【CN109913547A】一种血浆外泌体miRNA分子标志物及其在制备试剂盒中的应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日

(21)申请号 201910157340.8

(22)申请日 2019.03.01

(71)申请人浙江大学医学院附属妇产科医院地址 310000 浙江省杭州市上城区学士路1号

(72)发明人陆燕　刘鹏渊　吕卫国　郑梦月　

(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司 33200代理人黄欢娣　邱启旺

(51)Int.Cl.C12Q 1/6886(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/113(2010.01)

(54)发明名称一种血浆外泌体miRNA分子标志物及其在制备试剂盒中的应用(57)摘要本发明公开了一种血浆外泌体miRNA生物标志物及其在用于宫颈癌早期诊断的微量数字PCR试剂盒中的应用，所述分子标记的RNA序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示。以本发明标记物为基础进行检测，灵敏度高，特异性好，AUC可高达0.992，诊断效果良好。在测试数据中，根据其中的2个miRNAs的表达量，能有效区分宫颈上皮内瘤变1级以下和宫颈上皮内瘤变2级以上的患者样本。本发明公开的新型的血浆外泌体miRNA分子标记物具有良好的诊断指标的特性，所开发的用于检测这8个miRNA的诊断试剂盒及检测方法，所述试剂盒由特异性扩增引物以及通用PCR扩增试剂组成，可以有效用于宫颈癌筛查诊断，具有

较高的临床使用和推广价值。权利要求书1页说明书7页

序列表2页附图4页CN 109913547 A2019.06.21

CN 109913547

A1.一种新型的血浆外泌体microRNA分子标记物，其特征在于，来源于血浆外泌体，其中

所述的microRNA选自下组：let-7a-3p,let-7d-3p,miR-30d-5p,miR-144-5p,miR-182-5p,

miR-183-5p,miR-215-5p和miR-4443，或其组合，它们的RNA序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ

ID NO:8所示。

2.一种用于宫颈癌早期筛查诊断的microRNA指纹图谱，其特征在于，所述指纹图谱包

括选自下组2种及以上microRNA：let-7a-3p,let-7d-3p,miR-30d-5p,miR-144-5p,miR-

182-5p,miR-183-5p,miR-215-5p和miR-4443。

3.一种权利要求1所述分子标记在制备用于宫颈癌筛查诊断的试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，试剂盒包含以下标记物：let-7a-3p,let-

7d-3p,miR-30d-5p,miR-144-5p,miR-182-5p,miR-183-5p,miR-215-5p和miR-4443。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含采用以下四个内参：miR-

128-3p，miR-129-5p,，miR-320a，和let-7i-

5p。权　利　要　求　书1/1页

2CN 109913547 A

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外泌体提取试剂盒及其在肿瘤等疾病液体活检中的应用[发明专利]

专利名称：外泌体提取试剂盒及其在肿瘤等疾病液体活检中的

应用

专利类型：发明专利

发明人：张灏

申请号：CN201510508129.8

申请日：20150818

公开号：CN105087546A

公开日：

20151125专利内容由知识产权出版社提供

摘要：本发明涉及提取RNA的方法、试剂盒以及RNA的应用。该方法包括：S1、将生物样品离心

以获得上清液；S2、在上清液中加入外泌体沉淀溶液，在混匀、离心之后获得外泌体沉淀物；S3、在

外泌体沉淀物中加入总RNA抽提试剂以及等体积的酒精，剧烈混合之后加入吸附柱；S4、离心吸附

柱，且之后加入RNA预洗液、RNA清洗缓冲液以及去离子水反复冲洗并离心以获得总RNA。还涉及

从体液的外泌体中提取的融合RNA和其他肿瘤特异性RNA在肿瘤早期诊断、筛查、诊治方面的应用。

通过从外泌体中提取融合RNA和其他肿瘤特异性RNA，从而将其用于例如食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤

的早期诊断、筛查，从而简单地实现了创伤小，病人依从性好、收集储存方便的癌症液体诊断。

申请人：张灏

地址：515014 广东省汕头市饶平路7号汕头大学肿瘤医院

国籍：CN

代理机构：深圳市顺天达专利商标代理有限公司

代理人：邹秋菊

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一种外泌体的提取方法及其应用与流程

一、引言

外泌体是一种存在于细胞外液中的小颗粒，其直径一般在30-150纳米之间。外泌体中富含蛋白质、核酸、脂质等生物分子，具有广泛的生物学功能。近年来，外泌体的提取方法及其应用得到了广泛关注。本文将介绍一种常用的外泌体提取方法，并探讨其在生物医学研究中的应用与流程。

二、外泌体提取方法

目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、滤膜法、沉淀法和免疫亲和法等。其中，超速离心法是最常用的方法之一。其主要步骤如下：

1. 收集细胞培养上清液或生物体体液，如血浆、尿液等。

2. 进行一系列离心步骤，以去除细胞碎片和大颗粒物质。一般先进行低速离心，去除大颗粒物质，然后再进行高速离心，沉淀外泌体。

3. 分离外泌体。将高速离心上清液转移到新离心管中，再次进行超高速离心，将外泌体沉淀下来。

4. 去除上清液，将外泌体沉淀悬浮于适当的缓冲液中。

三、外泌体的应用与流程

外泌体作为一种新型的细胞间通讯介质，具有广泛的应用前景。下面将介绍其在生物医学研究中的应用与流程。

1. 生物标志物的发现与应用

外泌体中含有丰富的蛋白质和核酸等生物分子，这些分子的组成和含量可以反映细胞的生理状态和病理变化。因此，外泌体被广泛应用于生物标志物的发现与应用。研究人员可以通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，来寻找与特定疾病相关的生物标志物，从而实现早期诊断和治疗监测。

2. 药物传递系统的研究与应用

外泌体具有天然的包裹和传递生物分子的能力，因此被广泛应用于药物传递系统的研究。研究人员可以将药物封装在外泌体中，并通过改变外泌体的表面性质，实现药物的靶向输送和释放。这种外泌体作为药物传递系统的方法具有较高的稳定性和生物相容性，对于治疗肿瘤等疾病具有潜在的应用价值。

3. 疾病机制的研究与探索

外泌体中富含的生物分子可以提供重要的疾病机制信息。通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，研究人员可以了解疾病发生发展的分子机制，从而为疾病的治疗和预防提供新的思路和靶点。

外泌体在生物学中的应用

外泌体是指一种直径约30-100纳米的小囊泡，由细胞膜包裹的细胞器，内含有多种生物活性物质，如蛋白质、mRNA、miRNA等。近年来，外泌体在生物学领域的应用引起了越来越多的关注。本文将从外泌体的来源、组成成分以及应用领域等多个方面介绍外泌体在生物学中的应用。

一、外泌体的来源

外泌体来源很广泛，可以从细胞、血浆、尿液、口腔分泌物等多种来源中获取。其中，细胞的外泌体分为三类：迷走体（exosomes）、微泡（microvesicles）和释放的膜碎片（ectosomes）。其中迷走体是比较稳定的来源，其组成和分泌机制已得到更好地研究。

二、外泌体的组成成分

外泌体主要由脂质双层以及各种负载物质组成。负载物质主要包括mRNA、miRNA、蛋白质、细胞表面分子等多种物质。其中，miRNA是外泌体中最为丰富的组分。miRNA是一种长度约22个核苷酸的非编码RNA，其主要作用是通过结合到靶基因mRNA的3'UTR区域，调节该基因的表达水平。外泌体中miRNA的含量较大，主要是由于外泌体通过释放自身外泌体质量大于的囊泡，选择性地富集与miRNA相关的mRNA和RISC复合体，从而将这些mRNA和RISC复合体呈泡形式释放出来。

三、外泌体在基因治疗中的应用

外泌体在基因治疗中的应用较为广泛，可用于miRNA等的递送。例如，将miRNA通过外泌体释放递送到肿瘤细胞中，从而调节基因表达，抑制肿瘤生长。此外，外泌体可通过逆转录病毒（retrovirus）或腺病毒（adenovirus）等载体的抑制作用，从而保护RNA在细胞质内的稳定性，由此发挥治疗效果。

四、外泌体在诊断中的应用

外泌体还可用于疾病的诊断。外泌体中含有多种蛋白质，这些蛋白质可作为生物标志物用于疾病的检测。例如，一些癌症病人具有非常高的外泌体水平，这些外泌体中含有特异性蛋白，在早期肿瘤的筛查和诊断中起到重要的作用。

五、外泌体在药物治疗中的应用

血浆中 miRNA 作为疾病标志物的应用

miRNA 是一个名为微小 RNA 的基因调控分子，在细胞及其外泌体、组织甚至血浆中都可以检测到，它可以通过靶向同源序列诱导基因沉默，从而对细胞和基因进行调控，从而影响生物学功能和疾病的发生和发展。近年来，越来越多的研究表明，血浆中的 miRNA 是疾病的重要生物学标志物，可以用于疾病的早期诊断、预测疾病的发展和预后，以及监测治疗效果。

miRNA 对人类健康的影响

miRNA 对人体发育、免疫系统和生物化学等方面的影响非常重要。它们可以调控基因表达，并影响细胞增殖、分化和凋亡等生命过程。许多疾病都与 miRNA

的变化有关，包括癌症、心血管疾病、神经系统疾病和免疫系统疾病等。在这些疾病中，miRNA 的异常表达通常与疾病的发生、发展和恶化有关，说明 miRNA 对人类健康的影响是非常深远的。

血浆中 miRNA 作为疾病标志物的潜力

由于 miRNA 能够调节基因表达，它对人体的生物节律和代谢有着重要的影响。许多疾病的发生和发展都与 miRNA 的异常表达有关，例如心血管疾病和流行性病毒感染等。因此，血浆中的 miRNA 成为了潜在的疾病标志物。

通过研究血浆中的 miRNA 可以预测疾病的发展，例如乳腺癌、肺癌和前列腺癌等。这些研究表明，血浆中的 miRNA 是一种非常敏感的疾病标志物。与传统的疾病标志物相比，它更早地发现了疾病的存在，并且更能准确地确定疾病的类型和严重程度。

miRNA 的优异性质使得它非常适合作为血浆中的疾病标志物。miRNA 的小分子大小和通过机体的血液循环易于检测的性质使其成为一种最受欢迎的疾病生物标志物之一。血浆中 miRNA 作为疾病标志物在不同疾病中的应用

目前，血浆中的 miRNA 已被证明可以在许多疾病中作为一种重要的生物标志物。

心血管疾病：miRNA 在心血管疾病的发展和进展中起着非常重要的作用。研究发现，一些 miRNA 受到心肌缺血和心肌梗死等心血管疾病的影响，对心脏细胞的功能产生了明显的影响。所以，血液中的 miRNA 可以用来预测心脏病发生的风险，并判断患者是否需要心脏病治疗。

分离外泌体的方法

外泌体是由细胞分泌的微小囊泡，直径通常在 30 150 纳米之间，它们在细胞间的通讯、疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。因此，有效地分离外泌体成为了相关研究和应用的关键步骤。以下将详细介绍几种常见的分离外泌体的方法。

超速离心法

超速离心法是分离外泌体的经典方法之一。其基本原理是利用不同颗粒在离心力场中的沉降速度差异来实现分离。

首先，将含有外泌体的样本，如细胞培养上清液或血浆，通过低速离心去除细胞和细胞碎片等较大的杂质。然后，将上清液转移到超速离心机中，以极高的速度离心。在离心过程中，外泌体逐渐沉淀到离心管底部，形成沉淀。

超速离心法的优点是能够获得相对纯净的外泌体，但它也存在一些局限性。例如，该方法操作较为繁琐，需要较长的时间和专业的设备。此外，高速离心可能会对外泌体的结构和功能造成一定的损伤。

密度梯度离心法

密度梯度离心法是在超速离心的基础上，利用介质形成密度梯度，从而提高分离的纯度和效率。通常使用蔗糖、碘克沙醇等物质来制备密度梯度介质。将预处理后的样本小心地铺在密度梯度介质的上方，然后进行离心。在离心过程中，外泌体根据其密度在梯度介质中形成不同的条带，从而实现分离。

与超速离心法相比，密度梯度离心法能够更好地去除杂质，获得更纯净的外泌体。然而，该方法同样需要专业的设备和较为复杂的操作。

超滤法

超滤法是基于膜过滤的原理来分离外泌体。

使用具有特定孔径的超滤膜，通常孔径在 100 纳米以下。将样本通过超滤膜，由于外泌体的大小小于膜孔径，它们能够通过膜而其他较大的颗粒和杂质则被截留。

超滤法的优点是操作相对简单、快速，并且能够处理较大体积的样本。但是，超滤膜可能会对外泌体产生一定的吸附作用，导致外泌体的损失。

免疫亲和捕获法

免疫亲和捕获法是利用外泌体表面的特异性标志物，通过抗体与标志物的特异性结合来分离外泌体。

首先，将与外泌体标志物特异性结合的抗体固定在固相载体上，如磁珠。然后，将样本与固相载体混合，使外泌体与抗体结合。最后，通过磁场或其他方法将结合了外泌体的固相载体分离出来。这种方法具有较高的特异性和选择性，能够获得纯度较高的外泌体。但它的缺点是抗体的成本较高，并且可能存在非特异性结合的问题。

外泌体鉴定标准

1 外泌体鉴定标准

外泌体的鉴定通常包括以下几个标准：

1. 形态和大小：外泌体通常呈现出球形或类球形的形态，直径在 30-150nm 之间。

2. 标志物检测：外泌体表面通常表达一些特定的蛋白质，如 CD9、CD63、CD81 等，可以通过免疫印迹、流式细胞术等方法进行检测。

3. 粒子数量和浓度：外泌体的数量和浓度可以通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）或动态光散射（DLS）等技术进行测量。

4. 生物活性：外泌体可以携带多种生物分子，如蛋白质、核酸等，这些分子可以影响受体细胞的生物学行为，如增殖、凋亡、迁移等，可以通过细胞培养、体内实验等方法进行检测。

5. 来源鉴定：外泌体的来源可以通过细胞类型、培养条件、处理方法等因素进行鉴定。

综合运用以上标准可以对外泌体进行鉴定和分析，为其在生物医学领域的应用提供基础。

外泌体在心血管疾病诊疗中的作用研究进展

李福山;房冉;饶琳;孟飞龙;赵小立

【期刊名称】《浙江大学学报（医学版）》

【年(卷),期】2018(047)003

【摘要】外泌体是内吞作用起源的脂质微囊泡,其内容物含微小RNA、mRNA转录本、蛋白质和脂质等.外泌体的分泌过程与细胞生理、病理条件密切相关,不同生理和病理状态下外泌体内容物成分会发生应激性变化.因此,心血管疾病发生过程中产生的外泌体内容物成分可以作为疾病状态判断的标志物.此外,不同细胞来源的外泌体还能够在动脉粥样硬化、心肌梗死、缺血再灌注损伤等心血管疾病的治疗中发挥重要作用.本文综述了外泌体在心血管疾病诊断与治疗中的应用和作用机制研究进展,为外泌体在心血管疾病中的应用提供依据.

【总页数】7页(P320-326)

【作者】李福山;房冉;饶琳;孟飞龙;赵小立

【作者单位】浙江大学生命科学学院,浙江杭州310058;浙江大学生命科学学院,浙江杭州310058;浙江大学生命科学学院,浙江杭州310058;浙江大学生命科学学院,浙江杭州310058;浙江大学生命科学学院,浙江杭州310058

【正文语种】中文

【中图分类】Q2;R54

【相关文献】 1.外泌体在心血管疾病诊疗中的研究进展 [J], 刘辉

2.外泌体在心血管疾病诊断和治疗中的作用研究进展 [J], Lu Fangfang;Weng

Zhen;He Yang

3.外泌体及其在心血管疾病发生发展中的作用研究进展 [J], 王云溪; 陈宁

4.外泌体影响血管内皮功能的研究进展及在心血管转化医学中的应用前景 [J], 彭露;秦彦文;张慧娜

5.外泌体miRNA在心血管疾病中作用的研究进展 [J], 杨海霞;鲍牧兰;巴德仁贵;徐鸿林;曹晓宇;赵艺杰;常欣;孙颖;其乐木格;谢伟;邵国

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外泌体提取和鉴定

外泌体是一种由细胞分泌的微小囊泡，直径通常在 30 150 纳米之间。它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。因此，外泌体的提取和鉴定成为了生物医学研究中的关键技术。

外泌体的提取方法多种多样，常见的包括超速离心法、超滤法、免疫亲和捕获法、沉淀法等。

超速离心法是外泌体提取的经典方法。其基本原理是利用不同的离心速度和时间，逐步去除细胞碎片、大囊泡和其他杂质，最终获得较为纯净的外泌体。这个过程通常需要多次离心，操作较为繁琐，且需要昂贵的超速离心机设备。但它的优点是能够获得较高纯度的外泌体。

超滤法是基于膜孔径的大小来分离外泌体。通过选择合适孔径的超滤膜，可以让小分子物质和溶剂通过，而将外泌体截留在膜上。这种方法相对简单快捷，但外泌体的纯度可能不如超速离心法。

免疫亲和捕获法是利用抗体与外泌体表面特异性抗原的结合来实现分离。这种方法具有较高的特异性和选择性，但抗体的成本较高，且可能存在非特异性结合的问题。

沉淀法是通过加入特定的试剂，如聚乙二醇（PEG），使外泌体从溶液中沉淀下来。该方法操作简便，但获得的外泌体可能会含有较多的杂质。在实际应用中，选择哪种提取方法取决于实验的需求和条件。如果需要高纯度的外泌体进行深入的机制研究，超速离心法可能是较好的选择；如果是大规模的样本处理或者对纯度要求不是特别高，沉淀法或超滤法可能更为合适。

提取到外泌体之后，接下来就是鉴定。外泌体的鉴定通常包括形态学观察、粒径分析、标志物检测等方面。

形态学观察可以通过电子显微镜技术，如透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。TEM 能够清晰地显示外泌体的形态、大小和结构；SEM 则可以提供外泌体的表面特征。通过电镜观察，可以看到外泌体呈现为具有典型双层膜结构的圆形或椭圆形小囊泡。

粒径分析常用的技术是纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）。NTA 可以通过追踪单个颗粒的布朗运动来测量外泌体的粒径分布和浓度；DLS 则是基于散射光强度的波动来计算粒径。

外泌体简述(2022)

所有细胞包括真核生物和原核生物的细胞，不论在生理条件还是在病理条件下均可以释放细胞外囊泡（EVs），细胞外囊泡根据"身材"大小，大致可以分为两类:

（1）微泡（ectosomes，microvesicles,microparticles）：直径在50nm~1μm，通过细胞质膜向外出芽形成。

（2）外泌体（exosomes）：直径在40nm~160nm,平均直径为100nm，来源于内体（endosome）.细胞质膜内陷可以形成多泡体，多泡体与其他细胞内囊泡和细胞器融合，为外泌体的形成提供了不同类型的原料。

外泌体具有和细胞类似的拓扑结构，包含DNA，RNA，蛋白质，脂质和小分子代谢物等物质。关于外泌体产生的生物学意义和功能还存在很多未知的奥秘值得探索和研究。

目前，关于外泌体的研究主要集中在外泌体的分离，功能的分类。功能的研究主要通过体外的组织培养，还难以达到一定分辨率的活体追踪和检测。

关于外泌体功能的推测

（1）清除细胞中多余的或不必要的物质，维持细胞内环境的稳态。

（2）细胞间通讯的信使。

外泌体前世之生物合成

外泌体的从头合成和内体成熟途径相关。细胞质膜内陷可以形成早期内体，早前存在的早期内体或者ER，Golgi出芽形成的囊泡与早期内体融合可以为早期内体提供内容物。早期内体（Rab5为标志物）通过酸化和物质交换成熟形成晚期内体(Rab7为标志物)。晚期内体最终可以形成多泡体（MVBs），多泡体内含有管腔内泡（ILVs），这些管腔内泡是通过多泡体膜向内凹陷出芽形成的。多泡体和溶酶体或自噬溶酶体融合发生物质降解，而和细胞质膜融合会导致管腔内泡分泌到细胞外，这些管腔内泡就是外泌体。由此可知，Rab，ESCRT（内吞体分选转运复合体）以及SNAREcomplex 等内体运输和分泌相关的蛋白会对外泌体的生成产生影响。

外泌体主要研究成果时间进程

1983年

Eberhard G.Trams于绵羊网织红细胞中发现外泌体；

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