ABO血型正、反定型
abo血型系统定型原则和实验方法
abo血型系统定型原则和实验方法
ABO血型系统定型原则是利用凝集试验技术，通过正定型（红细胞定型）和反定型（血清定型）两组试验来准确鉴定ABO血型。
具体步骤如下：
1. 正定型：取75×12mm干净小试管2支，分别标记抗A、抗B。
按标记滴加抗A、抗B试剂血清1滴。
再各滴加3-5%待检者红细胞悬液1滴，混匀。
2. 反定型：取75×12mm干净小试管3支，分别标记A细胞、B细胞、O 细胞。
3管各滴加待检者血清1滴。
按标记分别滴加混匀的A型、B型、O 型试剂红细胞1滴，混匀。
5管同时2档（3400转/分-15秒）离心。
3. 轻轻摇动试管，观察反应结果。
对于结果解释，如果被检红细胞膜上有与该试剂血清抗体相对应的抗原，或者被检血清中有与该试剂红细胞抗原相对应的抗体，则为阳性，即凝集为阳性。
如果不凝集，则为阴性。
以上是ABO血型系统定型原则和实验方法，仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。
血型正反定型不符及其原因
血型正反定型不符及其原因除对新生儿只检测其红细胞抗原，即只进行正定型外，临床常规检测A BO血型，必须正反定型，正定型是检测红细胞抗原，反定型是检测血清中抗体，判定ABO血型，结果相符。
病人或者献血者（待输血液）ABO正反定型结果不相符合，要详细记录实验，不能确定ABO血型，记录该标本血型结果有疑问。
如果是待输血的标本，该袋血就不能发出使用，应换一袋正反定型相符的血液，或者在时间允许情况下，重新进行试验，如确定是否试验操作错误等原因，即已经明确该袋血ABO正反定型相符，可以重新考虑使用该袋血。
除此之外，不管是什么原因，只要是ABO正反定型不符的血，都不能用于临床输血。
如受血者（病人）标本ABO正反定型不符，必须首先为该受血者准备RhD同型的O型血，以应病人治疗急需。
然后进行研究，查找该受血者ABO正反定型不符的原因。
ABO血型正反定型结果不相符合的原因可能是因为实验操作者本身技术上的错误所造成，也可能是由受检的血液标本问题所致。
（1）实验者操作或技术错误1）假阴性结果：①试管中没有加入抗体试剂或血清，只加入了红细胞。
②没能识别溶血也是阳性反应。
③血清或试剂与红细胞比例不当。
④离心速度、时间不够。
⑤使用了失效的或错误的抗体或/和红细胞试剂。
⑥试验结果记录和解释错误。
2）假阳性结果：①离心速度过大和离心时间过长。
②使用了受到细菌污染的抗体试剂、红细胞试剂或生理盐水。
③使用不干净的玻璃试管等试验器皿。
④试验结果记录和解释错误。
（2）血液标本的问题1）纤维蛋白聚集的红细胞小凝块被误认为是血液凝集，或血浆标本或未完全消除纤维蛋白影响的的血清标本，易出现小凝块，可能被误判为红细胞凝集。
2）出现混合视野凝集现象，病人血液中不只是一个ABO血型的红细胞，如将O型红细胞，或O型造血细胞输给A型人。
病人接受了ABO血型不相容的骨髓细胞移植，并产生了耐受。
比如，A型病人接受了O型人的骨髓后，血循环中有O型红细胞，但血清中只存在抗-B。
ABO血型鉴定标准操作规程
ABO血型鉴定标准操作规程1.检验原理：根据红细胞上有或无A抗原或／和B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型4种。
可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。
所谓正定型，是用已知抗—A和抗—B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或／和B抗原；所谓反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗—A或／和抗—B。
2.试剂和材料：1、抗—A（B型血）、抗—B（A型血）及抗—A十B（O型血）分型血清，2、5％A、B及O型试剂红细胞盐水悬液。
3、受检者血清；4、受检者5％红细胞盐水悬液。
3.方法3.1.试管法（1）取洁净小试管（内径10mm×60mm）3支，分别标明抗—A、抗—B和抗—A十B，用滴管分别加抗—A、抗—B和抗—A十B。
分型血清各l滴于试管底部，再以滴管分别加入受检者5％红细胞盐水悬液1滴，混合。
（2）另取洁净小试管（内径10mm×60mm）3支，分别标明A、B和O细胞。
用滴管分别加入受检者血清l滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B和O型5％试剂红细胞悬液l滴，混合。
（3）立即以1000r／min离心lmin。
（4）将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以肉眼观察有无凝集（或溶血）现象。
如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。
（5）观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B或cisAB的发现。
（6）凝集强度判断标准4十红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。
3十红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。
2十红细胞凝块分散成许多小块，见到游离红细胞。
1十肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞土镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞MF 混合凝集外观（mixed field）是指镜下可见少数红细胞凝集，而绝大多数红细胞仍呈分散分布。
一表示阴性，镜下未见凝集，红细胞均匀分布。
3.2.玻片法（1）取清洁玻片1张（或白瓷板1块），用蜡笔画成方格，标明抗-A、抗-B 和抗-A十B，分别用滴管滴加抗-A、抗-B和抗-A十B分型血清 l滴于标明的方格内，再各加受检者2％红细胞悬液1滴，混合。
ABO血型鉴定正反定型试验方法
ABO血型鉴定正反定型试验方法正定型试验是通过将被测血清与已知的A和B抗原的红细胞混合反应来确定被测血型。
具体步骤如下：1.准备供试者的血液样本。
采集一个血液样本，可以是静脉血或者指尖血。
2.分别将供试者的血液样本分为两个离心管中。
在两个离心管中加入等量的稀释液，使血液与稀释液比例为1：2，充分混合。
3.在一个离心管中加入已知含有A抗原的红细胞悬液，同时在另一个离心管中加入已知含有B抗原的红细胞悬液。
充分混合。
4.将两个离心管分别离心，离心后可观察到两个离心管中红细胞的沉淀情况。
5.如果被试者的血清与含有A抗原的红细胞混合后沉淀，说明被试者具有B血型。
如果与含有B抗原的红细胞混合后沉淀，说明被试者具有A 血型。
如果与两者都沉淀，说明被试者具有AB血型。
如果与两者都未发生沉淀，说明被试者具有O血型。
反定型试验是通过将被测血清与已知的A和B型抗体的红细胞混合反应来确定被测血型。
具体步骤如下：1.准备供试者的血液样本。
采集一个血液样本，可以是静脉血或者指尖血。
2.分别将供试者的血液样本分为两个离心管中。
在一个离心管中加入已知含有A型抗体的红细胞悬液，同时在另一个离心管中加入已知含有B 型抗体的红细胞悬液。
充分混合。
3.将两个离心管分别离心，离心后可观察到两个离心管中红细胞的沉淀情况。
4.如果被试者的血清与含有A型抗体的红细胞混合后沉淀，说明被试者具有B血型。
如果与含有B型抗体的红细胞混合后沉淀，说明被试者具有A血型。
如果与两者都沉淀，说明被试者具有AB血型。
如果与两者都未发生沉淀，说明被试者具有O血型。
在正定型试验和反定型试验中，如果在任意一次实验中发生了沉淀反应，就能确定被试者的血型。
如果在正定型试验和反定型试验中都未发生沉淀反应，则需要重新进行试验或者采用其他额外的手段来鉴定个体的血型。
需要注意的是，血型鉴定是一种简单、安全、快速且可靠的方法，但在特殊情况下，如婴儿出生后的一段时间内，由于母婴免疫传递可以导致血型存在变化。
ABO疑难血型鉴定
ABO正、反定型不合疑难血型三步分析法”ABO正反定型不符定义：①ABO正反定型不符，即正定型与反定型提示的血型结果不一致②ABO正反定型相符，但为弱反应，正定型反应强度＜3+，或反定型反应强度＜2+③正定型为O型，反定型与A细胞、B细胞凝集强度差别≥2+凡是遇到ABO正、反定型不合的病人第一步: 排除人为因素／操作失误１，重新采集血样⑴分抗凝，不抗凝两管⑵排除采错人，输血/输液处采样……２，核对试剂，器材仔细阅读试剂效期，说明书，操作方法，注意事项３，规范化操作复检复检ABO 血型仍然正、反定型不合，就确定为疑难血型进入三步法第二步第二步：凡是ABO正、反定型不合的病例按下面方法，分析病人的抗原、抗体是“变多？还是变少？”正、反定型结果判断1，正定型AB, (两种抗原) 抗原变多正定型O, (无抗原) 抗原变少2，反定型O, (两种抗体) 抗体变多反定型AB, (无抗体) 抗体变少3，正定型A, 或B (一种抗原) ①抗原变多;②抗原变少反定型A, 或B (一种抗体) ①抗体变多;②抗体变少★不要过问“真滴变多变少没有”，你依样画葫芦就是了规律很好记，不管是抗原/抗体：两种→肯定是变多没有→肯定是变少；一种→可能是变多，也可能是变少归纳ABO正,反定型不合的“五大类30种原因”知道有个“五大类30种原因”就可以了不要记，书上有这些表，现用现翻书★用排除法（1）红细胞抗原变少7种（2）红细胞抗原变多7种①＜6月,老年（临床）□①自身凝集素（临床诊断）□②白血病（临床诊断）□②红细胞粘附大量蛋白（RBC未洗）□③输异型血（输血史）□③样本含试剂反应物（RBC未洗）□④造血干细胞移植（病史）□④造血干细胞移植（病史）□⑤血型物质↑□⑤获得性B抗原（类B）（临床感染）□⑥急性大失血（临床病史）□⑥B(A)表型□⑦ABO亚型□⑦输异型血（输血史）□注意：每条的临床提示（3）血清抗体变少6种（4）血清抗体变多7种①<6个月/老年（临床）□①自身抗体（临床诊断AIHA）□②ABO亚型□②同种抗体（抗筛）□③低丙种球蛋白血症（化验）□③对试剂反应的物质□④造血干细胞移植（病史）□④血清蛋白异常（化验）□⑤先天性ABO抗体缺失□⑤输异型血浆（输血史）□⑥大量输液（输血史）□⑥造血干细胞移植（病史）□⑦输含血型抗体Ig（输血史）□注意：每条的临床提示5）混合凝集（mf）3种①3个月内输异型血（输血史）□②造血干细胞移植（病史）□③双精子受精/嵌合体（问家系）□注意：每条的临床提示归纳剩下不能排除的原因：第三步: 实验验证针对剩下几种不能排除的原因, 选择针对性实验验证，如何选择针对性实验呢?翻看书本:《输血免疫血液学实验技术》人民卫生出版社,2011 .1; P131。
ABO疑难定型
ABO疑难定型一、ABO疑难血型鉴定的方法（一）正反定型：正定型：-A, -B，-AB, -H, -A1反定型：Ac, Bc, Oc, 自身对照1. ABO正定型中各种试剂用途疑难定型中正定型用抗血清抗-A及抗-B抗-AB:确认弱A和弱B抗原,与弱A及弱 B抗原亲和力强,会产生强反应抗-H:用于检查亚型及孟买型, A亚型红细胞上的H抗原多于正常A型抗-A1: 用于A亚型(如A2, A3)检测2. H抗原在红细胞上的分布3. ABO反定型中各种试剂的用途反定型中试剂红细胞的意义A及B细胞: 确认抗-A或抗-B抗体O型红细胞:检查是否存在ABO系统以外抗体干扰ABO反定型自身对照: 用于确认正反定型结果的有效性,排除自身抗体对定型的干扰(如冷凝集等)A2细胞: 用于亚型的鉴定, 尤其是在怀疑是A亚型且又存在抗-A1抗体的情况下（二）型物质测定型物质准备：1~2ml唾液，沸水煮10分钟，离心后得到的上清。
标清的调制：标清用盐水稀释至其效价为1：16中和：将0.5ml型物质与调制后的标清0.5ml等体积混合,室温放置30分钟检测：用Ac检测中和后的抗-A, Bc检测中和后的抗-B.结果判断：如果抗-A被中和，则被检者为A型，如果抗-B被中和，则被检者为B 型。
（三）吸收放散吸收用RBC：盐水洗涤5次的被检者压积RBC 1ml。
吸收用的标准血清将压积RBC和标清按等体积比例混合，在相应的温度条件下（4℃）孵育1小时，每隔15分钟混匀一次用盐水洗涤孵育后的细胞6次，得到压积RBC，加入等量盐水。
56℃水浴震荡10分钟，离心获得上清即为放散液。
用标准试剂红细胞检测放散液。
（四）O型筛选红细胞的应用抗原组成:三组合细胞,要求必须具备全部的Rh因子I: O型R1R1(CDe/CDe); II:O型 R2R2(cDE/cDE); III: O型rr(cde/cde)用途: 用于受血者、献血员及孕产妇等的ABO系统以外不规则抗体的筛选目的: 在配血之前,有针对性、按比例的去寻找与带有抗体的病人相配合的血（五）自家冷凝集血样的ABO定型正定型用红细胞的准备:血样采集后,立即离心,获得压积红细胞用37℃温盐水洗涤红细胞45℃热放散3分钟巯基试剂处理: 破坏IgM抗体自家冷凝集血样的ABO定型反定型用血浆或血清的准备血样采集后放置4℃冰箱静置24小时,使红细胞充分吸收自身冷凝集抗体用自身红细胞吸收去除自身冷抗体用O型红细胞吸收去除ABO系统以外的非特异性及特异性抗体（六）获得性B1. 获得性B及多凝集现象获得性B:肠紊乱及感染病人, 细菌酶影响A抗原的受体肠内壁通透性增加,而后细菌多糖吸附在红细胞表面多凝集现象:异常或变形的RBC被所有正常人的血清凝集(微生物酶作用暴露或激活膜隐蔽受体多凝集血样中的血清不与自身反应)2. 获得性B产生的主要机理二、ABO正反定型不符的问题分析（一）ABO定型问题经常发生的情况为：1. 明显缺失应该出现的抗-A或抗-B：(1) 新生儿血样(2) 免疫缺陷、免疫紊乱(3) 前带现象(4) 血型型物质过多(5) 抗原太弱，常规方法检查不出来，相应血清中无抗体(6) 亚型，反应是混合视野2. 由于试剂被污染，或试剂中有额外抗体3. 明显多出抗原(或多出抗体)(1) 亚型，如A2型可能血清中有抗-A1(2) 自家凝集(3) 获得性B（二）引起ABO正反定型不一致的原因分析1. 技术因素：(1) 试剂贮存不当(2) 使用技术错误(3) 使用错误的试剂(4) 使用污染或失效的试剂(5) 离心速度不当2. 存在IgM性质的自家冷抗体由于自家冷抗体(冷凝集病,CHD)而导致自家溶血的病人，在低于37℃时血细胞自发凝集，影响正反定型。
最新ABO 血型鉴定操作规程汇总
A B O血型鉴定操作规程1.0 原理ABO 血型鉴定操作规程2.03.04.05.0 5.1 5.26.0 6.16.2 6.36.4 6.5 6.66.77.0 7.1 根据红细胞上和血清（或血浆）中有无 A 抗原和（或）B 抗原及其抗体，将血型分为A 型、B 型、AB 型及 O 型。
可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型鉴定 ABO 血型。
正定型正定是指用已知抗-A、抗-B 血清来检测受检红细胞上有无相应的 A 抗原和（或）B 抗原；反定型反定是指用已知 A1型、B 型红细胞来检测受检血清（或血浆）中有无相应的抗-A 和（或）抗-B。
原始样品要求5 mL 静脉全血。
样品容器和添加剂真空试管，EDTA.K2抗凝/普通试管，不抗凝。
检测环境要求温度：18℃～27℃，湿度：30%～70%。
所需材料和设备设备普通离心机、免疫血液学离心机、显微镜、恒温水箱、定时器。
材料抗-A、抗-B 血清、ABO 标准抗原红细胞试剂、移液器、加样吸头、生理盐水（NS）、干净空试管。
检测操作过程将受检标本以 1000g 离心 5min，使标本血浆/血清与红细胞分离，吸取红细胞，用 NS洗涤三次后，配成 3%～5%红细胞悬液。
取 6 支小试管，分别标记“-A”、“-B”、“自身”、“Ac”、“Bc”、“Oc”。
在“-A”、“-B”管中分别加入抗-A 和抗-B 血清各 50 L ，其余管加入受检血浆/血清各100 L 。
在“-A”、“-B”、“自身”管中加入受检者 3%～5%红细胞悬液各 50 L ，摇匀。
在“Ac”、“Bc”、“Oc”管中分别加入 A1、B、O 红细胞试剂各 50 L ，摇匀。
1000g 离心 15sec，轻轻悬浮红细胞，观察结果并记录。
根据实验需要，除室温下观察结果外，另可增加在 4℃、37℃下观察结果。
结果判断凝集强度判断标准见表 1。
表1 凝集强度判断标准表凝集强度4+3+2+1+±-或θMFpHH判断标准红细胞凝集成一大块，液体背景透明，无游离红细胞数个大凝集块，液体背景透明，无游离红细胞有很多小凝集块，液体背景透明，无游离红细胞有许多很小的凝集块，肉眼可见，液体背景不透明，有游离红细胞微小的凝集块，肉眼很难看清，需要用显微镜观察无凝集，无溶血，全是游离红细胞混合凝集外观，镜下可见少数红细胞凝集，而大部分是游离红细胞部分溶血完全溶血7.2 ABO 血型结果判断见表2：正定型抗-A 血清血抗-B 血清血Ac表 2 2 血型结果判断表反定型定Bc Oc自身对照血型＋――＋―＋―＋―＋＋―＋―＋―――――――――ABOAB7.37.48.09.010.0 注：“＋”表示凝集或溶血；“―”表示不凝集。
ABO、Rh-血型鉴定
2021/4/27
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盐水法操作程序： 1、取小试管2支，标明主、次侧。主侧：受血者血清2滴
加供血者3～5%生理盐水红细胞悬液1滴；次侧：供血 者血清2滴加受血者3～5%生理盐水红细胞悬液1滴。 2、混匀，以1000r/min，离心1min，取出，先目测上层液 体是否溶血，再轻轻摇动试管，检查红细胞是否凝集。
2021/4/27
3
Rh(D)血型定型
目的：鉴定红细胞表面是否含有D抗原。 适用范围：受血者、献血者Rh(D)血型鉴定 使用器材和材料：Rh抗(-D)标准血清、吸管、玻片等
2021/4/27
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方法：玻片法
原理：根据抗D抗体与对应红细胞抗原的凝集 反应，区分Rh(D)阳性和Rh(D)阴性。
2021/4/27
结果判断：与盐水法相同。
2021/4/27
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注意事项：
1、用EDTA抗凝血浆代替血清配血，但不能用肝 素抗凝血配血，因为肝素对聚凝胺有中和作用。
2、病人使用肝素后要加双倍量聚凝胺。 3、聚凝胺试剂使用前应恢复至室温。 4、和试剂比例要恰当，增加血清（浆）和红细胞
量时，LISS及聚凝胺、重悬液的量也要增加，否 则，灵敏度会降低4～8倍。
2021/4/27
8
血型凝集示意图
抗-
抗-A
抗（-D）
B
抗-
抗-A
抗（-D）
B
抗-
抗-A
抗（-D）
B
2021/4/27抗-
抗-A
抗（-D）
血型：AB型 Rh(D)：阳性
血型：B型 Rh(D)：阴性
血型：A型 Rh(D)：阳性
血型：O型 Rh(D)：阳性
9
反定法（试管法）
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ABO血型正、反定型操作规程[目的]保证ABO血型鉴定准确，确保临床输血安全。
[适用范围]XXX医院输血科[职责]具有专业技术的工作人员主要负责本院输血（或备血）标本的ABO血型鉴定（但只对该单份标本负责）。
[相关文件]试剂采购、保存和使用管理程序设备采购、使用管理程序消毒与清洁管理程序标本采集、运输、保存和报废管理程序紧急用血管理程序[相关记录]仪器设备的采购、使用和维护记录仪器的温度记录恒温水温箱的换水和消毒记录消毒液的配置记录清洁消毒记录试剂采购、使用记录标本交接和报废记录紧急用血记录[实验原理]ABO血型是根据红细胞表面存在的凝集原决定的。
存在A凝集原的称为A型，存在B凝集原的称为B型。
而血清中还存在凝集素。
当A凝集原与抗A凝集素相遇或B 凝集原与抗B凝集素相遇时，会发生红细胞凝集反应。
一般A型血清中含有抗B凝集素，B型血清中含有抗A凝集素，因此可以用标准血清中的凝集素与被测者的红细胞反应（称为正定型），用标准红细胞与被测者血清中的凝集素反应（称为反定型），以确定其ABO血型。
[仪器器械]玻璃试管、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、普通离心机、试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。
[试剂]抗A标准血清、抗B标准血清、A型标准红细胞、B型标准红细胞、O型标准红细胞、生理盐水。
以上试剂均为有合格证件的正品。
[标本收集与处理]1．受检者血清：采集受检者静脉血2~3ml，经1000r/min离心1分钟或室温静置1小时后取上清。
2．2~5%的受检者红细胞：采集受检者静脉血或末梢血，用生理盐水制成2~5％红细胞盐水悬液备用，制备方法见本节质量控制和注意事项。
3．标本出现中度以上溶血者，为不合格标本，不能用于检测。
[实验方法与步骤]血型的正定型（试管法）：⑴、取2支试管，分别标上抗A和抗B；⑵、制备待测标本2~5%的红细胞悬液（取1支试管，加入2ml生理盐水，再加入1滴待测标本红细胞，混匀备用）；⑶、在抗A管中加入2滴抗A标准血清，在抗B管中加入2滴抗B标准血清；⑷、在抗A和抗B管中分别加入1滴已制备好的待测标本2~5%红细胞悬液；⑸、混匀后，立即对称放入离心机中进行1000r/min离心1分钟，或室温静置1小时，再轻轻摇动试管，使沉于管底的红细胞浮起，先肉眼观察有无凝集现象，如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。
⑹根据有无凝集现象判定结果如下。
注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B 或cisAB的发现。
⑺凝集强度判断标准4十红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。
3十红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。
2十红细胞凝块分散成许多小块，见到游离红细胞。
1十肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞。
土镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞。
MF 混合凝集外观(mixed field)是指镜下可见少数红细胞凝集，而极大多数红细胞仍呈分散分布。
一表示阴性，镜下未见凝集，红细胞均匀分布。
血型的反定型（试管法）：⑴、取3支试管，分别标上A、B和O；⑵、在3支试管中分别加入2滴待测标本的血清；⑶、将ABO标准红细胞轻轻地充分混匀后，在A管中加入1滴A型标准红细胞，在B管中加入1滴B型标准红细胞，在O管中加入1滴O型标准红细胞；⑷、混匀后，对称放入离心机中进行1000r/min离心1分钟（或3400 r/min离心15秒）；⑸、取出后，先观察是否溶血（溶血可能是阳性结果，或者是细菌污染），再轻轻摇动试管，肉眼观察有无凝集现象，肉眼不易分辨的用显微镜观察；⑹根据有无凝集现象判定结果如下。
注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B 或[质量控制和注意事项]1、分型标准血清试剂必须为三证齐全的合格产品，质量性能符合要求，且在有效期内使用。
试剂开封后必须贴上注有开封日期和开封人的标签，使用后应及时置于2~8℃专用冰箱中保存，以免细菌污染和变质而影响试验结果。
试剂开封后有效期为一周。
2、商用分型标准红细胞试剂必须为三证齐全的合格产品，质量性能符合要求，且在有效期内使用；自制分型标准红细胞试剂必须以3个健康者同型新鲜红细胞混和，用生理盐水洗涤 1~3次，以除却存在于血清中的抗体及可溶性抗原，再制成2~5%的红细胞悬液备用。
试剂开封或制备后必须贴上注有开封或制备日期和开封人或制备人的标签，使用后应及时置于2~8℃专用冰箱中保存，以免细菌污染和变质而影响试验结果。
试剂开封或制备后有效期为一周。
3、生理盐水启用后，有效期为二周。
4、所有试剂在使用时，必须检查是否有浑浊、变色、凝集等变质现象；凡可疑者，必须更换新的试剂进行检测。
若分型标准血清使用时间较长后，最好用已知的ABO 标准红细胞检查结果是否与已知的血型相符；若分型标准红细胞使用时间较长后，最好用已知的分型标准血清检查结果是否与已知的血型相符，以防标准血清或红细胞制品污染、变质失效而造成鉴定错误。
5、试管、滴管和玻片必须清洁干燥，防止溶血。
6、操作方法应按规定进行，一般应先加血清，后加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。
7、IgM抗-A和抗-B与相应红细胞的反应温度以4℃为最强，但为了防止冷凝集现象的干扰，一般仍在室温(20~24℃)内进行试验，37℃可使反应减弱。
8、离心时间不宜过长或过短，速度不宜过快或过慢，以防假阳性或假阴性结果。
），需延长作用时间。
用试管法进行ABO血型的正定型时不能测出亚型（如AX9、在反定型试验中，如果受检者的血清或血浆与O型标准红细胞产生阳性反应，则需要添加自身对照试验。
如果自身对照试验为阳性，表明是自身冷凝集素导致。
如果自身对照试验为阴性，则表明被检者血清或血浆中可能存在ABO系统以外其它系统的抗体干扰，此时需做其它相关试验加以解决上述定型问题。
10、对含有较多自身冷凝集素的受检者，在使用标准血清进行正定型时往往被误定为AB型，遇到此种情况，需用37℃生理盐水洗涤受检者的红细胞2~3次，以去除吸附在红细胞上的冷凝集素，然后再鉴定血型。
11、观察时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝固以及缗钱状排列的区别。
对于可疑结果，必须更换所用的试剂，重新检测。
12、对于可能存在不完全抗原的时候，应在各反应中加入凝聚胺试剂，以检验不完全抗原的存在。
13、判断结果后应仔细核对、记录，避免笔误。
14、2~5%红细胞悬液的配制：先用生理盐水洗涤红细胞3次，再根据下表进行红[临床应用用于检验人的ABO血型归属。
[血型鉴定的影响因素及解决方法]准确的血型鉴定是临床安全、有效输血的重要保证之一，但影响血型鉴定结果的因素很多。
如发现ABO正反定型结果不一致，应先重复做1次试验。
重复做试验时，应严格执行操作规程，使用质量合格的试剂，并细心观察和解释试验结果，就可解决明显的问题。
对一些疑难问题必须做如下进一步研究：1、标本①血标本的采集错误、稀释和溶血。
另从受检者采集l份新鲜血液标本，这样可以纠正因污染或搞错样本造成的不合。
标本一般要求离体后尽快实验，最长不能超过3天，每次输血后受血者和供血者的血标本应在2～8℃保存7天。
②患者的药物使用有时也对实验有一定影响，当受血者使用肝素治疗时，应使用硫酸鱼精蛋白对抗使标本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等治疗，应注意将红细胞洗涤。
③受检者红细胞上抗原位点过少(如亚型)或抗原性减弱(见于白血病或恶性肿瘤)，以及类B或cisAB等。
●如疑为A抗原或B抗原减弱，则可将受检红细胞与抗—A或抗—B血清做吸收及放散试验，以及用受检者唾液作A、B、H血型物质测定（只对80％HAB分泌型的人有用）。
●如受检者为A型血而疑为有类B抗原时，可用下列方法进行鉴别：(1) 观察细胞与抗—A及抗—B的凝集强度，与抗—A的反应要比与抗—B的反应强，这种区别用玻片法作试验更为明显；(2) 用受检者红细胞与自身血清作试验，血清中的抗—B不凝集自身红细胞上的类B抗原；(3) 检查唾液中是否有A、B物质，如果是分泌型，可检出A物质而无B物质；(4) 核对患者的诊断，类B抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰阴性杆菌感染有关。
④受检者血清中蛋白紊乱(高球蛋白血症)，或实验时温度过高，常引起红胞呈缗钱状排列。
如试验结果红细胞呈缗钱状排列，加等渗盐水l滴。
混和，往往可使缗钱现象消失。
注意不应先加盐水l滴于受检者血清中而后和红细胞做试验，以免使血清中抗体被稀释。
⑤细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。
如发现多凝集现象，应考虑由遗传产生的Cad抗原活性；被细菌酶激活的T或TK受体；或产生机制不太明了的Tn受体所引起。
多凝集红细胞具有以下特点：(1)能被人和许多家兔的血清凝集；(2)能与大多数成年人的血清凝集，不管有无相应的同种抗体。
(3)不被脐带血清凝集。
(4)通常不与自身的血清凝集。
(5)如有条件可用外源凝集素加以鉴别。
⑥检者血清中缺乏应有的抗-A及或抗—B抗体，如丙种球蛋白缺乏症，老年人血清中抗体水平大幅度下降等。
如果试验结果未见凝集，应将细胞及血清试验至少在室温和4℃放置30min，用显微镜检查核实。
⑦血清中有意外抗体，如自身抗—I，常引起干扰。
用A1、A2、B、O红细胞及自身红细胞检查受检者血清。
如果怀疑是抗—I，用O型(或ABO相合的)脐血红细胞检查。
⑧各种原因引起的红细胞溶解，误判为不凝集。
部分溶血时，可溶性血型物质中和了相应的抗体。
将红细胞洗涤数次，配成2~5%生理盐水细胞悬液，用抗—A、抗—B、抗—Al，抗—A十B及抗H做试验可以得到其它有用的信息。
对受检红细胞作直接抗球蛋白试验，如结果呈阳性，表示红细胞已被抗体致敏。
2、试剂①运输、贮存等条件不适可导致试剂变质失效，造成配血错误。
实验前进行试剂外观、效价等项目质量控制。
②不同抗凝剂制备的标准红细胞质量也不同；另外，红细胞悬液过浓或过淡，抗原抗体比例不适当，使反应不明显，易误判为阴性反应。
应依据要求正确配制红细胞浓度。
③分型血清效价太低、亲和力不强，如抗—A血清效价不高，可将A亚型误定为O型、AB型误定为B型。
实验前应进行试剂效价等项目质量控制。
3、冷凝集素在ABO血型鉴定和交叉配血的过程中，冷凝集素是影响ABO血型正反不符和交叉配血不合的常见原因，尤其是在冬天气温较低时，某些病人血清中含有冷凝集素而导致出现假阳性。
正常人血清中冷凝集素效价一般不高，且在4℃以下时才有活性。
但由于人免疫系统的差异，在恶性肿瘤或病原体感染后有时冷反应性自身抗体可异常增高，造成溶血性贫血。
这种冷凝集素效价在4℃可高于1000，用37℃生理盐水洗涤红细胞，操作时再置于37℃水浴中轻轻摇动可以排除冷凝集素的干扰。
4、自身免疫性溶血性贫血红细胞被自身抗体强烈致敏后将干扰ABO定型，且自身抗体的存在会导致交叉配血不合，选择合适的试验方法对红细胞上结合的抗体做放散处理，确定抗体的特异性。