耐药细菌及检测(2)

耐药细菌及检测（2） 写在课前的话 随着多重耐药或经耐药细菌在教学医院以及综合性医院的流行，院内感染的机会也在不断的增多。一些对青霉素和大环内酯类耐药的肺炎链球菌，对三代头孢菌素耐药的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌，以及对碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌等耐药菌株的流行，加之一些新的病原微生物的不断出现，给临床对感染性疾病的诊断和治疗增加了难度。

一、耐药细菌的检测 细菌的耐药机制各异，针对具有特定耐药机制的细菌的检测方法也是不同的。耐药细菌的检测，主要是采用抗菌药物的敏感试验。具体方法主要有扩散法、稀释法、 E-test 法、自动微生物分析仪检测以及分子生物学方法。

（一）方法 1、扩散法 这种方法是将抗菌药物纸片贴到已经涂布有待检细菌的MH碟子上，通过孵育以后，观察抑菌圈直径，以mm表示，这是一种定性的方法。

2、稀释法 稀释法主要是将抗菌药物的浓度做不同稀释，然后来测定这些不同浓度的抗菌药物对细菌的抑菌作用。通过孵育培养以后，观察最低抑菌浓度，即MIC值，以μg/ml 表示，这是定量的方法。

3 、E-test法 E-test法 主要是综合了扩散法和稀释法的优点，它是把抗菌药物以不同的浓度放在了一个E-test条上，把E-test条直接放在涂有细菌的碟子上，那么可以观察E-test条上抗菌药物与细菌之间相互作用以后，所获得的椭圆形的抑菌圈，来测定一个MIC值，因此这也是一种定量的方法。

4 、自动微生物分析仪 自动微生物分析仪，例如现在很多实验室使用的ViteK, Microscan等，这些微生物分析仪可以给出抗菌药物对于某种细菌的特定的抑菌值，也是MIC值的一种检测方法。

5 、分子生物学方法 分子生物学方法主要是测定耐药细菌的一些耐药基因，比如说mecA基因，当然对于某些耐药基因的检测，应该注意这些耐药基因是否有表达，它们是否是“沉默”的基因。 （二）解释性分类 通过药敏试验我们可以获得定性的结果即抑菌圈的直径，或者是定量的结果，即最低抑菌浓度MIC值。如何将药敏试验结果的值转换成临床容易接收的结果？在药物敏感试验的判读当中，我们就有一个遵循的标准。在我们国家，多数实验室都是遵照着美国临床微生物实验室标准化委员会所给出的解释性的分类标准。通过这个标准我们就可以把药敏试验最终判定为敏感（S）、中介（I）、或者是耐药（R）。

1 、敏感（S） 敏感就是指的针对感染部位，使用推荐剂量的抗菌药物所达到的浓度能够使细菌受到抑制。 2 、中介（I） 中介则是指需要用高于正常剂量的抗菌药物才会有效。或者是一些抗菌药物在机体的特定部位可以浓集，例如当尿路感染时使用喹诺酮类和ß-内酰胺类抗菌药物，它们可以在尿液中进行浓集。中介同时也代表了试验的缓冲区，主要是为了防止微小的未能控制的影响因素造成一些重大的结果解释错误。

3 、耐药（R） 耐药，则是指所测试的抗菌药物对病人的治疗很可能会失败。 （三）药敏试验结果与参考结果的比较 1 、定量试验 药敏结果是否正确，对于临床抗感染治疗起着很重要的指导作用。要使药敏结果能够真正的发挥对临床的指导作用，我们要进行相应的质量控制，也要评比我们的试验结果与参考结果的一致性。

从定量试验方法来看，如果我们检测的结果，与参考的结果相差在一个稀释度范围内，比如说检测结果是1或者是4，而参考结果是2，则这个检测结果跟参考结果是基本一致。当检测结果与参考结果的值是完全相同的，如都是2μg/ml，则检测的结果与参考结果就是完全一致的。

2、定性试验 当进行定性试验的时候，我们将检测结果做了大的分类。当检测结果与参考的结果在分类上是相同的，例如检测与参考的结果都是敏感，或者是检测结果与参考结果都是耐药，那么就是说检测结果与参考结果是一致的，这是可以接受的。当检测结果为敏感，而参考结果为耐药时，这种情况就成了极重大的错误。因为临床很可能根据实验室报告的敏感结果选用这一类抗菌药物对病人进行治疗，而我们的报告跟参考结果是完全不一样的，在分类上出现了很大的误差，那么对病人的治疗很可能就是无效的，就像参考结果中所指的，这是一株耐药的细菌，所以这种情况我们应该避免。还有重大错误，就是检测结果是耐药，而参考结果是敏感。这种时候临床就可能不用我们所报告的耐药的抗菌药物，而去用其他敏感的抗菌药物，但是当病人在其他抗菌药物都是耐药的情况下，医生就很难选择出有敏感的抗菌药物，因此这种情况我们也应该尽量的避免。小错误，就是指检测结果和参考结果在分类上是接近的，例如检测结果是耐药或者是敏感，而参考结果是中介或者相反，检测结果是中介，而参考结果是耐药或者是敏感。

二、几个主要的细菌耐药问题 （一）MRSA 1 、检测方法 MRSA的细菌检测的一个简单的方法就是在涂有待检金葡菌的MH碟子上放上含有30μg头孢西丁的纸片。通过培养24小时以后，观察头孢西丁抑菌圈的直径大小，当抑菌圈直径≤21mm的时候，我们认为这是一株MRSA的细菌，也就是它是由mecA基因介导的，耐甲氧西林的金葡菌。而当直径≥22mm时，认为这是 mecA基因阴性的金黄色葡萄球菌。如果实验室有条件的话，还可以直接检测mecA基因。

2、不均一耐药性 在检测MRSA的时候，我们一定要注意要在33-35 ℃ 的条件下，培养 24 小时来读取结果，而且读取结果的时候，一定要在有透光的地方，观察是否在抑菌圈里存在一些小菌株，因为MRSA菌株往往有不均一耐药的现象。这种不均一耐药性主要表现在在同一培养瓮出现耐药表达与不表达的菌株，表达菌株比不表达菌株的生长更缓慢，所以一定要检测出那些生长缓慢的耐药菌株。

3、发生率 MRSA的发生率统计是不一样的，在2008年的《中华检验医学杂志》上发表了关于全国7家医院耐药检测的一个统计数据，这个MRSA的统计数据是48%。在不同医院、不同地区或者是不同病房这个比率有所差异，有的报告60%、70%多，甚至有的医院或病房达到90%以上，这是相当高的。

4、耐药机理 MRSA的耐药机理主要是在于它产生PBP2a，这种PBP2a与β -内酰胺酶亲和力比较低，不会被接合而破坏。当葡萄球菌产生的其他的青霉素结合蛋白被β -内酰胺酶抗生素结合失去功能的时候， PBP 2a 就可以取而代之，使细菌生长繁殖成为耐药菌。

5、临床意义 检测出来MRSA的主要临床意义有：所有的MRSA的菌株对青霉素类、头孢菌素类、碳青酶烯类、ß- 内酰胺类及ß- 内酰胺类与酶抑制剂的复合制剂的复合抗菌药物都是耐药的。对于氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类药物也往往表现为同时耐药。氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类我们也应该做相应的检测，它们是否确实存在同时耐药，要看我们的药敏试验的结果。

6 、诱导性克林霉素耐药 在葡萄球菌特定耐药机制的检测当中，实验室还应该重视对诱导性克林霉素的耐药性的检测。这种检测方法也很简单，第一可以采用扩散法，就是将15μg的红霉素纸片，或者是2μg的克林霉素的纸片，这两种纸片同时贴在涂有葡萄球菌的MH碟子上。在培养以后，观察两纸片抑菌圈的形态，当克林霉素纸片在偏向红霉素纸片一侧的抑菌圈，形成所谓的大D，这样我们说这是一个诱导克林霉素耐药的D试验阳性。

也可以用稀释方法来检测，即把抗菌药物红霉素4μg/ml，和克林霉素0.5μg/ml，放在同一测试孔里头，然后接种上细菌，只要有细菌生长，我们认为这就是诱导克林霉素耐药的葡萄球菌。

检测诱导克林霉素耐药的意义就在于，当红霉素耐药，克林霉素敏感的时候，有一部分病人是很容易产生诱导耐药的。那么使用了克林霉素以后，很快就变成耐药了。因此在报告D试验阳性的结果的时候，直接可以报克林霉素耐药。当然，如果病人在没有其他抗菌药物选择的情况下，部分病人对克林霉素可能有效，但是应该提醒临床注意，使用克林霉素以后，很容易产生诱导耐药。

在诱导性克林霉素耐药发生率到底有多少？在《中华检验医学杂志》2005年这一期报道了诱导性克林霉素耐药占金黄色葡萄球菌的18.1%，而在红霉素耐药，克林霉素敏感的菌株当中，诱导性克林霉素的发生率可以达到69.4%。

如何报告克林霉素诱导耐药阳性？ （二）VRE 1 、检测方法 检测万古霉素耐药的肠球菌通常采用每片含有30μg万古霉素的纸片进行药物敏感试验，当抑菌圈直径≥17mm时，判为肠球菌对万古霉素是敏感的，而当抑菌圈直径<16mm时，应该进一步测试MIC值，或者是进行琼脂筛选试验，即将含有6μg/ml的万古霉素加到琼脂的培养基当中，点种含有0.5个麦氏单位的菌液10μg，经过培养、观察，平板上有一个菌株生长，那么就认为这是耐万古霉素的肠球菌。

2 、耐药机理 肠球菌对万古霉素的耐药机制主要是因为细菌含有万古霉素的耐药基因，已经确定的有A、B、C甚至还有其他的万古霉素耐药基因。最常见的是A、B、C。万古霉素耐药的VanA基因通常对万古霉素表现为高度耐药，MIC的值往往在64μg/ml以上。对壁霉素表现为低度耐药，由VanB基因介导的对万古霉素的耐药，它对万古霉素的耐药程度是不等的，MIC值从16-512μg/ml，而对壁霉素是敏感的。VanC基因介导的耐药，对万古霉素是低度耐药，而对壁霉素是敏感的。因此从表形上来看，耐万古霉素的肠球菌对万古霉素和壁霉素也就是替考拉宁，它们的耐药程度是不一样的，可以进行初步的判定。当然要确切的知道不同的耐万古霉素的基因需要进行基因的检测。

需要指出来的是，基因的检测可以明确到底是哪一类的基因，尤其是VanA和VanB基因，它们这两种基因如果存在的话，很容易导致耐药性的传播，因为这两种菌是很容易在肠球菌之间进行传播的。

VRE的耐药机制主要是因为耐万古霉素的基因可以编码产生酶，编码产生的酶可以干扰细胞壁上与万古霉素结合成分的合成，从而阻断抗菌活性。

（三）VISA或VRSA 1 、检测方法 对VISA或VRSA的检测，如果实验室通常使用纸片扩散法进行药物敏感试验，当发现万古霉素对葡萄球菌的抑菌圈直径≤14mm时，应进一步检测MIC值。我们也可用筛选的方法，这种方法将6μg/ml的万古霉素加到脑心浸液琼脂培养基当中，制成了平板以后，我们再将用盐水或肉汤自备的具有0.5麦氏单位的金葡菌待检菌取10μg加到含有万古霉素的琼脂平板上，加进去的待检菌最好是用棉拭子或接种环将其涂成10-15mm直径大小的区域，然后把平板放到35 ℃空气培养，连续培养观察24小时，在反射光下仔细观察菌落生长情况。

2 、报告 如果发现有一个以上的菌落生长，再确定接种物是金黄色葡萄球菌纯的培养菌以后，我们可以用稀释法或者是琼脂梯度扩散法，即我们前面讲到的E-text的方法来检测MIC。如果没有菌落生长，直接可以报告万古霉素敏感。通过MIC的检测，知道待检菌具体的MIC值，从而确定是VISA还是VRSA。