阿魏酸酯酶的研究与应用

结构预测及分子对接方法研究几种水解产物对新阿魏酸酯酶的抑制作用

Ｖ０１．３３　２０１２年８月　高等学校化学学报　ＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＪＯＵＲＮＡＬ　０Ｆ　ＣＨＩＮＥＳＥ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳ　Ｎｏ．８　１７８８～１７９３　

结构预测及分子对接方法研究几种水解产物对　

新阿魏酸酯酶的抑制作用　

程凡升　，张茂秋　，程凡杰　，生吉萍　，陈婧雨　，郑鄢燕　，申　琳　

（１．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京１０００８３；２．四川大学物理科学与技术学院，成都６１００４１；　３．中国人民大学农业与农村发展学院，北京１００８７２）　

摘要应用基于生物信息学的蛋白质结构预测方法，探讨了来源于荷斯坦奶牛瘤胃宏基因组文库的一个新　型阿魏酸酯酶（ＦＡＥ—ＳＨ１）的结构及可能的催化机制．同时通过对该酶的预测结构与４种模式底物的对接研　究发现，实验所测得酶促反应动力参数　与对接的亲和能存在线性关系，底物与酶形成的氢键可能是影响　催化效率的关键因素．同时，本研究发现Ｄ一木糖、　一阿拉伯糖、Ｄ．葡萄糖及阿魏酸能够对ＦＡＥ．ＳＨ１的水解反　应产生抑制作用，并对其进行了验证．　关键词阿魏酸酯酶；结构预测；分子对接；抑制作用　中图分类号Ｏ６４１　文献标识码Ａ　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５１－０７９０．２０１２．０８．０２８　

秸秆、麸皮等农业废弃物是农业生产和食品加工中产生的副产物，也是重要的可再生生物资源．　

这些生物材料主要由纤维素、木质素和半纤维素等成分组成．上述成分的化学性质稳定且相互形成致　密的交联结构，难以被微生物降解和利用…，因此一直以来没有被环保、高效及高值地加以利用．阿　

魏酸酯酶（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ　ｅｓｔｅｒａｓｅ，ＥＣ　３．１．１．７３）作为一种能够解离这种交联结构的水解酶，在食品、纺织、　

造纸和饲料等工业中具有非常广泛的应用前景　ｊ．但目前仅有部分真菌、少数细菌和极少数植物能　

够产生阿魏酸酯酶，且对该家族酶的分类及底物的利用特性一直存有争议　Ｊ．对新阿魏酸酯酶的发　

关于阿魏酸用于食品工业的论文

阿魏酸用于食品工业的论文

关于阿魏酸用于食品工业的论文

1阿魏酸的制备

1．1植物体内提取法

阿魏酸广泛存在于植物体内，当归、无患子、川穹、香兰豆、麦麸和米糠等植物中含量较多。植物体内的阿魏酸主要以三种形式存在：水溶态，脂溶态和束缚态。水溶态下的阿魏酸与一些小分子如单糖、多胺等结合呈易溶态，其主要存在于植物的细胞质中；脂溶态的阿魏酸常结合一些脂溶性的物质存在于植物的蜡质层中；在束缚态下，阿魏酸常以醚或酯的形式与植物细胞壁物质相结合。植物体内的阿魏酸主要以酯键与多糖和木质素交联或自身酯化或醚化形成二阿魏酸，一般可通过碱解法或酶解法打断酯键，再用合适的溶剂来提取。从植物中提取到的阿魏酸属纯天然物质，无毒无害，经过纯化就能直接应用于医药及食品工业，是目前要求较高的医用阿魏酸的主要来源。从植物中提取阿魏酸目前应用较多的主要有碱解法、阿魏酸酯酶法和植物组织培养法三种。

1．1．1碱解法阿魏酸在谷维素中主要以酯的形式存在，其易于水解，因此在从谷维素中提取阿魏酸时，可以先用碱水解谷维素，再对其进行酸化，其反应式如。该法制备阿魏酸，操作简易可靠，提取率较高，而且其产生的环木菠萝醇类等副产品具有很高的利用价值。邓红等以谷维素为原材料，利用响应面法优化碱水解制取阿魏酸的工艺。结果表明，利用谷维素用碱水解制取阿魏酸，其方法可靠、易行、得率较高。赵升强等［8］采用乙醇／水／氢氧化钠溶液从玉米麸皮中提取阿魏酸，解决了提取液粘度高而难以实现膜分离的问题。通过水解谷维素制备阿魏酸是目前比较常用的一种制备阿魏酸的方法。谷维素的来源广，易取得，产量高，成本较低，因此该方法可以广泛应用于工业化生产中。但是，该法提取阿魏酸后产生的废渣、废液容易造成环境污染，如何进行绿色化生产还需进一步深入研究。

1．1．2阿魏酸酯酶法阿魏酸酯酶是一种由真菌、细菌和酵母分泌的，能将低聚糖阿魏酸酯、阿魏酸甲酯和多糖阿魏酸中的阿魏酸游离出来的一。薛枫等将阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶进行混合，高效地降解了玉米麸皮，制备出阿魏酸和低聚木糖两种功能性食品原料，确定了酶的最适反应条件。在此条件下，阿魏酸的释放量比未经高温高压预处理时提高了1倍，还原糖的释放量提高了3倍。龚燕燕等利用宇佐美曲霉（Aspergillusus-amii）阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同降解小麦麸皮，制备了阿魏酸，得出阿魏酸酯酶与木聚糖酶之间存在协同作用，双酶共同作用，有利于小麦麸皮的降解，提高FA的释放率。阿魏酸酯酶法是一种通过天然的催化剂将阿魏酸衍生物从生物体内游离出来的一种方法。该法工艺简单、节能环保、条件温和、催化效率较高、专一性强，但基于该反应易受外界环境的影响，稳定性差，而且微生物除了会分解出阿魏酸酯酶，还会分解出一些其他物质，导致阿魏酸的降解，所以单独使用阿魏酸酯酶法提取阿魏酸的效果并不理想，而且难以达到工业化生产的目的。把该方法与其他多种高效的提取方法相结合，将成为今后的研究热点。

以磷酸二酯酶为主要靶点的阿魏酸抗阿尔兹海默病作用机制研究

越来越多证据表明,磷酸二酯酶（Phosphodiesterase,PDE）在学习和记忆过程中发挥了很大作用,其相应的抑制剂能通过调控细胞内环磷酸腺苷（cyclic

adenosine monophosphate,c AMP）含量来改善中枢神经系统退行性疾病所致的学习记忆障碍。因此寻找特异性PDE抑制剂是目前国内外各大药理实验室的研究热点。

我们近期的实验结果显示,阿魏酸（ferulic acid,FA）能调节PDE的表达及活性,从而影响生物体的各种代谢。但是FA是如何对PDE进行调控以及面对PDE这样一个庞大的超家族,FA是针对其中某一种亚型发挥特异性调节作用还是发挥非特异性PDE调节作用并不明确。

本项目通过现代分子生物学手段明确FA对PDE亚型表达有抑制作用,并对其下游信号通路具有调节作用,并在整体动物学实验上验证FA抗阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）样炎症作用与其对PDE的表达抑制作用密切相关。这些工作将不仅为AD的特异性靶向治疗提供安全有效的天然药物,同时也为FA的药理作用及机制深入研究提供理论支撑。

本课题展开了相关的研究工作,包括以下四个部分。第一,运用分子对接的方法模拟FA与PD4B2的相互作用。

分子对接结果表明,FA可与包括Tyr233、His234、Met347、Asn395、Phe414、Gln443、和Phe446在内的氨基酸残基发生强烈的相互作用,数据还表明,FA可进入PDE4B2的结合腔,并与氨基酸残基Phe446和Phe414形成ππ相互作用。在FA与氨基酸残基Gln443和His234之间可发现有氢键。 FA的构象位于疏水腔区域,表明FA与PDE4B2之间存在静电和疏水性相互作用。分子对接结果从理论上支持了FA对PDE4B酶活性及表达的潜在影响,表明FA可被用作基本结构来设计PDE4抑制剂,应进行进一步的研究来证实该相互作用。

阿魏酸临床应用有哪些

阿魏酸是一种重要的药物成分，其在临床上有着广泛的应用。本文将就阿魏酸的临床应用进行简要介绍，以便读者对该药物有更深入的了解。

一、消化系统疾病

阿魏酸在治疗消化系统疾病方面有着显著的效果。它可以帮助消化系统排出宿便，减轻腹泻和腹痛症状，改善食欲不振等问题。临床上常常将阿魏酸作为治疗消化系统疾病的药物之一。

二、调节神经系统

阿魏酸还可以调节神经系统的功能，改善神经衰弱、失眠等问题。它具有镇静和安抚作用，可以缓解病人的紧张情绪，帮助其放松身心，提高睡眠质量，从而使神经系统功能得到良好的恢复。

三、抗炎镇痛

由于阿魏酸具有较强的抗炎和镇痛作用，因此广泛用于治疗各种炎症性疾病，如风湿性关节炎、慢性胃炎等。它可以减轻疼痛感和炎症症状，帮助病人缓解疼痛，促进炎症的消退。

四、抗菌消炎

阿魏酸还具有一定的抗菌消炎作用，可以抑制细菌和真菌的生长，有助于预防和治疗感染性疾病。临床上将其广泛运用于治疗各种细菌感染和真菌感染引起的疾病，如呼吸道感染、皮肤感染等。五、其他方面应用

除了以上几个方面，阿魏酸还有诸多其他临床应用价值。例如在心血管系统、泌尿系统、免疫系统等方面都有着一定的应用。在整体药物治疗中，阿魏酸的作用不可或缺。

在临床应用中，医生会根据患者的具体病情和身体情况来决定是否使用阿魏酸，以及使用剂量和疗程。因此，在使用阿魏酸时，一定要遵医嘱，不可随意增减剂量或更改用药方式。

综上所述，阿魏酸作为一种重要的药物成分，具有较广泛的临床应用价值。通过合理使用，它能够为患者带来良好的治疗效果，提高生活质量。希望本文对阿魏酸的临床应用有所帮助，使读者对其有更深入的了解。

产阿魏酸酯酶乳酸菌对青贮饲料纤维降解、家畜消化及健康的影响及作用机制研究

摘要：

青贮饲料是一种常见的饲料形式，其含有丰富的纤维素和其他复杂碳水化合物，但由于其中的纤维素结构复杂，很难被家畜直接消化吸收。产阿魏酸酯酶乳酸菌作为一种常见的发酵剂被广泛应用于青贮饲料的处理中。本文通过对产阿魏酸酯酶乳酸菌在青贮饲料中的降解纤维素、家畜消化和健康方面的影响及作用机制进行研究。

第一部分：引言

青贮饲料是指将草料在高湿度条件下进行发酵保存的一种饲料形式。它的优点是能够保持饲料口感的新鲜度和营养水平，但纤维素的结构复杂使得其中的营养物质难以被动物消化吸收。为了提高青贮饲料的利用率，研究人员发现，产阿魏酸酯酶乳酸菌可以有效降解饲料中的纤维素，促进其中营养物质的释放和吸收。

第二部分：产阿魏酸酯酶乳酸菌的纤维素降解能力

产阿魏酸酯酶乳酸菌是一种能够分解纤维素的乳酸菌。在青贮饲料中添加产阿魏酸酯酶乳酸菌后，通过菌体产生的阿魏酸酯酶的作用，饲料中复杂的纤维结构可以被有效降解。该酶可以将纤维素分解为较小的低聚糖，提高饲料的口感和可消化性。

第三部分：产阿魏酸酯酶乳酸菌对家畜消化和健康的影响

通过降解纤维素，产阿魏酸酯酶乳酸菌可以增强饲料的可消化性，提高家畜对饲料的吸收能力。此外，产阿魏酸酯酶乳酸菌还可以改善家畜的消化道环境，促进有益菌群的生长，增强肠道功能。研究还表明，产阿魏酸酯酶乳酸菌能够提高家畜的免疫力，降低患病风险。

第四部分：产阿魏酸酯酶乳酸菌的作用机制

产阿魏酸酯酶乳酸菌的作用机制是通过其产生的阿魏酸酯酶对纤维素的降解。该酶可以裂解纤维素结构中的β-1,4-糖苷键，将纤维素降解为低聚糖，提高饲料的可消化性。同时，产阿魏酸酯酶乳酸菌还可以产生乳酸和有机酸，调节肠道环境，促进有益菌群的生长。

阿魏酸的合成和应用

摘要介绍了阿魏酸的结构、性质、合成方法,其中生物合成法具有广阔的开发和应用前景。阿魏酸因其独特而优良的药理活性在食品、保键品、化妆品、医药等方面有着广泛的用途。

关键词阿魏酸合成应用

阿魏酸(Ferulic Acid)的化学名称为4羟基3甲氧基肉桂酸,是桂皮酸(又称肉桂酸,3苯基2丙烯酸,分子结构如图1)的衍生物之一,阿魏酸最初在植物的种子和叶子中发现,是一种广泛存在于植物中的酚酸,在细胞壁中与多糖和蛋白质结合成为细胞壁的骨架,它在阿魏、当归、川芎、升麻、酸枣仁等中药材中的含量较高,是这些中药的有效成分之一,已经作为中成药的质量指标之一。在食品原料中,咖啡、谷壳、香兰豆、麦麸、米糠中阿魏酸含量也较高。近几年在药理药效方面的研究发现了许多阿魏酸及衍生物的药理作用和生物活性[1,2],且毒性较低,因而在医药、保健品、化妆品原料和食品添加剂等方面有着广泛的用途。

1 阿魏酸的结构和性质

阿魏酸有顺式和反式2种,分子结构式如图2。

顺式为黄色油状物,反式为白色至微黄色结晶物,一般系指反式体,相对分子质量194.19,熔点174℃,微溶于冷水,可溶于热水,易溶于乙醇、甲醇、丙酮,微溶于苯、石油醚,pH稳定性好,广泛存在于植物中。

2 阿魏酸的制备

2.1 植物提取

阿魏酸在植物体内以酯的形式存在,从植物体内提取时可通过先水解后提取,或者先提取后水解2种方式获得阿魏酸。当前可通过3条途径从植物中获得阿魏酸:一是从阿魏酸与一些小分子的结合物中获得;二是从植物细胞壁中获得;三是通过组织培养获得。

谷维素中含有阿魏酸的结构单元,以酯的形式存在,且易于水解,因此可以先用碱水解谷维素,再用酸化的方法制备阿魏酸,其反应式[3]见图3。

水解谷维素制备阿魏酸的操作方便,收率高达85.7%,副产品ROH为环木菠萝醇类,在医药方面有实用性。而且谷维素来源广、产量大,并且价格适中,所以该法具有一定的工业化生产价值。

阿魏酸的研究进展

【摘要】介绍近年来阿魏酸的研究现状，主要从从阿魏酸的理化性质、功能、制备方法、分析方法及应用等方面进行了综述。

【关键词】阿魏酸功能应用

阿魏酸是普遍存在的一种酚酸，在植物细胞壁中，与多糖和木质素交联构成细胞壁的一部分，是阿魏、当归、川芎、升麻等中药的有效成分之一，因其具有较强的抗氧化活性和防腐作用而被广泛应用于医药、农药、保健品、化妆品原料和食品添加剂方面。近几年来，在其生理活性方面广泛深入地研究，发现阿魏酸及其衍生物具有抗血拴、降血脂、消炎、防癌等生物活性，激起了有关学者的兴趣。有关研究证实，阿魏酸主要有两种衍生物，即阿魏酸钠和阿魏酸酯，这两种衍生物基本上体现和保持了阿魏酸的生物学特性。

1 阿魏酸的理化性质

阿魏酸是桂皮酸的衍生物之一，有顺式和反式两种，顺式为黄色油状物，反式为白色至微黄色结晶物，一般系指反式体，相对分子质量194．19，熔点174℃。阿魏酸微溶于冷水，可溶于热水，水溶液中稳定性差，见光易分解，易溶于乙醇、甲醇、丙酮，难溶于苯、石油醚，pH稳定性好。

2 阿魏酸的功能

2.1 抗氧化生命机体时刻都会遭受内源或外源性活性氧类的侵袭，从而诱发一系列疾病，如动脉粥样硬化、癌症、白内障等；同时，皮肤衰老、皱纹的产生以及色斑、老年斑的形成也与自由基有着密切的联系，因此抗氧化损伤净化自由基是防治这些疾病的关键［1］。研究表明，阿魏酸具有很好的抗氧化活性，对过氧化氢、超氧自由基、羟自由基、过氧化亚硝基都有强烈的清除作用［2］。

阿魏酸不仅能猝灭自由基，而且能调节人体生理机能，抑制产生自由基的酶，促进清除自由基的酶的产生。据报道，阿魏酸能大大增加谷胱甘肽转硫酶和醌还原酶的活性，抑制酪氨酸酶活性，并能与膜磷脂酰乙胺结合，保护膜脂不受自由基的侵袭［3］。

阿魏酸因其强氧化能力和能抑制酪氨酸酶活力的作用而受到化妆品行业青睐，但其中还有另外一个原因就是阿魏酸在290～330nm附近有良好的紫外线吸收，而在305～310nm的紫外线最容易诱发皮肤色斑。所以，阿魏酸可抑制皮肤衰老、减少色斑生成以及美白皮肤，从而在化妆品中得到广泛应用［4］。

阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的表达及在啤酒中的应用研究

阿魏酸酯酶是能够水解植物细胞壁中以酯键连接在多糖侧链上的阿魏酸的一类水解酶,能与纤维素酶及木聚糖酶等协同作用,彻底降解植物半纤维素并释放阿魏酸,在造纸、纺织、饲料、食品和生物能源等领域有着广阔的应用前景。近年来,对产阿魏酸酯酶工程菌的研究取得了长足进展,但阿魏酸酯酶产量低的问题依然是限制其工业化应用的关键。

本研究通过基因的克隆表达及密码子优化,获得一株性能优良、高产阿魏酸酯酶的毕赤酵母工程菌,并将该酶应用于啤酒酿造过程中,改善麦汁过滤性能和抗氧化能力,提高小麦啤酒典型风味物质4-乙烯基愈创木酚（4-VG）的含量。根据GenBank数据库中收录的黑曲霉阿魏酸酯酶基因序列,设计引物从黑曲霉基因组中扩增得到不含信号肽及内含子的阿魏酸酯酶基因,并对该目的基因进行毕赤酵母密码子偏好性“一对一优化”和“随机优化”,化学合成优化后基因,构建重组表达载体pPICZαA-AnfaeA,pPICZαA-op Anfae A I和pPICZαA-opAnfae A II。

转化毕赤酵母X-33中构建酵母工程菌,诱导表达后基因“一对一优化”和“随机优化”的重组酶酶活力分别为5.2±0.1 U·mL-1和39.9±0.1

U·mL-1,“随机优化”后酶活力比优化前提高了近6倍。通过单因素实验及正交实验,确定了最优发酵条件:诱导培养基pH为7.0,3%（v/v）的接种量,1%（v/v）的甲醇浓度,30℃培养4.5 d,最终酶活力可达到49.8

U·mL-1,发酵液酶活力比优化前提高了24.8%。

亲和色谱分离纯化后,对重组阿魏酸酯酶酶学性质研究,其最适反应pH为5.5,pH 4.5-7.0范围内酶的稳定性较好,35℃保温60 min,仍能保持80%以上的酶活力;该酶的最适反应温度为50℃,40℃-60℃范围内酶活力较高,45℃保温120 min,仍能保持90%以上的酶活力。金属离子及EDTA对该酶活性影响较小,其中Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+对该酶活性有促进作用,而Fe2+、Co2+、Mn2+和EDTA对酶活性有抑制作用。

一种阿魏酸衍生物饲料添加剂的制备方法及其应用

阿魏酸是一种重要的生物活性化合物，具有多种药理活性。在动物饲料中添加阿魏酸衍生物可以提高饲料的营养价值，促进畜禽生长，改善免疫功能等。本文将介绍一种阿魏酸衍生物饲料添加剂的制备方法及其应用。

一、阿魏酸衍生物的制备方法

1.阿魏酸提取

阿魏酸是一种自然产物，主要存在于一些植物中，如阿魏根。可以通过药用植物的提取工艺获得阿魏酸。首先将阿魏根进行粉碎，然后采用适当的溶剂（如乙醇、乙醚）进行提取，得到含有阿魏酸的提取液。接着，对提取液进行浓缩，去除溶剂，得到阿魏酸的浓缩物。

2.阿魏酸衍生物的合成

阿魏酸具有多个官能团和不饱和结构，因此可以通过化学合成的方法获得其多种衍生物。例如，可以将阿魏酸与特定的官能团化合物进行反应，生成相应的衍生物。具体的衍生物种类包括酯类、醚类、酰胺类等。这些阿魏酸衍生物可以根据其不同的化学结构和性质，应用于不同类型的饲料中，以实现不同的功能效果。

3.阿魏酸衍生物的纯化

合成得到的阿魏酸衍生物通常为混合物，需要进行纯化工艺，以获得纯度较高的产品。通常采用色谱、结晶、再结晶等方法进行纯化。这样可以得到纯净的阿魏酸衍生物，确保其在饲料中的应用效果。

二、阿魏酸衍生物饲料添加剂的应用

1.促进动物生长

阿魏酸衍生物可以作为生长促进剂应用于动物饲料中。其具有激活代谢、促进脂肪酸氧化等作用，能够提高动物的生长速度和饲料转化率。在生猪、肉鸡、肉牛等畜禽养殖中，通过添加适量的阿魏酸衍生物，可以有效提高养殖效益。

2.改善饲料营养价值

阿魏酸衍生物具有一定的抗氧化和抗炎作用，可以帮助动物抵抗应激和疾病，改善消化吸收功能。同时，它还可以调节胃肠道微生态平衡，增强动物肠道健康。因此，添加阿魏酸衍生物可以改善饲料的营养价值，提高动物对饲料的利用率。

3.提高免疫功能

阿魏酸衍生物还具有调节免疫功能的作用。通过激活免疫细胞、增强抗体产生等机制，可以提高动物的免疫力，减少发病率，降低兽医成本。因此，在动物饲料中添加适量的阿魏酸衍生物，可以帮助动物建立健康的免疫系统。

阿魏酸酯酶活测定

1. 5 阿魏酸酯酶活力的测定

取250 μL 粗酶液于2 mL 离心管中, 于50 ℃保温 5 min;

然后,加入250μL 一定浓度的阿魏酸甲酯溶液,反应10 min, 再加入体积比为10%的 500 μL 的冰乙酸终止反应.样品离心后于4℃保存,用高效液相色谱( HPLC)法测定样品中的阿魏酸含量.空白样品中冰乙酸在反应前加入,其他处理同上.

1. 3 阿魏酸酯酶酶活定义及测定

阿魏酸采用高效液相色谱法测定. 取250 μL 离心后的发酵上清液加入到250 μL 阿魏酸甲酯溶液中, 50℃保温15 min,

加入500μL体积分数为10%的冰乙酸.样品于离心机( 10000r/

min) 离心15 min, 于4℃下保存. 空白样品为煮沸失活的发酵上清液, 处理方法同上.阿魏酸酯酶的酶活定义:在50℃, pH 值为 6.0 的条件下,每分钟酯解阿魏酸甲酯,生成1μmol 阿魏酸所需的酶量。

1.4 酶活性测定

酶解底物为除去蛋白质和淀粉后的麦麸、玉米麸皮和蔗渣。蛋白质和淀粉的去除按欧仕益等的方法进行，烘干，粉碎，过80目。

酶活性测定：取酶液 30mL于试管中，于40℃恒温水浴中震荡(将振荡器置于水浴中)保温 5min，加入酶解底物 1g，反应

15min，沸水浴终止反应。将酶液离心，取上清液稀释到适当倍数测定空白(酶液)与酶解后的还原糖和阿魏酸含量。计算酶活时减去酶液中原有的阿魏酸和还原糖。

阿魏酸含量的测定：植物材料中的阿魏酸含量按欧仕益等的方法进行。发酵液和酶解液中的阿魏酸含量采用以下方法测定：在待测液中加入乙醇至终浓度为 80%，摇匀、离心，采用分光光度法在320nm 下测定阿魏酸含量。

还原糖的测定：将反应液稀释到适当倍数，采用DNS法—3,5-二硝基水杨酸比色法在560nm下测定还原糖含量。

1. 3 阿魏酸及阿魏酸酯酶酶活测定

阿魏酸的测定采用HPLC法样品液3470×g离心20min后取