
ABO血型正反定型结果（试剂卡检测法）
血型
抗A
抗B
阴性对照
A细胞
B细胞
A
＋
－
－
－
＋
B
－
＋
－
＋
－
O
－
－
－
＋
＋
AB
＋
＋
－
－
－
阳性结果：红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。
阴性结果：被检红细胞抗原无相应的抗体结合，不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于微柱凝胶的底部，为阴性反应。
北京北亚骨科医院
血库标准技术操作规程SOP文件
编号：BY-XKSOP-日
ABO血型鉴定(试剂卡检测法)
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目的：用于ABO血型的鉴定
试验原理：正定型，是用已知抗—A和抗—B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或／和B抗原；反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗—A或／
ABO血型鉴定操作规程
1.目的：为准确鉴定ABO血型2.要求：要求全科人员熟练掌握原理及操作，对有疑问的结果能够做出解释及妥善解决。
3.原理：根据红细胞上有无A抗原和/或B抗原，将血型分为A型、B型、O型和AB型四种。
可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。
正定型是用已知抗A和抗B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原和/或B抗原；反定型是用已知的A型红细胞和B型红细胞来测定血清中有无相应的抗A和/或抗B。
反定型中使用O细胞是为了检测抗A、抗B以外的不规则抗体。
4.试剂和材料4.1 A、抗B分型血清，效价1：128以上4.2 2%~5%A、B、O标准红细胞。
4.3 受检者血样5.方法．（试管法）5.1 取洁净小试管2支，分别标明抗A、抗B，分别滴加抗A、抗B分型血清1滴于试管底部，再分别加入受检者2%~5%红细胞1滴，混合。
5.2 另取洁净小试管3支，标明A C、B C、O C，各加入受检者血清2滴于试管底部，再分别加入A、B和O型2%~5%标准红细胞1滴，混匀。
5.3 以1000g离心15秒，将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，以肉眼观察有无凝集或溶血现象。
观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，这将有助于A、B亚型、类B、或CisAB的发现。
★6.结果判断：血型抗A血清抗B血清A细胞B细胞O细胞A + - - + -B - + + - -O - - + + -AB + + - - -7.正反定型不一致的原因：有技术问题或红细胞和血清本身问题，常见者有以下数种：7 1 分型血清效价太低，亲和力不强。
7.2 红细胞悬液浓度过高或过低，抗原抗体比例不适当（出现前带或后带现象），使反应不明显误判为阴性反应7.3 受检者红细胞上抗原位点过少（如亚型）或抗原性减弱（见于白血病或恶性肿瘤）以及类B或CisAB等。
7.4 受检者血清蛋白紊乱（高球蛋白血病）或实验时温度过高，常引起红细胞呈缗钱状排列。
7.5 受检者血清中缺乏应有的抗A或抗B抗体，如丙种球蛋白缺乏症。
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ABO血型鉴定正反定型试验方法
一、试剂和材料：
（一）单克隆抗A、抗B试剂（由试剂厂家提供）
（二）显微镜、载玻片
（三）A型、B型红细胞（本实验室制备的5%混悬液）
（四）EDTA抗凝的待测红细胞全血
（五）竹签
二、方法（玻片法）：
（一）正定型：
1.在一块干净的玻片上，间隔一定距离做好标记，分别滴一滴抗A和抗B试剂；
2.在每滴试剂中加一滴待测红细胞全血；
3.用竹签混匀试剂和红细胞，并使混合物直径＞15mm；
4.轻摇玻片，两分钟内观察结果，必要时可以在低倍镜下观察；
5.判读、解释并记录反应结果。
（二）反定型：
1.在玻片上间隔一定距离标明Ac和Bc字样。
分别滴加5%的A型红细胞悬液、B型红细胞悬液各一滴；
2.在玻片每滴红细胞悬液上滴加待测血清各一滴；
3.混匀（同正定型）；
4.轻摇玻片，两分钟内观察结果，必要时可以在低倍镜下观察；
5.判读、解释并记录反应结果。
6.结合正反定型反应结果、判定血型，见表1
表1 ABO血型正反定型试验结果判定
三、附注：
（一）表中“O”表示无凝集，“+”表示凝集，一般都是3-4个+的强凝集反应；
（二）2分钟后红细胞仍呈均匀混悬状态是阴性反应；
（三）若得到弱的或可凝集反应结果，该标本应用试管法重新试验；
（四）由于新生儿在出生4~6个月内，血浆中的ABO抗体活动太弱，并且含有来自母亲的抗体，故新生儿血型只能由检测红细胞抗原的正定型来测定其ABO血型；
（五）做正定型时，还可加一抗A、B血清（O型人血清），以检测ABO弱抗原；做反定型时可以加试一O型红细胞，借以证实是否有不规则抗体的存在。