聚合酶链反应及其应用
PCR技术原理及其应用
pcr技术原理及其应用
contents
目录
pcr技术原理 pcr技术的应用 pcr技术的优缺点 pcr技术的发展趋势 pcr技术的实际应用案例
01
pcr技术ห้องสมุดไป่ตู้理
pcr定义
Pcr（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是一种在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
03
除了用于目的基因的扩增，PCR技术还可以用于基因突变检测和基因分型等应用。通过比较正常人和患者基因序列的差异，PCR技术可以帮助科学家们发现与疾病相关的基因突变，为疾病的诊断和治疗提供依据。
案例一：pcr技术在基因克隆中的应用
案例二：pcr技术在疾病诊断中的应用
01
02
03
pcr技术在疾病诊断中发挥了重要作用，尤其是在感染性疾病和遗传性疾病的诊断中。通过检测病原体或特定基因序列的存在，PCR技术能够快速、准确地诊断疾病。
pcr技术的实际应用案例
01
基因克隆是生物技术领域的一项重要技术，它能够将特定的基因片段从复杂的基因组中分离出来。PCR技术在此过程中发挥了关键作用，通过高精度和高灵敏度的扩增，可以快速、准确地获取目标基因片段。
02
在基因克隆中，PCR技术主要用于目的基因的扩增和检测。通过设计特定的引物，PCR技术能够特异性地扩增目标基因片段，从而实现基因克隆的目的。
高温
90-95℃，变性，使双链DNA解旋。
pcr反应条件
02
pcr技术的应用
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准确地获取特定基因片段，为基因克隆提供关键的DNA片段，从而实现基因的体外复制和遗传操作。
克隆步骤
首先，设计特定的引物，以便从模板DNA中扩增出所需的基因片段；然后，将模板DNA、引物和PCR反应所需的其他成分混合，进行PCR扩增；最后，将扩增得到的基因片段进行克隆，以便进一步的研究和应用。
PCR 技术及应用
PCR条件的选择
• DNA聚合酶
• 在其它参数最佳时，每100ul反应液中含12.5U(比活性为20U/pmol)Taq DNA聚合酶为佳。 然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物 而变化。当优化PCR时，最好在每100ul反应体积 中加入0.5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果 浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩 增带；过低时，则靶序列产量很低。
引物及dNTP的优化
酶及溴酚蓝的优化
PCR反应的最佳模式（CT为例）
• • • • • • • • • CT DNA PCR最佳反应体系： 反应混合物 终浓度 20×反应缓冲液 1× dNTP混合物 200M 引物Ⅰ 15pmol 引物Ⅱ 15pmol MgCl2溶液 2.0mM 无菌去离子水至 26l/反应管 取26l反应混合物，加入已经分装的Taq DNA聚合酶1u （固定化的酶）的离心管中， 加入2l待测DNA模板，混匀，铺上石蜡，37℃保温10分钟，然后进行PCR循环： 94℃ 300秒 – 94℃ 45秒 – 55℃ 45秒 35次循环 – 72℃ 45秒 – 72℃ 300秒
PCR反应基本原理
Mullis在建立PCR发明的初期，仅采用非常简单的三种温 度水浴进行实验，应用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的 Klenow片段来催化复性引物的延伸效应。由于该酶会在进 行DNA变性的温度下失活，所以每一轮反应中都要添加一 次酶，扩增片段的长度受到限制，操作繁琐。1988年， Saiki把一种耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）引入PCR 后，PCR技术的应用进入了实用阶段，随后PE-Cetus公司 推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。 PCR技术在微生物学，遗传病学，肿瘤学和法医学领域中 的应用越来越广，据文献报道PCR技术用于检测病原体的 种类已超过100多种。
PCR技术原理、实验步骤和应用
一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。
2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。
二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。
这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA 片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。
它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。
参与复制的有多种因素。
PCR 是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶0.5μL2、设置PCR反应程序。
聚合酶链式反应
行扩增。
实时监测
03
在PCR过程中，可以通过实时荧光检测或凝胶电泳等方法监测
扩增产物。
后续处理阶段
产物分析
数据整理与报告
PCR结束后，对扩增产物进行分析，如凝胶 电泳、测序等，以确定扩增的特异性。
整理实验数据，编写实验报告，包括PCR产 物的大小、特异性、重复性等信息。
质量控制
防止污染措施
确保实验过程符合质量控制标准，如引物 特异性、模板纯度等。
1990年代
第三代PCR仪出现，采用半导体材料 进行温度控制，提高了反应速度和灵 敏度。
05
04
1985年
第二代PCR仪问世，实现了温度自动 控制，提高了扩增效率和特异性。
在科学研究中的应用
基础研究
PCR技术可用于基因克隆、基 因突变分析、DNA测序等基础
研究领域。
医学诊断
PCR技术广泛应用于遗传病、 传染病、肿瘤等疾病的诊断和 监测。
THANKS
感谢观看
转基因作物检测
利用PCR技术，可以对转基因作物进行检测，确保食品安全和生态 安全。
动物疫病检测
通过PCR技术，可以对动物疫病进行快速、准确的检测，预防和控 制动物疫病的传播。
动物品种鉴定
利用PCR技术，可以对动物品种进行鉴定，保护动物资源和生态平衡。
06
PCR技术的未来展望
新技术的开发与改进
下一代PCR技术
个性化医疗
根据基因检测结果，可以为患者 提供个性化的治疗方案，提高治 疗效果和生存率。
生物进化研究
物种鉴定和分类
利用PCR技术，可以对生物物种进行鉴定和 分类，研究物种的进化关系和系统发育。
生物多样性研究
聚合酶链式反应技术及应用
聚合酶链式反应技术及应用作者：东锐来源：《绿色科技》2018年第08期摘要：指出了聚合酶链式反应是目前的一种最基本也是应用最广泛的技术。
由于PCR反应的快速、灵敏、操作简便等优点使其在短短的数年时间即被广泛应用于各大领域。
介绍了PCR反应的原理以及常用的PCR反应技术，探讨了该技术在医学、食品工业、环境监测、农业中的运用，以期提供参考。
关键词：聚合酶链式反应;技术;应用中图分类号：TS907文献标识码：A文章编号：16r 4-9944（2018）8-0230-021 引言20世纪80年代中期，Mullis发明了体外核酸扩增技术——聚合酶链式反应，又称PCR （ PolymeraseChain Reaction）反应。
PCR反应是一种在生物体外模拟生物体内复制进行特定的DNA片段的放大扩增的分子生物学技术。
PCR反应具有特异性强、灵敏度高、易重复、简便、快速等突出优点使其在短短的数年时间即被广泛应用于各大领域如医学诊断、环境监测、食品行业、农业、基因工程等。
笔者将从PCR反应的原理、技术及应用方面进行综述。
2 PCR反应的原理DNA的半保留复制，具有高度的保真性，保证亲代DNA和了代DNA具有相同的遗传信息，为维持物种的稳定性和连续性起着非常重要的作用。
PCR反应的基本原理就是模拟DNA 的体内复制过程进行DNA的体外扩增，通过设计特异性引物快速扩增所需的目的DNA序列。
该技术是在模板DNA、dNTP mix、特异性引物、耐热的DNA聚合酶（Taq酶）和含Mg2+的缓冲液存在下的酶促反应，反应需在PCR仪中完成。
PCR反应通常由变性、退火、延伸3个阶段构成：①变性。
酶促反应体系的温度加热至90～95℃，模板DNA双链变性解离成单链DNA;②退火。
温度降至50～55℃，引物与单链DNA结合，形成局部双链;③延伸。
反应体系的温度升高至72℃，以dNTP为原料，经热稳定的Taq酶的催化，合成一条与模板链互补的新DNA链。
pcr应用于遗传病的原理
PCR应用于遗传病的原理1. 什么是PCR？PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段，从而能快速、高效地产生大量目标DNA序列。
2. PCR在遗传病研究中的应用PCR在遗传病研究中的应用相当广泛。
它可以用于诊断遗传病的检测、疾病的遗传风险评估、基因突变的筛查、克隆特定基因等。
3. PCR的原理PCR主要由以下三个步骤组成：变性、退火和延伸。
3.1 变性（Denaturation）PCR反应开始时，将待扩增的DNA样品加热至94-96°C的高温。
高温会使DNA的双链解开，变为两条单链。
3.2 退火（Annealing）在变性步骤之后，PCR反应体系会降温至50-65°C，使引物（primer）能够与待扩增DNA的两个末端部分互相结合。
引物是短的DNA片段，它们的序列与待扩增DNA的两端互补。
引物的结合会导致新的DNA链合成起点的形成。
3.3 延伸（Extension）在退火步骤之后，PCR反应体系会加入DNA聚合酶、四个脱氧核苷酸（dNTPs）和盐溶液。
此时，DNA聚合酶会沿着引物延伸，合成与待扩增DNA互补的新DNA链。
这一步骤的温度约为72°C。
经过这三个步骤的循环反复进行，就可以扩增出大量的目标DNA序列。
3.4 PCR扩增的关键因素PCR扩增的关键因素包括模板DNA浓度、引物浓度、延伸时间、退火温度等。
合理选择这些因素可以保证PCR反应的准确性和高效性。
4. PCR扩增与遗传病诊断PCR扩增技术在遗传病的诊断中起着重要作用。
以下是PCR在遗传病诊断中的应用：•突变筛查：PCR可以检测特定突变位点的存在与否，从而判断个体是否携带突变基因。
•基因拷贝数变异：PCR可以检测基因拷贝数变异，判断某些基因的拷贝数量是否正常。
例如，在某些遗传性疾病（如遗传性失聪）中，可以通过PCR检测特定基因的拷贝数变异。
PCR技术及应用
2、引物的设计： 引物包括两条，即5/端引物和3/端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度
引物设计的基本要求： （1）引物长度: 15~30 nucleotides （2）碱基的分布尽可能随机，避免出现嘌 呤或嘧啶碱基的堆积现象。 No GGG or CCC at 3’-end (G+C) 45%~ 55% Tm=4(G+C)+2(A+T)
（3）dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+ 浓度降低
5）镁离子浓度 TaqDNA聚合酶的激活剂 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响；在一般的 PCR反应中，各种NTP浓 度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜； Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增， 浓度过低会降低，Taq DNA聚合酶的活性 不够，使反应产物减少。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR）
• 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
• 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 • 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪 • 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。
复制的起始
3
5 3
引物
5
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
复 制 过 程 简 图
PCR技术及应用
聚合酶链式反应
——PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA 作为引物，通过加温变性－退火－延伸（DNA合成） 这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。 由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25~30 个循环后，扩增倍数可达106。
中国的状况 1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等） 现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普 利等）
耐高温DNA聚合酶的种类
Taq
DNA聚合酶 Tth DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶
Tfl
(Thermus aquaticus，Cetus/Roche)
目前，TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动
物和植物的位点特异性基因打靶，与锌指核酸 酶系统相比有较大的应用优势，但仍然有些问 题需要解决，例如:脱靶效应、TALEN 与基因 组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关 等。
3. CRISPR /Cas9 基因组编辑技术
CRISPR (Clustered regularly interspaced short
充满梦想却幻灭的ZFN：
难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重 • 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target”。
•
2. TALEN 基因组编辑技术
PCR不只是一个方法改进
Mullis的上司有句“名言”，“我们
要扩增这么多DNA样品有什么用”。 到了1991，Cetus公司以3亿美元的 转让费将PCR相关专利转让给瑞士 Hoffman LaRoche公司，并在此后 的经营中又获得了数亿美元的分红。 Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖， PCR和DNA重组技术一样意义深远。
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在最佳反应条件下，KlenTaq DNA聚合酶出错率为 5.1 X 10–5， 性能略优于Taq DNA聚合酶。
用于PCR的DNA聚合酶简介
Tth DNA聚合酶（Thermus thermophilus）
Tth DNA聚合酶在Mn2+的存在下，能有效地反转录长度在1000碱 基以下的RNA；
Taq DNA酶在使用时应注意：
避免稀释保存Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性
用于PCR的DNA聚合酶简介
KlenTaq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）
KlenTaq DNA聚合酶是一种N端缺失了的Taq DNA聚合酶，因而 没有5’的核酸外切酶活性；
用于PCR的DNA聚合酶简介
DeepVent DNA聚合酶（Pyrococcus species GB-D）
DeepVent DNA聚合酶是一种在低温和高温条件下均极其稳定的 聚合酶，且能使用广范围的辅助溶剂如甲酰胺和DMSO等；
DeepVent DNA聚合酶能产生长达14 kb的扩增产物，其外切酶 活性比Vent DNA聚合酶高 4 倍，聚合活性比Taq DNA酶高5-15倍， 出错率比Vent DNA聚合酶低 2 倍；
5
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循环25-30次 ‘
目标DNA片段达106-
7
PCR反应的质量指标
PCR反应的质量标准有： 特异性（序列选择） 有效性（序列产量） 准确性（序列对错）
上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在PCR反应中必须 对多种参数进行联合控制和改进，但由于PCR反应中的各参数往往 是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效 性、准确性。
Tth DNA聚合酶在Mg2+的存在下，能由DNA模板合成DNA； Tth DNA聚合酶在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此能很 好地克服RNA链中普遍存在二级结构的难题。
用于PCR的DNA聚合酶简介
Pfu DNA聚合酶（Pyrococcus furiosus）
Pfu是一种高保真的DNA聚合酶，出错率极低； 7.0 X 10–7 - 1.6 X 10–6
PCR技术的诞生与发 展 PCR技术的基本原 理 PCR技术的反应条 件 PCR反应的质量指 标
PCR技术的诞生与发展
聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR ）又称为PCR 扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。
1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的 Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术；
与其它DNA聚合酶（如Taq酶）相比，具有相对较好的高保真性，其 出错率为2.4 X 10–5 - 5.7 X 10–5 ；
如果扩增长度大于2 kb，则需要高于2 mM的Mg2+，而在扩增长 度小于2 kb时，扩增产物的长度与Mg2+的浓度并无关联；
如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。
Pfu DNA聚合酶扩增出的产物带有平头末端； Pfu DNA聚合酶扩增速度极快，达1.5 - 2 min / kb； Pfu DNA聚合酶的热稳定性很高。
用于PCR的DNA聚合酶简介
Vent DNA聚合酶（Thermococcus litorVaelntisDN）A聚合酶具有3’→5’的核酸外切酶活性和校正功能，因此
DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA链的物理损伤 PCR反应体系的洁净度
DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响
DNA聚合酶的保真性主要取决于其3’→5’的核酸外切酶活性，它 负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNA聚合酶的 出错率在每轮延伸每核苷酸1.6 X 10–6 - 2.1 X 10–4范围内。DNA聚合 酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：
1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台 PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化；
1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝 尔化学奖；
1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。
PCR技术的基本原理
待扩增DNA区域
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PCR技术的反应条件
DNA或RNA模板 DNA引物 DNA聚合酶 dNTPs Mg2+（缓冲液）
待扩增DNA区域
2 PCR的DNA聚合酶与扩增的精 确性
PCR扩增反应的精确性
DNA聚合酶对PCR精确性的重要影 响 用于PCR的DNA聚合酶简介
DNA聚合酶的使用
PCR扩增反应的精确性
利用PCR技术扩增DNA靶序列的一个重要问题是这种DNA体外聚 合反应的序列忠实程度，即DNA扩增产物序列的准确率。PCR反应的 准确率远远低于细胞内的DNA聚合反应，除了缺少完善的DNA聚合校 正系统外，影响PCR反应准确率的因素还包括：
与dNTP的结合特异性 磷酸二酯键的形成速率 焦磷酸的释放速率 碱基错误掺入之后的持续延伸性 3’→5’的核酸外切活性的强弱
用于PCR的DNA聚合酶简介
Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）
Taq DNA酶的聚合出错率较高（2.1X10-4），因为它没有3’→5’的 的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使Taq酶的 聚合出错率降低到原来的1/3。Taq DNA聚合酶催化的聚合反应的普遍 错误类型是由AT转换为GC；如果模板DNA具有形成二级结构的可能性 则Taq DNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变。
聚合酶链反应及其应用
1 PCR的原理与反应条 2 件 PCR的DNA聚合酶与扩增的精确 3 性 PCR的模板及制 4 备 PCR的引物设计及合成
5 PCR反应的其它控制参 6 数 PCR技术的衍生与发展
7 PCR技术在生命科学研究中的应 8 用 PCR技术在临床医学方面的应用
1 PCR的原理与反应条件