8-羟基脱氧鸟苷高特异性ELISA检测方法的建立及其用于妊娠期糖尿病

·技术与方法·８－羟基脱氧鸟苷高特异性ＥＬＩＳＡ

检测方法的建立及其用

于妊娠期糖尿病的对比研究

邱　月１，２　安莉莎２　曹小芳２　杜　蒙１　高　丹２　张　辰１　王启迪２　马　旭２＊

１．北京协和医学院研究生院（１００７３０）；２．国家卫生健康委科学技术研究所

摘　要　目的：建立生物素－亲和素双抗夹心酶联免疫吸附法检测８－羟基脱氧鸟苷（８－ＯＨｄＧ）的方法，

对比研究妊娠

期糖尿病患者８－ＯＨｄＧ水平。方法：通过偶联形成８－ＯＨｄＧ－ｍｃＫＬＨ复合物作为免疫原得到８－ＯＨｄＧ的高特异性配

对抗体１Ｄ４、３Ｂ８，最终建立生物素－亲和素标记的双抗夹心ＥＬＩＳＡ定量检测８－ＯＨｄＧ的方法。结果：所建立的方法批

内批间变异系数均＜１５％，稳定性良好；回收率为９９．２％、１００．８％和９４．８％。妊娠期糖尿病患者血清８－ＯＨｄＧ水平

（７．３±１．３ｎｇ／ｍｌ）高于对照组（２．２±０．７ｎｇ／ｍｌ）（Ｐ＜０．００１）。结论：本研究建立的

８－ＯＨｄＧ检测方法为研究氧化损伤

与疾病关系提供了更为准确、便捷的检测方法。血清８－ＯＨｄＧ水平的异常改变可能与妊娠期糖尿病的发生进程密切

联系。关键词　８－羟基脱氧鸟苷；单克隆抗体；酶联免疫吸附实验；妊娠期糖尿病

Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　８　ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ａ　ｈｉｇｈ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ＥＬＩＳＡ　ａｓｓａｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆｉｔｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ

ＱＩＵ　Ｙｕｅ１，２，ＡＮ　Ｌｉｓｈａ２，ＣＡＯ　Ｘｉａｏｆａｎｇ２，ＤＵ　Ｍｅｎｇ１，ＧＡＯ　Ｄａｎ２，ＺＨＡＮＧ　Ｃｈｅｎ１，ＷＡＮＧ　Ｑｉｄｉ　２，ＭＡ　Ｘｕ２１．Ｇｒａｄｕａｔｅ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１００７３０；２．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆａｍｉｌｙ

Ｐａｎｎｉｎｇ

Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　８－ＯＨｄＧ　ｂｙ　ｂｉｏｔｉｎ　ａｖｉｄｉｎ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ＥＬＩＳＡ

，

ａｎｄ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　８ＯＨｄＧ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ（ＧＤＭ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　８ＯＨｄＧ－ｍｃＫＬＨ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｗａｓ　ｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｌｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐａｉｒｅｄ

ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　１Ｄ４ａｎｄ　３Ｂ８ｏｆ　８ＯＨｄＧ．Ａ　ｂｉｏｔｉｎ　ａｖｉｄｉｎ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ　ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　８ＯＨｄＧ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｓｅｒｕｍ　８ＯＨｄＧ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＧＤＭａｎｄｈｅａｌｔｈｙ　ｐｒｅｇｎａｎｔ　ｗｏｍｅｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎｔｒａａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ａｓｓａｙｓ　ｗａｓ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　１５％

，

ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ｇｏｏｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ，ｈｉｇｈ　ａｃｃｕｒａｃｙ　ａｎｄ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　９９．２％，１００．８％ａｎｄ　９４．８％．Ｓｅｒｕｍ　８ＯＨｄＧ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＧＤＭ　ｗａｓ（７．３±１．３）ｎｇ／ｍｌ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ［（２．２±０．７）ｎｇ／ｍｌ］

ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ　ｐｒｅｇｎａｎｔ　ｗｏｍｅｎ（Ｐ＜０．００１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　８ＯＨｄＧ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＧＤＭ　ｍａｙ　ｂｅ　ｃｌｏｓｅｌｙ

ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ＧＤＭ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　８ＯＨｄＧ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ

ｈａｖｅ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｍｏｒｅ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ｔｅｓｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ　ａｎｄ　ｄｉｓ－ｅａｓｅ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　８ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｄｅｏｘｙ　ｇｕａｎｏｓｉｎｅ；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ；Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ　ｄｉａ－

ｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ

８－羟基脱氧鸟苷（８－ＯＨｄＧ）作为一类稳定的ＤＮＡ氧化产物，与多种氧化损伤相关疾病进程具有相关性，目前已成为ＤＮＡ氧化损伤中最常用的生ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－８１８９．２０１９．０７．００４收稿日期：２０１９－０４－１６　修回日期：２０１９－０５－１３＊通信作者：ｇｅｎｅｔｉｃ＠２６３．ｎｅｔ．ｃｎ物标志物［１－３］。在临床上作为一种生物标志物可以

辅助相关疾病的诊断或反映相关疾病的进程。妊娠

期糖尿病（ＧＤＭ）

发病机制研究表明其与氧化应激

有着密切的联系［４－５］。

因此有研究推断

８－ＯＨｄＧ与

ＧＤＭ的疾病进程可能存在一定的联系［６－７］，

提示对

于８－ＯＨｄＧ水平的监控可能对临床上早期诊断

ＧＤＭ以及制定后续治疗方案有一定的积极作用。

１５８中国计划生育学杂志２０１９年７月第２７卷第７期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｆａｍ　Ｐｌａｎｎ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ　２０１９本研究尝试建立具有特异性良好的检测８－ＯＨｄＧ

的方法，用于检测孕妇血清８－ＯＨｄＧ水平，探讨ＧＤＭ与血清８－ＯＨｄＧ水平的关系。１材料与方法１．１主要材料５９份ＧＤＭ血清样本和５９份健康孕妇血清样本为人类遗传资源中心样本库提供（２０１０年—２０１５年收集）；Ｂａｌｂ／ｃ小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司；小鼠骨髓瘤细胞系购自北京康为世纪生物科技有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、抗体亚型测定试剂盒均购自Ｓｉｇｍａ公司；８－ＯＨｄＧ　ｍｃＫＬＨ购自Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ公司；其他各类试剂和培养液均购自美国Ｇｉｂｃｏ公司和Ｃｏｒｎｉｎｇ公司。１．２检测方法的建立１．２．１合成抗原８－ＯＨｄＧ－ｍｃＫＬＨ　本研究使用ＥＤＣ法将８－ＯＨｄＧ与钥孔血蓝蛋白（ｍｃＫＬＨ）偶联形成了８－ＯＨｄＧ－ＫＬＨ复合物，取２ｍｇ的ｍｃＫＬＨ溶于２ｍｌ　ｄｄＨ２Ｏ中，形成Ａ溶液；取８－ＯＨｄＧ　５ｍｇ溶于５０μｌ　ＤＭＳＯ中，形成Ｂ溶液；称取０．０１１ｇ　ＥＤＣ溶于１１００μｌ　ｄｄＨ２Ｏ中，形成Ｃ溶液；取５００μｌ　Ａ溶液与Ｂ溶液混匀后迅速加入１２５μｌ的Ｃ溶液，将混合液置于摇床，室温１８０ｒｐｍ　２ｈ；混合液４℃透析２～３ｈ，换２次ＰＢＳ后过夜；次日将混合液储存于ＥＰ管内，标记浓度５ｍｇ／ｍｌ备用，置－２０℃冰箱保存。１．２．２　８－ＯＨｄＧ抗体的制备　采用８－ＯＨｄＧ－ｍｃＫ－ＬＨ免疫原对６只Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠进行腹腔免疫，经过４次免疫后，隔７ｄ断尾采血，第４次加强免疫前取小鼠尾血，间接ＥＬＩＳＡ法检测小鼠体内８－ＯＨｄＧ抗体。选取效价高的小鼠进行细胞融合实验。融合后每日观察，将细胞数量较多的培养基保存ＥＬＩＳＡ检测筛选阳性细胞株，用有限稀释法将细胞进行克隆，最终得到能够稳定分泌抗８－ＯＨｄＧ的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。小鼠腹水体内诱生法制备大量单克隆抗体，硫酸铵盐析法结合蛋白质Ａ亲和层析柱纯化法纯化腹水抗体。１．２．３阳性克隆抗体亚型鉴定结果及腹水效价测定　确定１Ｄ４、３Ｂ８、４Ｇ３、５Ｃ１０、８Ｅ９、７Ｄ５、８Ｄ９的抗体作为腹水生产细胞株，制备腹水小鼠７只，１０ｄ后收集腹水，行纯化和腹水效价检测。腹水单克隆抗体的效价以间接ＥＬＩＳＡ方法测定。其中选择了抗体效价较高的１Ｄ４（１：３２００００）和３Ｂ８（１：４０００００）抗体。其中１Ｄ４的亚型为ＩｇＧ１／κ，３Ｂ８的亚型为ＩｇＧ２ａ／κ。１．２．４配对抗体的筛选　釆用抗体类型及亚类鉴定ＥＬＩＳＡ试剂盒（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ公司），实验步骤按照试剂盒说明书操作，对已纯化到的抗体进行分型检

测，并以８－ＯＨｄＧ为抗原进行包被，间接ＥＬＩＳＡ法测

定抗体的效价。将鸟嘌呤（Ｇ）、鸟苷（ＧＲ）、８－羟基鸟

苷（８－ＯＨＧ）、尿素（Ｕ）分别作为包被抗原，

间接

ＥＬＩＳＡ法对抗体进行交叉反应性分析。１．２．５生物素－亲和素ＥＬＩＳＡ的方法的建立　制备３Ｂ８生物素化抗体，将２ｍｇ／ｍｌ的８－ＯＨｄＧ抗体１Ｄ４包被，１００μｌ／孔，用碳酸盐缓冲液包被抗体，４℃孵育过夜；洗板后，加入封闭液２００μｌ

／孔，室温封

闭２ｈ，洗板晾干；加入样本（１：１０００稀释）以及８－

ＯＨｄＧ标准品１００μｌ／孔加入９６孔板，室温孵１ｈ；加生物素化抗体３Ｂ８（１：４００００稀释），在洗板后１００μｌ／孔加入９６孔板，室温孵１ｈ；洗板后加入显色

液１００μｌ／孔，室温避光孵育１５ｍｉｎ

；加入终止液

１００μｌ／孔，反应３０ｍｉｎ内读取吸光度值（４５０ｎｍ）。１．２．６建立标准品　通过建立８－ＯＨｄＧ不同浓度之间与ＯＤ值的关系模型，从数学关系模型中选择线

性较好的部分进行Ｒ２值的计算，从而缩小８－ＯＨｄＧ

浓度检测范围并再次检测直至得到较高的Ｒ２值。

１．２．７回收率实验　利用回收率实验评价方法的精密度与准确度。取１份由８份血清混合的样品（市

售试剂盒检测３次平均浓度为９．５ｎｇ／ｍｌ）分成３等

份，分别加入３种不同浓度的８－ＯＨｄＧ抗原标准品

（浓度分别为７．５，１０，８ｎｇ／ｍｌ），检测其实际浓度（平

行检测３次平均值），计算回收率

。

１．２．８重复性实验　批内实验：将３份不同浓度（１０．３，７．５８，４．０６ｎｇ／ｍｌ）的血清样本（本室测得），在

同一酶标板上检测６次，检测得出３种血清浓度样

本的批内变异系数（ＣＶ）。批间实验：将３份不同浓

度（１０．３，７．５８，４．０６ｎｇ／ｍｌ）的血液样本（本室测得）