山楂核中熊果酸含量的HPLC测定

山楂核中熊果酸含量的HPLC 测定

杨晓彤 程乐乐 糜 可 周韵丽 杨庆尧

上海师范大学微生物与免疫学研究所 (上海 200024)

摘要:采用C 18反相高效液相色谱RP -HPLC 法对山楂核中的熊果酸作含量测定。结果:测得山楂核中的熊果酸含量为01577mg/g,回收率为103113%,保留时间和峰面积的变异系数分别为0118%和1168%(n =8)。山楂核甲醇萃取液在作HPLC 分析前,先用硅胶柱吸附,再用洗脱液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B 4B 1)洗脱,可去除大部分杂质,提高测定效果。

关键词:山楂核(Seed of Crataegus pinnati fida ),熊果酸,RP-HPLC 中图分类号:R 282.6 文献标识码:B 文章编号:1008-861X(2001)01-0055-03

基金项目:上海市高等学校科学技术发展基金资助项目(96011)

熊果酸(Ursolic acid,UA )属三萜类化合物,广泛存在于山楂、乌梅、夏枯草等植物[1]。近年发现熊果酸除有抗炎、抗突变活性外,对多种恶性肿瘤细胞亦有强烈的毒杀效应[2~4],并有诱导癌细胞分化的能力[5]。已知山楂中含熊果酸[6]。有人在山楂核中也检测到熊果酸[7],但迄今未见其含量报道。本文用HPLC 测定了山楂核中的熊果酸含量。1 仪器与材料

仪器:Beckman Gold System 高效液相色谱仪及软件,125型泵,168型紫外二极管阵列检测器;Beckman Ultrasphere C18反相柱(416@250mm,加416@50mm 保护柱);旋转蒸发器为B chi 公司产品;C Q250超声波发生器产自上海超声仪器厂。 材料:熊果酸标准品由中国药品生物制品检定所提供。山楂购自天津市场,品种名:大红袍。测定用甲醇为色谱级。提取用试剂(甲醇、环己烷、乙酸乙酯、冰醋酸)均为化学纯。层析硅胶为上海五四化学试剂厂产品。2 方法与结果

2.1 山楂核样品制备、预处理及熊果酸检出

2.1.1 样品提取: 将鲜山楂沸水煮1min 后,分离山楂核,60~80e 烘干,打成200目的细粉,精密称取山楂核粉1g,加100ml 甲醇,90e 水浴回流提取6h 或置超声波发生器内超声提取1h,过滤,取滤液减压蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至5ml,待作硅胶柱预处理。

2.1.2 硅胶柱预处理: 取100g 层析用硅胶,用二倍柱体积的洗脱液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B 4B 1,V/V)洗脱,100e 烘至无酸味。取118g 装成id 8@85mm 的硅胶柱。精密吸取015ml 待处理样品于硅胶柱上,待甲醇挥干后用7ml

层析液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B 4B 1)洗脱,收集洗脱液,减压蒸干,用甲醇溶解并定容至1ml,0122mm 膜过滤后进行HPLC 分析。

2.1.3 样品测定结果 山楂核提取样品经硅胶柱预处理后上HPLC 仪测定,测定用流动相为甲醇/水(用甲酸调p H 至3)=95/5(V/V);流速:1ml/min;进样量:20L l;在215nm 波长下检测,用熊果酸标准品作对照。结果:样品在熊果酸标准品的出峰位置上出现相同的色谱峰(图1)。另在样品中加入熊果酸标准品后该峰的面积增加,但保留时间未改变,且没有出现新增的峰(图2)

。

a:山楂核甲醇提取物 b:熊果酸

Me than ol extract of the Ursolic acid(uA)S eeds of C.pinnati fida

图1 山楂核甲醇提取物与熊果酸标准品HP LC 色谱图

Fig.1 HPLC ch romatograms of m eth an ol extract of the seeds of C.pinnati fida

除上述色谱图外,另以每秒4次的频率记录190~320nm 范围内的光谱吸收,结果两者的光谱吸收图完全一致,其最大吸收在204nm(图3a)。将上述光谱进一步作二阶导数变换,其二阶导数光谱也完全一致(图3b)。由此可见两者为同一物质,山楂核提取物中的该色谱峰为熊果酸吸收峰。

第15卷第1期2001年3月

上海中医药大学学报

ACT A UNI VERSIT ATIS TRADI TIONIS MEDIC AL IS SINENSIS P HARMACOL OGIAEQUE S HANGHAI

VOL.15NO.1

Ma r.,2001

a:未加熊果酸标准品 b:已加熊果酸标准品Not UA added

UA is added

图2 样品中加入熊果酸标准品前后的HPLC 色谱图

Fig.2Chromatograms of HP LC before and after UA is added to the sam

ple

a:紫外吸收光谱 b:紫外吸收光谱的二阶导数光谱UV spectrogram S econd derivative spectrogram of UV 图3 山楂籽中熊果酸与标准品的紫外吸收光谱及其二阶导数光谱

Fig.3 S pectrograms of UV and second derivative of UA and seeds of C.pinnati fida

2.1.4 样品预处理效果 比较样品经硅胶柱预处理前后的HPLC 图,结果见图4

。

a:未经预处理 b:经预处理

Before pre-treatment After pre-treatment 图4 样品经硅胶柱预处理前后HPLC 色谱图

Fig.4 HPLC chromatograms of the silica g el column before and after the pre-treatment of samples

2.2 山楂核中熊果酸含量的HPLC 测定

2.2.1 标准曲线制作 精密称取干燥至恒重的熊果酸标准品9171mg,甲醇溶解成浓度为01971mg/ml 的标准溶液。精密吸取该溶液,加甲醇配制成浓度分别为01194,01097,01049,01024,01012(mg/ml)的溶液进行HPLC 测定,并计算回归方程。结果熊果酸峰面积(P.A.)与熊果酸浓度(Conc.)关系为:P.A.=12411465Conc.)

01305649(r=019998)。

2.2.2 精密度测定 取熊果酸标准溶液(浓度为011942mg/ml)连续进样8次,结果见表1。表1

精密度测定结果

Tab.1 Res ult of precision determination

Inj ection ti me

RT (min)Peak area 191285021188252912490221042139125802116051491239021112035912700211775369125802214042791280021170928

9124702118517 x ?s 912608?010163

2117988?013668

CV (%)

01176

11680

2.2.3 提取方法比较及山楂核中熊果酸含量的测定:分别用甲醇回流和甲醇超声提取三份山楂核样品,经硅胶柱预处理后进行HPLC 分析,分析条件同2.1.3。结果见表2。表2 两种提取方法所得山楂核中熊果酸量的比较(mg/g)

Tab.2 Comparis on of contents of UA of seeds of C.pinnati fida by two extraction methods

Sample Reflux extrac t Ultras onic extract

101577015042016020156930155101597 x ?s 01577?01003

01557?01005*

CV(%)

4141

8150

Compared with Reflux extract *P >0105

2.2.4 回收率测定:精密称取3份山楂核粉,每份1g,每个样品均平行测定2次,然后再在样品中各加入熊果酸标准品011942mg,结果见表3。

54实验研究