完整版荧光漂白恢复技术
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP 荧光漂白后恢复(FRAP
Fast limit: cytoplasm Slow limit: membrane bound
Suggests barriers (cristae) need to be large
Occlude 90% space
Verkman, TIBS, 2019
Size dependence of dextrans (polysaccharides) diffusion in solution
2000 Nature Cell Biology)
Experimental Setup
• Laser beam focused or through small field diaphragm
• Rapid shutter to switch from high powered beam for bleach to attenuated beam for recovery same power won’t work-Keep bleaching)
• Now can be done with laser scanning confocal instruments. (for some cases-e.g. membranes)
Idealized photobleaching data
Y = mobile fraction X
D =w2/4D
Diffusion of membrane components can be seen as a two dimensional diffusion problem
• Membrane is modeled as infinite plane
• Viscosity of the lipid bilayer is ~ 2 orders of magnitude higher than water
荧光漂白恢复技术PPT
Methods 1.Cell culture
Norden laboratory feline kidney (NLFK) and HeLa cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Paisley, UK)at 37℃ in the presence of 5% CO2.
（1）注意实验温度的控制。 （2）漂白区域大小的选择和荧光恢复检测时间的长短要根据具体情况而 定。 （3）激发光的波长和强度应不会使细胞严重损伤；尽量减少漂白前和漂 白后的荧光淬灭。
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FRAP技术的不足之处
第一,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能 观察单个蛋白的移动。 其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部 条件的限制。
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530–600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1–2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were measured by bleaching fixed cells (Fig. 1). ImageJ [32] was then used to construct an average shape and intensity profile of that region.
荧光漂白恢复_荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点
ZHONGGUO YIXUEZHUANGBEI于 淼① 高 建①[文章编号] 1672-8270(2009)06-0008-02 [中图分类号] R 197 [文献标识码] BCharacteristics of application and technology on FRAP , FRET and FCS/Yu Miao , Gao Jian//China Medical Equipment,2009,6(6):8-9.[Abstract] Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), fluorescence resonance energy transfer (FRET) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) are three experimental techniques based on the fluorescence analysis that are commonly used to study molecular interaction. In this article, we will discuss and compare the application and technical specifications for FRAP , FRET and FCS.[Key words] FRAP; FRET; FCS; Fluorescence Analysis[First-author's address] Laboratory Center, China Medical University, Shenyang 110001, China.荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点[摘要] 荧光漂白恢复(FRAP)、荧光共振能量转移(FRET)和荧光相关光谱(FCS)是三种以荧光为基础的检测技术，常用来研究分子间相互作用。
高中生物第3章细胞的基本结构知识点总结归纳完整版(带答案)
高中生物第3章细胞的基本结构知识点总结归纳完整版单选题1、荧光漂白恢复技术在细胞生物学中有着非常重要的应用，包括三个步骤：将绿色荧光蛋白共价结合在膜蛋白上，细胞膜呈现一定强度的绿色；激光照射淬灭（漂白）膜上部分区域绿色荧光，被照射部分荧光蛋白将不会再发出荧光；检测淬灭部位激光照射前后荧光强度的变化情况。
实验过程如图甲，结果如图乙。
下列说法错误的是（）A．图乙结果说明细胞膜具有流动性B．应用该技术可以测定膜上单个蛋白质的流动速率C．降低实验温度，漂白区域荧光强度恢复到F2的时间将延长D．理论分析，漂白区域恢复足够长的时间荧光强度F2仍小于F1答案：B分析：分析图甲，膜上的蛋白质被绿色荧光染料染色后，激光会使膜部分淬灭，过段时间后，淬灭部位再次出现绿色荧光。
分析图乙，再次出现的荧光强度F2略低于F1。
细胞膜主要由蛋白质、脂质和少量糖类组成。
磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架。
细胞膜的结构特点：具有流动性（膜的结构成分不是静止的，而是动态的）。
细胞膜的功能特点：具有选择透过性。
A、淬灭部位荧光能够再现，正是由于细胞膜具有流动性，才使得其他部位有荧光的蛋白质移动到淬灭部位，A正确；B、淬灭部位荧光再现，是膜蛋白分子运动的综合表现，应用该技术不能测定膜上单个蛋白质的流动速率，B 错误；C、降低实验温度，膜的流动速度减慢，漂白区域荧光强度恢复到F2的时间将延长，C正确；D、激光照射淬灭（漂白）膜上部分绿色荧光，该部分荧光不可恢复，因此，漂白区域恢复足够长时间后，其荧光强度F2小于漂白前的荧光强度F1，D正确。
故选B。
2、高尔基体是由数个扁平囊泡构成的高度有极性的细胞器，在具有分泌功能的细胞中含量丰富。
分布于内质网与细胞膜之间，呈弓形或半球形，凸出来的一面对着内质网称为形成面，凹进去的一面对着细胞膜称为成熟面，形成面和成熟面都有一些或大或小的运输囊泡。
下图为某细胞完成生理活动示意图，甲、乙表示高尔基体囊腔，①②表示运输囊泡，下列相关叙述正确的是（）A．该细胞受抗原刺激后可增殖分化B．①囊泡是由高尔基体形成面形成C．②囊泡可由高尔基体成熟面形成D．抗体在甲腔合成，在乙腔加工成熟答案：C分析：分析题图：图示细胞能产生抗体，为浆细胞。
基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验方法建立
文章编号：2095－6835（2022）05－0133－05基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验方法建立＊曹慧珍，王瑾瑜，王文娟（清华大学生物医学测试中心尼康生物影像中心，北京100084）摘要：发展了基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复（TIR/FRAP）的成像方法，该方法通过全内反射显微镜（TIRFM）和激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的联合使用，将全内反射荧光成像和荧光漂白后恢复技术相结合，可广泛用于研究质膜附近分子动力学特征。
LSCM对任意感兴趣区域（ROI）执行光漂白，TIRFM特异性采集漂白前后细胞质膜附近的荧光信号，通过NIS-Elements软件程序实现显微镜模式间的自动快速切换。
相比目前通用的基于全内反射的光漂白方法，这种方法具备灵活可变漂白区域的优势，可以满足大多数的基于全内反射的光漂白后恢复实验需求。
同时，这种技术方法也为开发TIRFM或LSCM与其他设备的联用方法奠定了实践基础。
关键词：全内反射显微镜；荧光漂白后恢复；自动切换；感兴趣区域中图分类号：Q336文献标志码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2022.05.041全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）特异性地照亮盖玻片/样品界面附近的荧光团，抑制来自细胞更深层的背景[1-2]，广泛应用于质膜附近的生物过程研究中，例如细胞粘附位点、囊泡胞吐和内吞作用或内质网/质膜接触位点等[3-4]。
荧光漂白后恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP）技术是研究分子迁移特性的技术。
基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验（Total Internal Reflection/Fluorescence Recovery After Photobleaching，IR/FRAP）将TIRFM和FRAP技术相结合，测量盖玻片/样品界面分子的动力学数据，是研究质膜附近分子动力学的有力工具[5]。
显微成像方法与技术2-1
激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）在荧光显微
镜成像基础上加装激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或可见光激发 荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察Ca 、 pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科 学、药理学、遗传学等领域中强有力的研究工具。 随着计算机、光学显微镜、大数值孔径物镜、高分辨率分析显示、激光源、激光功率 、高敏感度探测器、声光转换电子控制和各种荧光标记物的发展，使得LSCM向更精、
荧光显微镜与激光共聚焦显微镜的区别
non confocal
confocal
激光共聚焦扫描显微镜的特点
1. 可对样品进行非侵入性无损断层扫描，即“光切片”（optical sectioning），最薄可达 0.28微米； 2. 可三维重建，重现立体图像，还可在不同的观察方向对不同深度层次的样品成象；
激光扫描共聚焦显微镜的功能
1.无损伤光学切片，显微“CT”：共聚焦成像利用照明点与探测点共轭这一特性，可有效 抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，从而获得普通光镜 无法达到的分辨率，同时具有深度识别能力（最大深度一般为200~400µ m）及纵向分辨率， 因而能看到较厚生物标本中的细节。 植物细胞原生质体的显微“CT”
受体漂白技术
荧光受体漂白技术是用来验证两种荧光生色团之间有无FRET发生的的技术。以CFP/YFP为 例，当CFP和YFP靠近到一定程度，如果要验证他们之间有无FRET发生时，可以514nm激光
特异性的激发YFP（FRET受体）荧光，使之发生光漂白，那么此时如果观察到CFP的强度有
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP 荧光漂白后恢复(FRAP
x
Verkman, J. Cell Biology 2019
Heavy dextrans very slow Mobile fraction low: binding More polarizable
FRAP in Cytoplasm
J D
x
• Problem is much more complicated because of three dimensional freely diffusing geometry.
NNNooA way of understanding diffusion: Fick’s Law J D x
age • Jisflux • D is diffusion constant • is concentration
Diffusion Constant: What controls it?
A way of understanding diffusion: Random Walk
Spread of molecules from one spot is proportional to square root of time for random walk. Therefore, to go 2X as far takes 4X as long.
Spot Photobleaching
•Bleach and monitor single diffraction limited spot •Assumes infinite reservoir of fluorescent molecules (hole can fill back in) •Use D = w2/4D to obtain D •Determine w = nominal width of Gaussian spot by other optical method 1/e2 point •Fit fluorescence recovery curve to obtain D
荧光剂的增白原理
荧光剂的增白原理
荧光增白剂是一类常用的增白剂，主要用于制造洗涤剂、纺织品、塑料、涂料、油墨、粘合剂等产业，它可以使这些物品表面呈现出更加明亮、清洁的效果。
那么，荧光增白剂
的增白原理是什么呢？
荧光增白剂是一种含有芳香族或非芳香族羰基化合物的有机分子，在紫外光照射下会
发生荧光现象。
这种荧光现象是一种特殊的分子光物理过程，原理是分子吸收紫外光，激
发其电子从基态到激发态的跃迁，之后返回基态释放出热能和荧光光子。
荧光光子的波长
比吸收光子的波长长，因此造成普通灯光下看上去更加白亮。
荧光增白剂在实际应用中，会将还原性物质还原为氧化物，从而增强物体的白度。
这
一过程可以用以下反应式表示：
化学反应：荧光增白剂 + 还原性物质→ 还原后的化合物 + 氧化后的荧光增白剂
还原性物质可以是蓝色色素、黄色色素等，它们通常会降低衣物、塑料等物品的白度。
荧光增白剂在和这些还原性物质反应过程中，可以将它们还原为氧化物，从而使物品表面
呈现更加明亮的白色。
此外，荧光增白剂还可以借助于表面活性剂的作用，将荧光增白剂分散在洗涤剂、油墨、涂料等物品表面，从而提高增白效果。
总的来说，荧光增白剂的主要增白原理是利用荧光现象和氧化还原反应来增强物品表
面的白度。
这种化学反应可以有效地加强洗涤剂、塑料等化工产品的增白效果，为我们的
日常生活带来更加清洁、明亮的感受。
FRAP
Date
1.1
FRAP
Proteins moving within the cell nucleus
Investigation of 3 different proteins involved in essential nuclear functions TCS SP at the University of Maryland, USA Measurement of kinetic Properties of proteins using photobleaching techniques Bleaching: A defined area of a living cell is bleached by a single, high-powered spot laser pulse of 250ms (beampark). Recovery of fluorescence in the bleached area is recorded by Sequential imaging scans. It is shown that proteins move rapidly thoughout the nucleus
FRAP
Date
1.1
Flymode FRAP for highest synchronized time resolution Live Date Mode enable interactive physiological analysis
FRAP
Date
1.1
Basic Principle of FRAP
FRAP
Date
1.1
荧光光漂白后的恢复：FRAP
细胞间隙连接（Gap Junction，GJ)是目前被认为能进行细胞间物质和信息 直接交流的 细胞间连接形式，它参与的 这种物质与信息交流被称为由 间隙连接介导的细胞间通讯（gap junction intercellular communication,GJIC). GJIC的生物学作用： GJIC可协调不同细胞、组织间的代谢或电传导，使各种信息有效地到达相应 的细胞、组织。 GJIC与胚胎发育、细胞分化过程有密切关系。 GJIC对于细胞的生长控制十分重要。 GJIC与细胞凋亡过程有密切的关系。
细胞生物学名词解释
细胞生物学名词解释细胞生物学研究方法1.冰冻蚀刻技术：将样品快速低温冷冻，在低温下进行断裂，然后用金属和碳喷镀，再用消化液把样品本身消化掉，收集复型膜于载网上进行电镜观察，常用于研究生物膜。
2.荧光漂白恢复技术：用高能激光束照射，使特定区域的荧光发生不可逆的淬灭，经过一段时间后，光漂白区域的荧光逐渐恢复到初始状态。
3.负染色：用重金属盐对电镜样品进行染色的技术，使得重金属盐沉积在样品周围，而样品不被染色，从而衬托出样品的精细结构。
细胞质膜1.血影（blood ghost）：红细胞经低渗处理后质膜破裂，释放出血红蛋白和胞内其他可溶性蛋白，这时红细胞仍保持原来的形状和大小，这样的结构成为红细胞影，简称血影。
2.“成斑”“成帽”现象：是监测细胞膜流动性的一种技术。
当荧光抗体标记细胞的时间达到一定长度，已均匀分布在细胞表面的标记荧光会重新分布，聚集在细胞表面的某些部位，称为“成斑”现象，进而聚集在细胞的一端，称为“成帽”现象3.脂质体：是根据磷脂分子在水相中形成稳定的双层脂分子球的趋势而制备的人工膜。
4.流动镶嵌模型：细胞膜由流动的双脂层和嵌在其中的蛋白质组成。
磷脂分子以疏水性尾部相对，极性头部朝向水相组成生物膜骨架；蛋白质或嵌在双脂层表面，或嵌在其内部，或横跨整个双脂层，表现出分布的不对称性。
物质的跨膜运输1.主动运输：一种需要消耗能量的物质跨膜运输过程。
被运输的物质与跨膜载体蛋白结合，通过载体蛋白构象改变，从而将底物逆着电化学梯度转运到膜的另一侧。
2.钙泵：在肌细胞的肌质网膜上含量丰富的跨膜转运蛋白，属于P型离子泵，利用A TP水解释放的能量将Ca2+从细胞质基质泵到肌质网内。
每消耗1个A TP，从细胞质基质泵出2个Ca2+。
3.Na+-K+泵：即Na+-K+A TPase，是镶嵌在细胞膜中具有A TP酶活性的主动转运Na＋、K＋的蛋白质。
由2个α亚基和2个γ亚基组成，β亚基不能直接参与离子跨膜运动，但帮助新合成的α亚基进行折叠。
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（fluorescence recovery after photobleaching ，FRAP）
09生物 季刚 裴家平
FRAP关键技术简介
?FRAP是用来测定活细胞的动力学参数。 ?FRAP是上世纪70年代开创的利用荧光标记法研究活体细胞中各类分子迁
移特性的技术。 ?当前生命科学研究已进入分子水平，应用多种手段已获得大量关于细胞内
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530 –600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1 –2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were
分子的定性知识，基本了解了各细胞器的分子组成，找到许多在细胞生命 周期中发挥重要作用的蛋白质，确认了许多重要蛋白质之间相互作用的存 在并初步描绘出一些信号通路。 ?但细胞的各种生物学功能和现象都是借助相关分子实现的，当前的研究重 点和难点就集中于解答分子实现各种功能的机制。 ?这就需要掌握活细胞生理状态下分子运动的各种信息，近年来发展的一些 技术手段为获得有关重要信息提供了有力的工具， FRAP技术就是其中一 种重要方法。
示于图2.11。
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漂白以后恢复过程荧光强度的变化 示于图2.13。
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漂白区域在漂白前后的荧光强度 随时间的变化示于图 2.14。
说明：细胞膜具有流动性， 膜表面上Fc受体能够迁移。
Protein Diffusion in Mammalian Cell Cytoplasm
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FRAP原理
?In FRAP, a region of the cell is exposed to high-intensity laser light, causing the fluorophores within that region to irreversibly lose their ability to fluoresce. Recovery of fluorescence in that region yields information about molecular diffusion and binding in the cell.
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FRAP技术的基本要求
?选择合适的荧光探针 ?具备精确可控的激光激发和荧光检测设备
激光扫描共聚焦显微镜
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FRAP 的三个阶段
漂白前
漂白
漂白后恢复
用尽可能弱的 激光扫描全细胞
使用强激光在短时 间内扫描漂白区域
用尽可能弱的 激光扫描全细胞
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注：
?漂白前和漂白后恢复都用尽可能弱的激光扫描全细胞，目的是 得到扫描图像而不引起荧光淬灭，
?漂白阶段则使用强激光在短时间内扫描漂白区域，目的是使区 域内的荧光全部淬灭。
?在整个过程中，监测漂白区域在各时间段的荧光强度变化并绘 制曲线，从恢复曲线及其数据就可以得到关于分子迁移速率、 动态分子比例等信息。
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FRAP 实验注意事项
?做FRAP实验还应当注意以下几点，否则就易得到错误结果。 ? （1）注意实验温度的控制。 ? （2）漂白区域大小的选择和荧光恢复检测时间的长短要根据具体情况而
定。 ? （3）激发光的波长和强度应不会使细胞严重损伤；尽量减少漂白前和漂
白后的荧光淬灭。
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FRAP 技术的不足之处
?第一,它只能检测膜蛋白的群体移动 ,而不能 观察单个蛋白的移动。
?其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部 条件的限制。
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FRAP 的应用
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（PLoS ONE |August 2011 | Volume 6 | Issue 8 | e22962 ）
?Methods 1.Cell culture
Norden laboratory feline kidney (NLFK) and HeLa cells were grown in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Paisley, UK)at 37℃ in the presence of 5% CO2.
荧光漂白恢复测定巨噬细胞 Fc 受体的荧光恢复率和运动分数
（山东大学硕士学位论文《荧光漂白恢复测定巨噬细胞 Fc 受体的流动性》，李建业， 2005.5 ）
?采用Alexa 488 标记的羊抗鼠IgG间接标记巨噬细胞Fc受体，用激光共聚 焦系统的强脉冲激光漂白，弱强度激光扫描，光电倍增管 (PMT)检测， Fluoview 软件记录数据并分析处理。