重组胰蛋白酶
生物制药的非动物源性-李素霞
例1：重组人胰岛素过程中的AOF
供 仅 容
AOF 3胰岛素： 参会
参 表 代
未经 ， 考
本人 者 作
， 许 允
翻 不得
印
载 转 、
此内
1）若培养基中含有蛋白胨、酵母粉等，原料供 应商保证原料生产过程的无动物源性。 2 ）重组胰蛋白酶和重组羧肽酶B为动物源性的 重组酶。
Contents
参 表 代 未经 ， 考 本人 者 作
， 许 允
翻 不得
印
载 转 、
此内
容仅
会 参 供1
背景介绍
2
大肠杆菌表达系统中的动物源性问题
3
动物细胞表达系统中的动物源性问题
AOF生物药物的发展方向
201305 生物制药周
4
什么叫做动物源性？非动物源性？ ， 概念的应用范围 ：药物及其生产用原料； 经 ，未 考 动物源性原料 ： 参 表 会代 参 供 1 ）直接来源于动物：如牛肉膏，骨粉，牛血清…… 仅 容 此内 2）部分来源于动物：如植物蛋白胨的生产过程中用 牛/猪蛋白酶消化所得…… 动物源性药物： 1）直接来源于动物或人：如血液制品，人白蛋白、 人免疫球蛋白等 2）直接来源于动物：如猪胰岛素、胰蛋白酶、糜蛋 白酶、肝素、透明质酸，等等……在药典中称为 生化药物
无蛋白培养基： 无血清、无蛋白成分，化学组分确定 等特点 （合成培养基）
主要成分包括：各种必需氨基酸，小 肽，维生素，微量元素，离子等
201305 生物制药周
例2：疫苗、抗体研发过程中的AOF
仅 容 内 会 参 供
Rhinogen
产品说明书Rhinogen®胰蛋白酶（测序级）Rhinogen® Trypsin (Sequencing Grade)重组生产，不含动物源性成分，纯度高，比活高，适用于蛋白质组学研究中肽谱图、肽指纹谱或蛋白序列分析产品货号：QIP-003-A，QIP-003-B目录产品信息 (2)试剂包装 (2)产品来源 (2)产品质量 (2)产品特性 (2)保藏条件 (2)产品综述 (3)背景 (3)概述 (3)应用 (3)特性 (3)操作方法 (4)试剂准备 (4)推荐使用方法 (4)操作说明 (4)相关产品 (5)参考文献 (6)产品文档及支持 (7)产品文档 (7)技术支持 (7)试剂包装Rhinogen® Trypsin (Sequencing Grade)包装规格如下：目录号规格QIP-003-A 20μgQIP-003-B 5×20μg产品来源Rhinogen® Trypsin (Sequencing Grade)是利用重组大肠杆菌系统表达生产并经过多步层析纯化得到的重组胰蛋白酶，其氨基酸序列与猪源胰蛋白酶序列同源，分子量大小约为25kDa。
产品质量SDS-PAGE分析，纯度≥95%；没有检测到污染的蛋白酶活性。
产品特性最适pH为7.0~8.0；比活（单位/mg）≥4500USP units/mg。
保藏条件采用冰袋运输，收到产品后请立即将酶置于-20℃，密封防潮。
使用50mM HAc或1mM HCl溶解后，-70℃存放；若溶解后存于2-8℃，需在24hr内使用完毕。
避免室温下长时间放置，避免反复冻融。
背景胰蛋白酶（Trypsin）属于丝氨酸蛋白酶家族，能特异性切割多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基。
胰蛋白酶原由胰腺分泌，受肠激酶或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶。
它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶。
《中国药典》2020版—重组胰蛋白酶检测要求公示稿
1 通则重组胰蛋白酶检测要求公示稿
2 本品为生物制品生产过程中使用的原材料，系由高效表达胰蛋白酶基因的重组菌，经发
3 酵、分离和纯化后获得的重组猪胰蛋白酶，含适宜稳定剂，不含防腐剂。
可为浓缩的酶溶液
4 和冻干粉两种。
5 性状溶液为无色至淡黄色澄清液体。
冻干粉为白色或类白色结晶性粉末。
6 鉴别，7
8
9 以
10
11 则0401
12
13
14 式中
15 1.36
16 E1% A
17 吸收值为
18 A
19
20
21
22 式中
23 纯度照高效液相色谱法（通则0512）测定，面积归一化法计算重组胰蛋白酶纯度，β
24 胰蛋白酶不低于70%，α胰蛋白酶不高于20%。
25 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合多孔硅胶填充色谱柱（ODS 柱），柱
26 直径4.6mm，长25cm；粒度3μm，孔径200Å，柱温：40℃。
以1ml 磷酸（85%）用水定容
27 到1000ml 为流动相A 液，以1ml 磷酸（85%）用乙腈定容到1000ml 为流动相B 液，梯度洗。
胰蛋白酶最适PH及其稳定性
重组胰蛋白酶最适pH和pH稳定性样品：重组胰蛋白酶（RPT），比活4500USP units/mg pro.（上海雅心生物技术有限公司），纯度如图1所示，BAEE（Sigma）.图1.重组胰蛋白酶的纯度的SDS-PAGE鉴定1.最适pH的研究准备pH为3.0~12.0的底物BAEE（0.25mM），分别测定RPT纯酶液的活性，最后结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。
缓冲液成分依次为25mM NaAc-HAc(pH3.0~6.0)，25mM Tris-HCl(pH7.0~8.0)，25mM Gly-NaOH(pH9.0~12.0)，所有缓冲液均为25℃下配制。
底物在25℃温浴10分钟后，开始测活。
2.pH稳定性的研究取浓度为10mg/ml纯酶液，分别在pH3.0~12.0缓冲液中稀释10倍，在25℃下温浴2h，取样品测定酶活，以水浴前酶液初始活性作为100%，计算残余活性。
缓冲液依次为25mM NaAc-HAc (pH3.0~6.0)，25mM Tris-HCl(pH7.0~8.0)，25mM Gly-NaOH(pH9.0~12.0)，所有缓冲液均为25℃下配制。
图2.a,RPT最适pH曲线；b,RPT的pH稳定性分别在pH3.0~12.0不同的pH条件下，测定RPT活性。
结果见上图2a，最适pH范围是7.0~11.0，而pH为9.0时测得RPT活性为最大值，这与天然提取的猪胰酶不同（天然胰酶最适pH为7.6-9.0），几乎接近极值，确定该值为测活最适条件，但是底物在碱性条件易降解，所以底物尽量要现用现配。
分析不同pH环境对RPT活性的影响，如图2b所示，RPT在pH3.0NaAc-HAc缓冲液里最为稳定。
随着pH的升高，RPT酶活的损失程度也随之提高。
在测定RPT最适pH值时发现，pH≤5.0底物条件下，RPT蛋白几乎无活性，如图2a所示。
而图1b所示，在pH≤5.0的缓冲液中，2小时后依然保持较高的活性。
重组胰蛋白酶用途
重组胰蛋白酶用途胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的消化酶，主要负责分解蛋白质，帮助人体消化食物。
然而，传统的胰蛋白酶存在一些问题，例如耐酸性差、容易被胃酸破坏等。
为了克服这些问题，科学家们利用基因重组技术成功地合成了重组胰蛋白酶，这种酶具有更好的酸碱稳定性和抗胃酸能力。
重组胰蛋白酶在医药领域和食品工业中有着广泛的应用。
重组胰蛋白酶在医药领域有着重要的应用。
由于其具有更好的稳定性和抗胃酸能力，重组胰蛋白酶被广泛应用于治疗胰腺功能不全引起的消化不良症状。
胰腺功能不全是由于胰腺分泌的胰酶不足，导致食物中的蛋白质无法充分消化。
重组胰蛋白酶可以作为替代治疗，帮助患者消化食物，减轻胃肠道不适症状，并促进营养吸收。
重组胰蛋白酶在食品工业中也有着重要的应用。
在食品加工过程中，重组胰蛋白酶可以用作蛋白质降解剂，帮助改善食品口感和消化性。
例如，在面包、饼干等面点制作过程中，添加适量的重组胰蛋白酶可以使面团中的蛋白质分解成小分子肽和氨基酸，提高面点的柔软度和口感。
另外，在奶制品加工中，重组胰蛋白酶也可以用来促进乳清蛋白的水解，提高乳制品的消化性和营养价值。
重组胰蛋白酶还在生物工程领域有着广泛的应用。
由于其具有较高的催化活性和稳定性，重组胰蛋白酶被广泛用于蛋白质工程和基因工程中的相关研究。
在蛋白质工程中，科学家们可以利用重组胰蛋白酶对目标蛋白质进行酶切，得到特定的片段或产物，从而进行蛋白质结构和功能的研究。
在基因工程中，重组胰蛋白酶可以用于对基因进行定向剪切、连接和修饰等操作，促进基因工程的进展。
总结起来，重组胰蛋白酶作为一种改良的消化酶，在医药领域和食品工业中有着广泛的应用。
它可以作为治疗胰腺功能不全的替代治疗药物，帮助患者消化食物，改善胃肠道症状。
同时，在食品加工中，重组胰蛋白酶可以用来改善食品口感和消化性，提高食品的质量。
此外，重组胰蛋白酶还在生物工程领域有着重要的应用，用于蛋白质工程和基因工程的研究。
随着科学技术的不断进步，相信重组胰蛋白酶将会在更多领域发挥重要作用，为人类的健康和生活质量带来更多的福祉。
提取与重组胰蛋白酶的不同
胰蛋白酶与重组胰蛋白酶药典标准比较胰蛋白酶药典标准历史2014年之前，只有从猪或牛胰腺提取的胰蛋白酶的标准，活性标准为2500USP units/mg，目前临床已不应用。
在2011年左右，通过了胰蛋白酶:糜蛋白酶（6:1）配方，用于消化道疾病的治疗。
在2013年12月出版了修订稿的“用于生物医药制造过程的辅助材料”，重组胰蛋白酶作为一个例子，给出标准。
2017年2月，FDA正式颁布胰蛋白酶的药典标准。
2010版中国药典第二部规定:药品的安全性保障得到进一步加强。
凡例中规定所有来源于人或动物的供注射用的原料药均增订“制法要求”。
在总则十四规定：（1）来源于动物组织提取的药品，其所用动物种属要明确，所用脏器均应来自经检疫的健康动物，涉及牛源的应取自无牛海绵状脑病地区的健康牛群；来源于人尿的药品，均应取自健康人群。
上述药品均应有明确的病毒灭活工艺要求以及质量管理要求。
（2）直接用于生产的菌种、毒种、来自人和动物的细胞、DNA重组工程菌及工程细胞，来源途径应经国务院药品监督管理部门批准并应符合国家有关的管理规范。
2010版中国药典第三部规定:2010版药典对安全性问题更加重视。
增修订细菌内毒素检查的品种达112种；药典三部增订了逆转录酶活性检查法等。
培养细胞用牛血清应来源于无牛海绵状脑病地区的健康牛群，其质量应符合本药典的有关规定；在生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程中，应提供细胞培养液的详细成分，如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、乳蛋白水解物胰蛋白酶重组胰蛋白酶外观形状白色或类白色溶解性可溶溶解性可溶生物载量NMT100CFU/ml 微生物限量-比活力(USP units/mg pro.)NLT3800金黄色葡萄球菌阴性纯度（HPLC）NLT70%β-trysin,NMT20%α-trypsin绿脓假单胞菌阴性沙门氏菌阴性干燥失重不高于5.0%灼烧残渣不高于2.5%糜蛋白酶限量不高于5.0%活性不低于2,500USP units/mg美国药典中，两种胰蛋白酶的标准的主要不同点:项目胰蛋白酶2014美国药典来源动物来源：从猪或牛的胰腺提取重组（无动物源性）：DNA来源产品纯度检测方法无HPLC活性2,500USP units/mg比活性：3800USP units/mg pro.美国药典中最重要的不同点:①无动物源性，由于辅料的质量，包括酶，应用在生物医药制造，会对治疗用产品有影响，因此无动物源性重组胰蛋白酶的使用是对于人畜共患病的病毒感染的必要预防措施。
人胰蛋白酶原料
人胰蛋白酶的主要原料来自于牛、猪、羊的胰脏。
通过多重结晶方式纯化，并进一步采取层析及超滤技术制备而得。
该酶易溶于水，不溶于三氯甲烷、乙醇、乙醚等有机溶剂。
在pH1.8时，酶短时间煮沸几乎不失活，在碱溶液中加热则会变性沉淀。
Ca2+对酶有影响，可增强其活性。
此外，还有一种由重组大肠杆菌表达的重组人胰蛋白酶，其氨基酸序列与人胰蛋白酶完全一致。
这种重组胰蛋白酶也具有与动物源性猪胰蛋白酶相同的酶学性质，可替代猪胰腺来源胰蛋白酶应用于各种生物技术过程中。
值得注意的是，胰蛋白酶易受丝氨酸蛋白酶抑制剂如 PMSF，抑肽酶等抑制，金属离子螯合剂如EDTA等抑制酶活。
所以在使用胰蛋白酶时，需要选择合适的抑制剂和反应条件。
2020版中国药典重组胰蛋白酶质量标准
2020版中国药典重组胰蛋白酶质量标准标题：解读2020版中国药典重组胰蛋白酶质量标准——打开消化酶曙光导语：2020版中国药典的发布对于医药行业来说是一次重要的里程碑。
其中，重组胰蛋白酶质量标准的更新更是备受关注。
作为一种重要的消化酶剂，胰蛋白酶的质量标准的提升将对医药领域产生广泛影响。
本文将深入剖析2020版中国药典重组胰蛋白酶质量标准，从简单到复杂，从表面到内涵，带您全面了解并解读该标准的意义与价值。
正文：一、胰蛋白酶简介与来源胰蛋白酶是一种广泛存在于动物体内的消化酶，主要参与蛋白质的消化与分解过程。
而重组胰蛋白酶则是利用基因工程技术将人类胰蛋白酶基因导入真核生物表达系统中进行大规模生产的产物。
重组胰蛋白酶由于其来源纯正、生物活性高等优势，在医药领域中得到广泛应用。
二、2020版中国药典重组胰蛋白酶的主要更新内容对于重组胰蛋白酶的质量标准的更新，2020版中国药典做出了一系列重要修订。
主要更新内容包括但不限于以下几个方面：1. 液体剂型的质量标准2. 粉剂剂型的质量标准3. 酶活测定的方法与标准4. 纯度与杂质限度的要求三、重组胰蛋白酶质量标准更新的意义与价值重组胰蛋白酶质量标准的更新，不仅仅是对该药物本身质量的保证，更关系到患者的安全与疗效。
在2019年中国的重组生物制品市场，重组胰蛋白酶以其广泛的应用和巨大的市场需求，逐渐成为医药领域的焦点。
2020版中国药典重组胰蛋白酶的更新将进一步规范和提高该药物的质量标准，为患者提供更安全、高效的治疗选择。
四、个人观点与理解作为一名从业多年的医药领域专业人士，我对于2020版中国药典重组胰蛋白酶质量标准的更新持积极态度。
我认为通过规范化的质量标准，可以有效提升药品的疗效和安全性，最终造福于患者。
胰蛋白酶的质量标准的提升也将推动我国生物制品行业的发展，为我国的医药行业注入新的动力。
总结回顾：通过全面解读2020版中国药典重组胰蛋白酶质量标准，我们可以深入了解该药物的原理、来源和应用。
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重组胰蛋白酶
Cat.No.:RPT0201
CAS:9002-07-7
EC: 3.4.21.4
来源：重组猪胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达
1.简介
胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，可于赖氨酸及精氨酸C末端剪切肽键。
胰蛋白酶广泛用于各种生物技术过程中。
如：蛋白质酶解生产多肽；各种组织的细胞分离；蛋白质的酶解、测序；重组胰岛素生产等等。
重组猪胰蛋白酶是由重组大肠杆菌表达生产，氨基酸序列与猪胰腺来源的阳离子型胰蛋白酶完全一致。
酶切特异性相同。
分子量为24kD，最适pH为7-10。
活性受丝氨酸蛋白酶抑制剂如PMSF等的抑制，金属离子螯合剂如EDTA等抑制酶活。
2.优势
无动物源性：重组生产，无外源性的病毒污染，如猪流感病毒、猪细小病毒等。
纯度高：无其它杂酶污染；酶切反应无其它副反应。
稳定：冻干粉，易于储存和运输；批量生产，产品质量稳定。
3.特性
来源重组大肠杆菌
纯化HPLC
性状白色冻干粉
比活≥3800 USP u/mg pro
纯度(RP-HPLC) ≥70% β-胰蛋白酶, ≤20% α-胰蛋白酶
其他酶含量无糜蛋白酶、羧肽酶A等污染
活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml (1cm 光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值
增加0.003定义为一个USP单位。
4.用途
重组猪胰蛋白酶具有与动物源性猪胰蛋白酶相同的酶学性质，可替代猪胰腺来源胰蛋白酶应用于各种生物技术过程中，如：重组胰岛素生产；细胞培养、细胞发酵；蛋白质的酶解、测序；各种组织的细胞分离等。
5.推荐使用方法
使用1mMHCl溶解，重组胰蛋白酶浓度为1-10mg/ml 。
使用时，酶量：目的蛋白=1：50-1：1000，最适PH为7-9。
6.相关产品
重组羧肽酶B。