银染
银染法原理
银染法原理
银染法（Silver Dyeing）是一种针织衫表面装饰印花工艺，其原理是通过水洗酚与羟基合铝（DHDH）交联到纤维表面，形成一层“磁铁膜”。
此外，经过“活性染料”稳定处理之后，通过“中性染银”工艺，将银染剂附着在纤维表面，形成银染浸出物，从而达到印花的目的。
经过“活性染料”和中性染银的处理，纤维表面结合强条件的DHDH，使纤维表面形成稠密平整的银染“磁铁膜”，并且可以在低温条件下对DHDH进行化学反应，而不会损伤纤维结构，维持纤维表面质地、厚度及形状的稳定性。
因此，银染法可以显著改善纤维表面的抗湿性、抗脏能力，确保长期的产品性能。
此外，由于银染可以实现多种渐变色印花，因而在市场上十分受欢迎。
银染法的一大优点是对纤维表面的抗湿性和耐磨性都有很大的改善，而且易于清洁，易于使用。
此外，它相对传统的织物印花可以提供更持久的色彩，而且可以提供更多的色彩选择。
此外，还有各种多种渐变色印花可以实现，增强了产品的装饰性和独特性。
DNA和蛋白银染步骤(独门绝技--有图)
DNA银染一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释)1、固定液：50ml乙醇2、前处理液（敏化液）：5ml HNO33、染色液：0.5g 硝酸银（避光配制）4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml5、终止液：50ml 冰醋酸二、银染步骤（摇床设置52rpm左右）1、准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中在摇床上轻摇1min；2、凝胶固定：倒掉盒中的水，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动10min；3、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次30S；4、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化6min；5、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗2次每次10S；6、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min；7、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗1次10S；8、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止；9、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇2-3min；10、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次1min。
三、变性聚丙酰胺凝胶的配制（两块、使用1.0BioRad胶板）1.2%的凝胶可以跑微卫星，和基因组DNA1、尿素：7.2g2、30%聚丙酰胺，4.68ml3、10×TBE，1.5ml (Tris碱108g；硼酸55g；EDTA 40ml 0.5mol/L,Ph=8.0；加水至1L)4、30%AP，35ul5、TEMED,4ul四、下图：左为果蝇正常基因组DNA与损伤后基因组DNA；右为果蝇微卫星电泳12h Treatment24h TreatmentMCT 0 5 10 200 5 10 20Protein银染一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释)1、固定液：200ml甲醇，50ml冰醋酸2、前处理液（敏化液）：150ml 乙醇，34g醋酸钠，1g硫代硫酸钠（使用前加入）3、染色液：1.25g 硝酸银（避光配制）4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml5终止液：2g甘氨酸二、银染步骤（摇床设置52rpm左右）1、凝胶固定：准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动30min；2、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次1min；3、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化30min；4、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗3次每次5min；5、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min；6、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗2次每次5min；7、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止；8、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇10min；9、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次5min。
银染步骤及注意事项
银染步骤是1 固定10冰乙酸min。
2 清洗双蒸水冲洗凝胶次每次1min。
3 染色染色液1g硝酸银.5mL37甲醛1L双蒸水。
现配染色30min。
4 清洗迅速洗凝胶次。
5 显影30g 碳酸钠1.5mL37甲醛200uL 10mg/L硫代硫酸钠。
显影至清晰带纹出现。
成功银染的关键因素包括 1 用超纯水比如NANOpure或Milli-Q纯化或者是双蒸水作银染。
2 用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。
3 在染色后水清洗所用时间的长短很重要用不超过5-10秒的时间清洗胶然后放入显色溶液中一般在水里浸一下就好。
4 甲醛和硫代硫酸钠ul/1ml在使用前及时加入到显色液中。
5 在使用前及时配染色液。
银染的方法种类很多目前有文献报道的就有100 多种。
但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。
大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银沉淀在蛋白质的表面上而显色。
由于银染的灵敏度很高可染出胶上低于1 ng/蛋白质点故广泛的用在2D 凝胶分析上及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。
这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法对关键操作及要求做了补充主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测如内源性GST-Pulldown、Co-IP 等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验目的检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
实验原理在碱性条件下用甲醛将蛋白带上的硝酸银银离子还原成金属银以使银颗粒沉积在蛋白带上。
染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
银染的详细机制还不是非常清楚。
试剂乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序固定30min或者更长时间o 100ml 乙醇40 乙醇o 25ml冰醋酸10 冰醋酸o 加水到250ml 致敏30min o 75ml 乙醇30 乙醇o 17g 乙酸钠28.2g 三水乙酸钠o 0.5g硫代硫酸钠o 加水到终体积250ml 水洗3 x10min 银染20min o 0.625g AgNO3 o 100 ul 37甲醛在使用前加入o 加水到终体积250ml 水洗2 x 1 min 注意把握时间水洗时间长显色速度慢点的颜色偏黄色显色视情况而定o 6.25 g Na2CO3 o 50 ul 37 甲醛在使用前加入o 加水到终体积250ml 终止10min o 3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸o 加水到终体积250ml 保存1 冰醋酸4 ℃注意事项1固定时间较长则加一步水洗30min以免胶太脆而破碎。
基本银染和微波快速银染步骤-中文翻译
基本的银染步骤：（90min）材料：超纯水（>18 megohm/cm全程）、塑料染色托盘、摇床、塑料搅拌棒、10mL 一次性管、干净的玻璃杯、量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液（40%乙醇、10%乙酸）注意事项：1.在拿胶前确定用去离子水清洗橡胶手套。
2.用干净的容器，并标明银染专用。
3.当摇动时，确保容器大小可使胶在里面自由移动，染色时溶液能完全沫过胶面。
4.在拿胶或换溶液时，避免徒手摸胶或用金属物品接触，及避免对胶施加压力。
5.用有铁氟龙图层的棒和干净的玻璃容器准备试剂。
6.避免试剂交叉污染。
7.用新鲜配置的溶液。
样品含有高浓度的DTT：如果你的样品含有高浓度的DTT （>50mM）,银染时可能导致条带拖尾和黄色背景。
为避免拖尾按照下面的方法还原和烷基化样品：1. 用新鲜配制的DTT还原你的样品到终浓度为17mM，并在70℃加热10min.2. 用新鲜配制的碘乙酰胺烷基化你的样品到终浓度为35mM，并在70℃加热10min.3. 加不含DTT的SDS样品buffer到还原和烷基化后的样品中。
进行电泳，并按手册进行银染。
在开始之前：用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染：程序：下面的程序用于8*8厘米预制胶，1.0mm厚。
如果要染两块小胶或1.0mm厚的大胶（18*18），保证孵育时间，将所有溶液的体积加倍。
注意：如果你的胶的尺寸和上面提到的不一样，你可能必须通过调整孵育时间和溶液体积来选择银染策略。
所有的孵育应该在一个旋转摇床上进行，以1圈/秒的速度在室温下进行。
确保每个胶有100ml的溶液。
1. 电泳后，将胶取出至合适尺寸的银染托盘内，用超纯水简单的清洗一下。
2. 用100ml固定液在摇床上缓慢旋转，固定胶20min。
如果你用的是Tricine 胶，那么就固定1小时。
注意：如果没有足够的时间完成银染程序，胶可以在固定液中存放一夜。
长时间的固定在某些情况下可能会改善灵敏度和背景。
银染法的名词解释
银染法的名词解释对于普通人来说，银染法可能是一个陌生的名词，但对于纺织品行业的从业者来说，它却是一个非常重要的工艺。
银染法是一种利用化学方法将银离子引入纺织品中，以达到防菌、抗菌、净化空气等功能的一种技术。
下面，我们将深入探讨银染法的详细内容。
一、银染法的原理银染法利用的是银离子的抗菌性能。
事实上，早在古代，人们就发现银具有抗菌的作用。
在现代，科学家们通过研究发现，银离子能够干扰细菌的细胞膜和核酸的复制，从而抑制细菌的生长和繁殖。
为了将银离子引入纺织品中，银染法应运而生。
二、银染法的流程银染法的流程主要包括：纺织品预处理、银染剂的配制、浸染银染剂、干燥和固定银离子等步骤。
首先，在纺织品进行预处理。
预处理主要包括漂白、洗涤、软化、充电等步骤，以去除纺织品表面的杂质，使其更加适合染色。
接着，配制银染剂。
银染剂通常由银盐和染料组成。
不同的银盐可以产生不同的效果，例如硝酸银可以产生较强的抗菌效果，氧化银则可以产生净化空气的效果。
然后，将纺织品浸泡在银染剂中。
这个步骤中，纺织品会吸收银离子，并且银离子会与纺织品的纤维结合，从而实现功能的目的。
完成浸染后，需要将纺织品进行干燥。
干燥的目的是除去多余的水分，使银离子更好地固定在纺织品上。
最后，采用适当的固定剂将银离子固定在纺织品上。
固定剂能够与银离子进行反应，形成稳定的化学结构，从而增加银离子在纺织品上的使用寿命。
三、银染法的应用银染法在现代纺织品行业中应用广泛。
首先是医疗纺织品领域。
由于银离子的抗菌性能，银染法在生产医用口罩、手术衣等产品时被广泛采用，可以有效地阻止细菌的传播，保护医护人员和患者的健康。
另外，银染法也被应用于家纺领域。
银染法可以制作出带有抗菌功能的床上用品，例如枕头套、被套等。
这些产品可以减少细菌的滋生，为家庭提供一个干净、健康的生活环境。
此外，银染法还可以应用于户外装备领域。
例如，登山服、户外鞋等产品采用了银染法，不仅可以抑制细菌的生长，还有效防止异味产生，让户外运动更加舒适。
银染方法
A modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray ionization-mass spectrometryThe growing availability of genomic sequence information,together with improvements in analytical methodology,have enabled high throughput,high sensitivity protein identi-fication.Silver staining remains the most sensitive method for visualization of proteins separated by two-dimensional gel electrophoresis (2-D PAGE).Several silver staining protocols have been developed which offer improved compatibility with subsequent mass spectrometric analysis.We describe a modified silver staining method that is available as a commercial kit (Silver Stain PlusOne;Amersham Pharmacia Biotech,Amersham,UK).The 2-D patterns abtained with this modified protocol are comparable to those from other silver staining methods.Omitting the sensitizing reagent allows higher loading without saturation,which facilitates protein identification and quantita-tion.We show that tryptic digests of proteins visualized by the modified stain afford excellent mass spectra by both matrix-assisted laser desorption/ionization and tandem electrospray ionization.We conclude that the modified silver staining protocol is highly compatible with subsequent mass spectrometric analysis.Keywords:Proteomics /Two-dimensional gel electrophoresis /Silver stain /Mass spectrometry /Protein identification /Matrix assisted laser desorption/ionization ±time of flight /Electrospray ionization ±time of flightEL 4190Jun X.Yan 1Robin Wait 2Tom Berkelman 3Rachel A.Harry 1Jules A.Westbrook 1Colin H.Wheeler 1Michael J.Dunn 11Department of Cardiothoracic Surgery,National Heart and Lung Institute,ImperialCollege School of Medicine,Heart Science Center,Harefield Hospital,Harefield,Middlesex,UK 2Kennedy Institute ofRheumatology,Hammersmith,London,UK 3Amersham Pharmacia Biotech,San Francisco,CA,USAThe increasing availability of genomic sequence informa-tion,together with improvements in protein characteriza-tion by mass spectrometry,have facilitated huge in-creases in the throughput of protein identification.Most commonly,sample components are separated by two-dimensional gel electrophoresis (2-D PAGE)and protein spots are visualized by staining silver,Coomassie blue or SYPRO fluorescent dyes [1±3].Individual spots are then excised from the gel,proteolytically digested,and the masses of the resulting peptides are determined by matrix assisted laser desorption/ionization ±time of flight ±mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).The list of peptide masses thus obtained can then be used as a highly spe-cific query to interrogate a protein database [4±9].Recent advances in tandem electrospray ionization-mass spec-trometry (ESI-MS/MS),particularly the development of hybrid quadrupole /orthogonal acceleration TOF instru-ments (Q-TOF),enable routine de novo sequencing of low femtomole levels of peptides [10±13].The ability to determine 10±20amino acid lengths of sequence greatly facilitates cross-species protein identification and retrieval of homologous proteins from genomic and EST data-bases,even when an exactly matching sequence is not present.It is desirable to visualize protein spots in the gel at sensitivities which are roughly comparable to those of the subsequent MALDI-and ESI-MS analyses (usually in the range of nanograms per protein spot).Silver staining has been widely used for this purpose [14,15]since it re-quires relatively inexpensive equipment and reagents and remains one of the most sensitive methods for perma-nently staining proteins in polyacrylamide gels.For protein silver staining,a polyacrylamide gel is soaked in a solution containing soluble silver ions (Ag +)and sub-sequently developed by treatment with a reductant.Pro-tein molecules in the gel promote the reduction of silver ions to metallic silver (Ag 0),which is insoluble and visible.Initial deposition of metallic silver promotes further depo-sition by an autocatalytic process,resulting in exception-ally high sensitivity.There are many published versions of the silver staining process [16,17],which may incorpo-rate,in addition to silver impregnation and development,fixation steps,incubations with sensitivity enhancers (e.g.,glutaraldehyde or formaldehyde),stopping and preservation,and washing steps.The reagents used vary,but the silver reductant is always formaldehyde.The high sensitivity of silver staining comes at the cost of sus-ceptibility to interference from a variety of scources.Correspondence:Dr.Jun X.Yan,Heart Science Center,Hare-field Hospital,Hill End Road,Harefield,Middlesex,UB96JH,UK E-mail:jun.yan@ Fax:+44-(0)1895-828-9003666Electrophoresis 2000,21,3666±3672WILEY-VCH Verlag GmbH,69451Weinheim,20000173-0835/00/1717-3666$17.50+.50/0Exceptional cleanliness must therefore be practiced and reagent and water quality are critical.Silver staining pro-tocols have been developed specifically for visualizingproteins prior to in-gel digestion and mass spectrometric analysis [14,18].Subsequent MS constrains the choice of reagents that can be used during silver staining,because the proteins in the gel must not be chemically modified.Thus many common sensitization reagents (e.g.,glutaraldehyde and strong oxidizing agents)cannot be employed.Since silver staining is a multistep process utilizing numerous reagents,the quality of which is critical,it is often advantageous to purchase a dedicated kit in which the reagents are quality-assured specifically for sil-ver staining.We report here a modified silver staining method that is available as a commercial kit (Silver Stain PlusOne;Amersham Pharmacia Biotech)and we show that it is compatible with subsequent in-gel digestion,MALDI,and ESI analysis.The method is based on that of Heukes-hoven and Dernick [19],but omits the use of glutaralde-hyde in the sensitization step and formaldehyde in the sil-ver impregnation step.The detailed protocol is shown in Table 1.Staining was performed in glass dishes and par-ticular care was taken to avoid contamination by keratin and other extraneous proteins.Electrophoresis 2000,21,3666±3672Silver staining compatible with mass spectrometric analysis 3667Table 1.The modified silver staining protocol using Silver Stain PlusOne kit Step Solution (250mL per gel)Time (min)1.Fix 25mL acetic acid,100mL methanol,125mL milli-Q water 152.Fix25mL acetic acid,100mL methanol,125mL milli-Q water153.Sensitization a)75mL methanol,10ml sodium thiosulfate (5%),17g30sodium acetate 165mL milli-Q water 4.Wash 250mL milli-Q water 55.Wash 250mL milli-Q water 56.Wash 250mL milli-Q water57.Silver a)25mL silver nitrate (2.5%),225mL milli-Q water 208.Wash 250mL milli-Q water 19.Wash 250mL milli-Q water110.Develop6.25g sodium carbonate,100m L formaldehyde,250mL milli-Q water 11.Stop 3.65g EDTA,milli-Q water 1012.Wash 250mL milli-Q water 513.Wash 250mL milli-Q water 514.Wash250mL milli-Q water5a)Omitting the use of glutaraldehyde in the sensitization step and formaldehyde in the sil-ver impregnation step.Working solutions are freshly made immediately prior tostaining.Figure 1.Gel image of normal rat left ventricle using IPG pH 3±10NL 2-D PAGE (12%T)with 100m g total protein loading and silver staining (Owl silver stain kit).P r o t e o m i c s a n d 2-D ENormal human and rat heart left ventricle tissues were used.Sample preparation and2-D PAGE were performed essentially according to Weekes et al.[20].We routinely use100m g total protein loading for analytical gels(pH 3±10NL)and the Owl silver stain kit(Owl Separation Sys-tem,Portsmouth,UK)for visualization.A typical image of one of these gels is shown in Fig.1.To investigate the sensitivity of the PlusOne kit,100,200,300and400m g total protein loading were used.The corresponding gel images are shown in Fig.2.The patterns obtained using the two different kits(Figs.1and2d)are very similar. This,therefore,facilitates comparisons between semipre-parative and analytical gels stained with conventional pro-tocols(e.g.,the Owl kit).Excellent patterns were achieved at higher protein loadings(200,300,and400m g;Fig.2a±c),whereas many spots display negative staining at these loadings when more sensitive staining methods,such as the Owl kit,are used(data not shown).Note that the high-er background obtained from the higher protein loading gels were removed using transform to autoscale the gel image in PDQuest2-D software version6.1(Bio-Rad, Hercules,CA,USA).A400m g total protein loading for IPG3±10strips appears to be optimal in that adequate concentrations of most spots are obtained for MS analy-3668J.X.Yan et al.Electrophoresis2000,21,3666±3672Figure2.Gel images of normal rat left ventricle using IPG pH3±10NL2-D PAGE(12%T)and modi-fied silver staining described in Table1(modified PlusOne silver stain kit)with total protein loading of(a)400m g,(b)300m g,(c)200m g and(d)100m g.sis,while minimizing excessive background and the for-mation of large spot clusters.Higher loadings are possi-ble,however,when using narrow-range IPG strips(data not shown).We investigated the compatibility of the PlusOne modified protocol with ESI-and MALDI-MS.While MALDI is rela-tively tolerant of salts and other contaminants[21,22], the ESI technique is much more susceptible to such inter-ference.Thus,it is necessary to validate the compatibility of the modified stain with both ionization methods.Figure 3shows a gel image of human heart left ventricle(400m g total protein loading)from which20proteins spots were excised for MS characterization.A modified sample prep-aration method was used,which incorporates a destain-ing step[15]to remove silver prior to in-gel digestion with trypsin[14].Aliquots(0.5m L)of the digest supernatant were applied directly to the MALDI target,after which,if necessary,the remainder of the sample was extracted, desalted,and analyzed by ESI-MS/MS.These data are summarized in Table.2.If the results from MALDI mass mapping were ambiguous,ESI-MS/MS was used to gen-erate amino acid sequence data suitable for sequence tag or similarity searching using BLAST.Figure4shows the MALDI mass spectrum of spot19which,when sub-mitted to database searching,retrieved a highly signifi-cant match to ubiquinol cytochrome C reductase.Figure 5a shows a MALDI mass spectrum obtained from spot4, which,when searched,did not find any unambiguous hits.Electrophoresis2000,21,3666±3672Silver staining compatible with mass spectrometric analysis3669Figure3.Gel image of human left ventricle using IPG pH3±10NL2-D PAGE(12%T)with400m gtotal protein loading.The gel was stained using the PlusOne silver stain kit.Protein spots(1±20)labeled on the image were subjected to trypsin digestion and MALDI-TOF-MS or ESI-MS(Table2).This protein was identified by ESI-MS/MS of a doubly charged ion at m/z 777.4,from which 13residues of amino acid sequence were deduced (Fig.5b),which exactly matched the sequence of ATPsynthase a -chain.We conclude that the modified silver staining kit is com-patible with both MALDI-and ESI-MS.Although the sensi-tivity is somewhat lower than other versions,this kit ena-bles higher protein loading,thus facilitating identification by MS.In our laboratory the modified protocol has pro-vided consistent results over a 12-month period and,since the resulting patterns are similar to those produced by the Owl silver stain kit,we have been able to correlate results from semipreparative and analytical gels.Spots of interest are easily located for excision and further charac-terization.A loading of 400m g protein on IPG 3±10strips provides adequate concentrations for successful MALDI analysis of the majority of visible spots.For very low abu-dance proteins,use of the modified stain in conjunction with high protein loadings on narrow pH range IPG strips avoids excessive background staining and spot cluster-ing.We thank the Cardiovascular Disease Group,Rhone-Poulenc Rorer (Collegeville,PA,USA)for providing the rat heart tissue,and Tim Harwood,Amersham PharmaciaElectrophoresis 2000,21,3666±3672Silver staining compatible with mass spectrometric analysis3671T a b l e 2.c o n t i n u e dS p o t E s t i m a t e d I d e n t i f i c a t i o n (a c c e s s i o n n u m b e r )T h e o r e t i c a l A m i n o a c i d P e p t i d e s e q u e n c e i n f o r m a t i o n o b t a i n e d b y E S I -T O F -M S /M S a n a l y s i sN o .p I /M r (D a )p I /M r (D a )c o v e r a g e (%)w i t h M A L D I -T O F -M S 195.7/46200U b i q u i n o l -c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e c o m p l e x c o r e p r o t e i n I 5.94/5261939.31.m /z 787.5(3+)A V E L L G D I V Q N C S L E D S Q I E K p r e c u r s o r ,h u m a n (P 31930)2.m /z 901.5(3+)A G Y G P L E Q L P D Y N R3.m /z 1044.3(3+)...F Q G T P L A Q A V E G P S E N V R 4.m /z 1180.7(2+)A V E L L G D I V Q N C S L E D S Q I E K5.m /z 1351.7(2+)Y I I D Q C P A V A G Y Y P I E Q L P D Y N R 205.9/40700A c t i n ,a -c a r d i a c ,h u m a n (P 03996)5.24/4200930.21.m /z 565.9(2+)G Y S F V T T A E R2.m /z 652.7(3+)V A P E E H P T L L T E A P L N P K3.m /z (2+)P y r -E Y D E A G P S I V H RP r o t e i n s p o t s 1±20w e r e e x c i s e d f r o m t h e 2-D g e l s h o w n i n F i g .3a n d a n a l y z e d b y M A L D I -a n d E S I -M S .T h e r e s u l t i n g p e p t i d e m a s s m a p s w e r e s e a r c h e d a g a i n s t S W I S S -P R O T /T r E M B L r e l e a s e 35,u s i n g P r o t e i n P r o b e (M i c r o m a s s ),o r a g a i n s t a n o n r e d u n d a n t d a t a b a s e m a i n t a i n e d b y t h e N a t i o n a l C e n t e r f o r B i o t e c h n o l o g y I n f o r m a t i o n (N C B I )(h t t p ://w w w .n c b i.n l m .n i h .g o v )u s i n g t h e M a s c o t [23]s e a r c h e n g i n e (h t t p ://w w w .m a t r i x s c i e n c e .c o .u k ).A n i n i t i a l m a s s t o l e r a n c e o f 100p p m w a s u s e d ,b u t w a s r e d u c e d t o 50p p m i f e x c e s s i v e n u m b e r s o f h i t s w e r e r e t r i e v e d .A m i n o a c i d s e q u e n c e s o b t a i n e d f r o m E S I -M S /M S w e r e s e a r c h e d a g a i n s t a n o n r e d u n -d a n t d a t a b a s e i n N C B I u s i n g t h e B L A S T p r o g r a m [23].M S /M S s h o w e d t h a t s p o t 1c o n t a i n e d t w o -c o m i g r a t i n g p r o t e i n s .S p o t s 6,8±13,a n d 15±17w e r e n o t a n a l y z e d b y M S /M S b e c a u s e t h e s e a r c h r e s u l t s f r o m t h e M A L D I d a t a w e r e u n a m b i g u o u s .T h e s e q u e n c e c o v e r a g e o f 6,8,9a n d 12a p p e a r s l o w ,b e c a u s e t h e o b s e r v e d p r o -t e i n s p o t s c o r r e s p o n d t o t r u n c a t e d f o r m s ,w h e r e a s t h e c o v e r a g e w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e f u l l -l e n g t h s e q u e n c e.Biotech,for conducting this collaboration.JXY acknowl-edges Aventis for their financial support.RAH and JAW thank Proteome Sciences Inc.for their financial support. RW thanks the Wellcome Trust for purchase of the MALDI spectrometer.Work in MJD©s laboratory is sup-ported by the British Heart Foundation.Received May,30,2000References[1]Berggren,K.,Chernolalskaya,E.,Steinberg,T.H.Kemper,C.,Lopez,M.F.,Diwu,Z.,Haugland,R.P.,Patton,W.F.,Electrophoresis2000,21,2509±2521.[2]Steinberg,T.H.,Lauber,W.M.,Berggren,K.,Kemper,C.,Yue,S.,Patton,W.F.,Electrophoresis2000,21,497±508.[3]Steinberg,T.H.,Jones,L.J.,Haugland,R.P.,Singer,V.L.,Anal.Biochem.1996,239,223±237.[4]Henzel,W.J.,Billeci,T.M.,Stults,J.T.,Wong,S.C.,Grim-ley,C.,Watanabe,C.,A1993,90, 5011±5015.[5]Mann,M.,Hojrup,P.,Roeppstorff,P.,Biol,Mass Spectrom.1993,22,338±345.[6]Pappin,D.J.C.,Hojrup,P.,Bleasby,A.J.,Curr.Biol.1993,3,327±332.[7]Liang,X.L.,Bai,J.,Liu,Y.H.,Lubman,D.M.,Anal.Chem.1996,68,1012±1018.[8]Patterson,S.D.,Aebersold,R.,Electrophoresis1995,16,1791±1814.[9]Wheeler,C.H.,Berry,S.L.,Wilkins,M.R.,Corbett,J.M.,Ou,K.,Golley,A.A.,Humphery-Smith,I.,Williams,K.L., Dunn,M.J.,Electrophoresis1996,7,580±587.[10]Morris,H.R.,Paxton,T.,Dell,A.,Langhorne,J.,Berg,M.,Bordoli,R.S.,Hoyes,J.,Bateman,R.H.,Rapid Commun.Mass Spectrom.1996,10,889±896.[11]Shevchenko,A.,Chernushevich,I.,Ens,W.,Standing,K.G.,Thomson,B.,Wilm,M.,Mann,M.,Rapid Commun.Mass Spectrom.1997,11,1015±1024.[12]Borchers,C.,Peter,J.F.,Hall,M.C.,Kunkel,T.A.,Tomer,K.B.,Anal.Chem.2000,72,1163±1168.[13]Kristensen,D.B.,Imamura,K.,Miyamoto,Y.,Yoshizato,K.,Electrophoresis2000,21,430±439.[14]Shevchenko,A.,Wilm,M.,Vorm,O.,Mann,M.,Anal.Chem.1996,68,850±858.[15]Gharahdaghi,F.,Weinberg,C.R.,Meagher,D.A.,Imai,B.S.,Mische,S.M.,Electrophoresis1999,20,601±605.[16]Rabilloud,T.,Electrophoresis1990,11,785±794.[17]Rabilloud,R.,Electrophoresis1992,13,429±439.[18]Arnott,D.,O©Connell,K.L.,King,K.L.,Stults,J.T.,Anal.Biochem.1998,258,1±18.[19]Heukeshoven,J.,Dernick,R.,Electrophoresis1985,6,103±112.[20]Weekes,J.,Wheeler,C.H.,Yan,J.X.,Weil,J.,Eschenha-gen,T.,Scholtysik,G.,Dunn,M.J.,Electrophoresis1999, 20,898±906.[21]Garden,R.W.,Moroz,L.L.,Moroz,T.P.,Shippy,S.A.,Sweedler,J.V.,J.Mass Spectrom.1996,31,1126±1130.[22]Winkler,M.A.,Kundu,S.,Robey,T.E.,Robey,W.G.,J.Chromatogr.A1996,744,177±185.[23]Perkins,D.N.,Pappin,D.J.,Creasy,D.M.,Cottrell,J.S.,Electrophoresis1999,20,3551±3567.[24]Altschul,S.F.,Madden,T.L.,Schäffer,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.,Lipman,D.J.,Nuclei Acids Res.1997, 25,3389±3402.[25]Vorm,O.,Mann,M.,J.Am.Soc.Mass Spectrom.1994,5,955±958.3672J.X.Yan et al.Electrophoresis2000,21,3666±3672。
电泳银染原理
电泳银染原理
电泳银染是一种常用的蛋白质分离和检测方法，广泛应用于生物学、生化学等领域。
其原理基于蛋白质的电泳分离和银离子还原反应。
电泳分离是将带电的蛋白质分子在电场作用下沿着凝胶中的孔道运移，从而实现蛋白质的分离和检测。
在电泳银染中，通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其原理是将蛋白质样品加入凝胶孔道中，在电场作用下，蛋白质分子根据大小、电荷等性质逐渐分离。
分离完成后，可以通过染色等方法进行检测。
银离子还原反应是电泳银染的核心步骤，其原理是在银离子存在的条件下，通过还原剂还原银离子成为固态银颗粒，从而实现蛋白质分子的染色。
常用的还原剂包括亚硫酸钠、甲醛等。
在电泳银染过程中，蛋白质分子与银离子结合形成银蛋白复合物，再通过还原剂的作用将银离子还原成银颗粒，最终形成黑色的银染带。
电泳银染的优点是灵敏度高、检测范围广、结果直观等。
但也存在一些缺点，如染色效果不稳定、重复性差、反应时间长等。
因此，在实际应用过程中需要根据具体情况进行调整和优化。
电泳银染是一种重要的蛋白质检测方法，其原理基于电泳分离和银离子还原反应。
虽然存在一些缺点，但其灵敏度高、检测范围广、结果直观等优点，使其在生物学、生化学等领域得到广泛应用。
银染方法总结
银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100 多种。
大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。
由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。
这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。
染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序：固定：30min或者更长时间100ml 乙醇（40% 乙醇）25ml冰醋酸（10% 冰醋酸）加水到250ml致敏：30min75ml 乙醇（30% 乙醇）17g乙酸钠或28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250ml 水洗：3 x 10min银染：20min0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)显色：视情况而定6.25 g Na2CO3、50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml终止：10min3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸加水到终体积250ml保存：1% 冰醋酸，4 ℃注意事项：1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。
2．甲醛在使用前加入。
3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。
4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。
5．银染液和显色液需要预冷。
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银染操作步骤1.固定：电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70rpm。
固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。
固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml 固定液，可大量配制室温存放。
2. 30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
30%乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30% 乙醇。
3.水洗涤：（洗2次）弃30%乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
4.增敏：（辅染）现配现用弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。
银染增敏液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。
银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。
银染增敏液(100X)的配制：即2.8%硫代硫酸钠溶液，需用黑袋包裹避光保存。
5.水洗涤(共2次)：弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
弃水，再加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
6.银染：弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
银溶液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。
银溶液(1X)配制后需在2小时内使用，最好是现配现用。
银溶液（100 X）的配制：称取5g硝酸银，加水溶解并稀释至500ml，摇匀即得1%的硝酸银溶液，需用黑袋包裹避光保存。
7.水洗涤：弃原有溶液，加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度为60-70rpm。
注意：水洗涤的时间不能超过1.5分钟。
8.显色：弃水，加入100ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10分钟，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70rpm。
银染显色液的配制：90ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入10ml银染基本显色液(10X),再加入0.05ml银染显色加速液(2000X)，混匀后即为银染显色液。
银染显色液配制后需在20分钟内使用。
银染基本显色液(5X)的配制：称取碳酸钠60g，加水溶解并稀释至500ml，摇匀即得12%碳酸钠溶液。
9.终止：加适量EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)终止弃银染显色液，加入100ml银染终止液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，终止时有气体产生属正常现象，产生的气体为二氧化碳。
银染终止液(1X)的配制：95ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入5ml银染终止液(20X),混匀后即为银染终止液(1X)。
银染终止液(1X)配制后宜当天使用。
10.水洗涤：弃银染终止液，加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5分钟，摇动速度为60-70rpm。
11.保存：可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存。
或采用适当的方式制备成干胶。
常见问题：1.背景太深：a.显色时间过长。
通常显色反应会在10分钟内结束，显色反应时间过长会导致背景很深。
b.洗涤不充分。
洗涤时间过短，或洗涤液加入的量不足，或者容器过于狭小导致摇动时溶液不易充分混合，或摇动速度过慢，导致混匀不充分。
请按照说明书的建议确保各种溶液的用量和作用时间，摇床的推荐速度为60-70rpm。
c.凝胶中原有的缓冲液等未在固定步骤中去除干净。
一方面需确保固定的时间和固定液的用量，另一方面对于不是最常用的Bis-Tris缓冲的凝胶需要更长的固定时间以充分去除凝胶中的原有缓冲成分，以降低背景。
d.水的纯度太低。
需使用大于16 MΩ·cm的高纯度水。
2.蛋白条带非常浅：a.蛋白的半胱氨酸(Cysteine)残基的含量特别低或几乎没有。
半胱氨酸残基的存在对于银染非常重要，半胱氨酸残基的含量过低会导致检测灵敏度下降。
b.银染后水洗
涤时间过长。
在银溶液染色时需严格控制水洗涤的时间，水洗涤的时间不能超过1.5分钟，否则会导致过多的银离子被洗去，导致检测灵敏度下降。
c.上样量不足。
本试剂盒检测BSA 的灵敏度可以达到0.3ng，对于不同的蛋白检测灵敏度可能不同。
对于一些蛋白可能需要大于1ng的蛋白量才能被检测到。
d.固定步骤后的洗涤不够充分。
导致少量乙酸残留，影响后续检测。
确保30%乙醇洗涤和水洗涤的用量和时间，可以适当延长洗涤时间。
3.凝胶上出现小点或或其它非蛋白的痕迹：a.凝胶没有充分被溶液浸没。
请注意选择大小合适的容器，并加入足量的各种溶液，同时需保持适当的混匀速度确保凝胶可以被溶液浸没。
b.用于银染的容器没有充分洗涤干净。
容器需先用洗涤剂充分洗涤，随后用自来水充分冲洗，最后用高纯度水再洗涤数次。
该容器最好能专用于银染，并注意避免各种可能的蛋白污染。
为确保充分洗涤干净，对于耐硝酸的容器，例如玻璃容器，可以在上述洗涤剂及自来水洗涤后用50%硝酸洗涤，随后用高纯度水充分洗涤。
c.指纹或其它压痕。
请注意戴手套操作，切勿直接接触皮肤。
操作时请注意尽量勿挤压、折叠或摩擦凝胶。
d.有金属物质接触凝胶。
金属物质例如金属镊子等接触凝胶会出现非特异性痕迹。
4.在60-70 kD处出现一片模糊的蛋白染色背景：皮肤上脱落的角蛋白(keratin)污染了蛋白样品。
一方面需注意戴手套操作，另一方面需注意盛放蛋白样品的容器盖子尽量不要敞开，甚至在取放蛋白样品时在超净台内进行以避免可能的角蛋白污染。
5.在凝胶的顶端处出现黄色背景：a.样品中DTT浓度很高。
采用其它适当的还原试剂，或者在许可范围内适当减少DTT的用量。
b.采用Tris-Glycine-SDS电泳体系。
Tris-Glycine-SDS电泳体系中的Glycine会导致背景凝胶的顶端出现轻微的黄色背景。
换用Tris-Tricine-SDS电泳体系则可显著消除此黄色背景。
6.银在染色器皿中出现沉淀：染色器皿中可能含有残余的洗涤剂或上次银染时的残余试剂。
需确保把染色器皿洗涤干净。