fish-荧光原位杂交.ppt
FISH实验ppt课件
生物多样性等研究领域被广泛采用。近几年, 应用FISH 技术
研究自然环境微生物群落的报道较多, 如海水沉积物的群落, 海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄 居群落等。
食品检测方面：传统的食品微生物检测大多采用培养 分离的方法，食品中菌落总数测定采用平板计数法获得结 果需要1-2 d，致病位杂交应用最成功的是基因定位。基因定位研 究是构建基因图谱的基本要素, 基因位置的确定有助于了 解基因的功能, 利用FISH 技术, 可以直接确定某一DNA 序
列在染色体上的位置。
二、FISH实验及图例展示
• 1、样本的准备与处理
• 2、实验操作及注意事项
• 3、实验结果的检测 • 4、实验图例的展示
间有互补的碱基序列，在已有的放射性原位杂交技
术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位
杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针与组
织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合 成专一的核酸杂交分子，通过荧光检测系统将待测 核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
2、FISH的发展
• 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获 得成功。
现今越来越多的学者趋向于FISH与IF的结合实验，通 俗一点讲，就是在同一个样本上既进行FISH实验，又同时
进行IF实验检测。这方面实验一般适用于检测一个目的基
因以及该目的基因所相对应的蛋白，我们公司在这方面实 验上条件已非常成熟。另外公司也提供其他方面的实验服 务，有Southern blot 、Northern blot、CHIP、COIP， QPCR等等；蛋白类实验有IHC、IF、WB等。
荧光原位杂交技术FISH
荧光原位杂交技术FISH1 目的通过FISH实验检测两条Brd2基因cRNA探针的效价。
2材料与仪器2.1材料件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；50℃退火45 s；72℃延伸45 s；循环30次；72℃再延伸8 min。
2) 将所有PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产物，并用微量分光光度计测定其浓度。
3) 进行体外转录反应合成Brd2 cRNA探针，20 μL体外转录反应体系如下：RNaseinhibitor 1μL，10×NTP dig labeling mixture 2μL，10×transcription buffer 2μL，Template DNA 13μL，RNA polymerase 2μL。
4) 37℃水浴孵育2 h，取0.5μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测。
5) 加入2μL无RNase污染的Dnase I 37℃水浴孵育15 min来消化模板DNA。
6) 加入EDTA 0.8μL，加入5.6μL NH4Oac终止反应，再加入56μL无水乙醇并混匀，于-80℃放置20 min。
7) 15000 r/min,4℃离心15 min，弃上清，加入700μL 80%的无水乙醇混匀，15000 r/min,4℃离心10 min沉淀RNA。
8) 干燥后用DEPC处理的水50μL溶解RNA。
合成的两条探针经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用微量分光光度计测定探针浓度，于-80℃保存备用。
3.2荧光原位杂交实验检测探针的效果1) 正常C57BL/6小鼠用1%戊巴比妥钠深麻后，依次以30 mL 0.01 mol/L DEPC-PBS和100 mL含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）行左心室灌注，小心剥离脑组织，于4℃环境下用上述相同固定液进行后固定过夜，后将组织转移浸没于含30%蔗糖的PB溶液中脱水至沉底。
2) 最后取出组织用OTC包埋，冰冻切片机连续切片至需要的层面，切片厚度30 μm。
F I S H技术在血液肿瘤中的应用ppt课件
进行跟踪监测，预测疾病进展和有无复发迹象。
浆细胞疾病
白 血 病
MDS
淋 巴 瘤
血液肿瘤荧光原位杂交探针
疾病名称
多发性骨髓瘤（MM）
慢性淋巴细胞白血病（CLL） 慢性粒细胞白血病（CML） 急性早幼粒细胞白血病（AML-M3） 急性原始粒细胞白血病部分分化型（AML-M2） 粒－单核细胞白血病 (AML-M4) 小儿急性淋巴细胞白血病（ALL）
临床意义：
• 从遗传学角度检测染色体和基因的异常 • 辅助诊断，判断预后，疗效检测及微小残留检测
FISH技术在血液肿瘤中的应用
血液系统肿瘤是我国十大高发肿瘤之一。大量研究表明，不同类型 的血液肿瘤往往有其特异的染色体异常，对肿瘤分型、诊断、治疗和预测用预 后都具有重要意义。常规细胞遗传学分析（CC）方法只能分析中期染色体，而 对间期细胞、复杂核型细胞和染色体微缺失无法进行诊断。FISH技术弥补了CC 在这方面的不足，因此被广泛应用于血液肿瘤的研究、诊断等方面。
骨髓增生异常综合症
性染色体错配骨髓移植
B细胞淋巴瘤 滤泡性淋巴瘤（FL） 套细胞淋巴瘤（MCL） 弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL） 伯基特淋巴瘤（BL） 粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）
探针名称
GLP P53，GLP RB1 ，GLP D13S319 GLP IGH ，GLP 1q21
GLP P53 GLP RB1 GLP D13S25 GLP ATM CSP 12
GLP BCR/GLP ABL；GLP ASS
GLP PML/GLP RARA
GLP AML1/GLP ETO
GLP CBFB GLP 4/10,GLP 17, GLP BCR/GLP ABL,GLP MLL GLP TEL/AML1 GLP CSF1R/ GLP D5S23，D5S721 GLP EGR1/ GLP D5S23，D5S721 GLP D7S486/CSP7;GLP D7S522/CSP7; GLP D20S108/CSP8 ;CSP X/CSP Y；
FISH荧光原位杂交
(1) 玻片预处理玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，清水浸泡过夜；1%的盐酸浸泡24小时，蒸馏水清洗干净后置0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）中浸泡过夜。
硅化处理：将载玻片和盖玻片用1%的盐酸煮沸10min后，用0.1%DEPC处理的蒸馏水冲洗，60℃烘干。
盖玻片用锡纸包好4℃保存备用。
黏附剂涂片制备：载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液中约1min，取出用灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥，然后置4℃保存备用。
(2) 样品采集和预处理取样：用经高压灭菌的聚乙烯管子取湿地基质并称量，加灭菌蒸馏水适量振荡混匀，超声波处理使细菌分散。
取清洗下来的悬浊液约1ml进行后续处理。
样品固定与清洗：悬浊液中按1:1加入4%多聚甲醛于4℃固定24小时；将固定样本用磷酸缓冲液(PBS)10000r/min离心漂洗二次，弃去上清液。
用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于-20℃保存备用。
热固定与脱水：取10μl样品在载玻片上涂抹24mm×24mm大小，37℃的烘箱热固定2h 后依次用50%，80%，96%乙醇室温下脱水3min，室温干燥。
(3) 杂交反应硝酸菌的探针见表4.2：杂交液配置：总细菌、硝酸细菌、亚硝酸细菌杂交液中去离子甲酰胺（DAF）浓度分别为20%、40%或55%去离子甲酰胺（DAF），其余的相同，SDS 0.1%，Tris-HCl（pH8.0）20mmol/L，NaCl 900mmol/L。
表5-1硝酸菌与亚硝化细菌探针序列Tab. 5-1 Probe and sequences of nitrifying bacteria, denitrifying bacteria and total bacteria 细菌探针名称探针序列（5’—3’）5’—标记总细菌EUB338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT HEM硝酸细菌NIT3 CCT GTG CTC CA T GCT CCG FITCCNIT3* CCT GTG CTC CAG GCT CCG亚硝酸细菌NSO190 CGA TCC CCT GCT TTT CTCC HEXCNIT3* 为硝酸菌探针NIT3的竞争探针探针浓度均为50ng/μl。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的应用 ppt课件
Blue单通道
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
二、常用探针种类
• 单色探针(single color probe, SC) • 双色探针(dual color probe, DC) • 三色探针(triple color probe, TC) • 双色分离探针(dual color, break apart probe. DC,BCR) • 双色单融合探针(dual color, single fusion. DC, SF
CCND1基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、 复发等相关。在高凤险们GIST中扩增，在低风险和中等 风险GIST中无扩增，其表达与GIST有预后相关性。
MDM2基因扩增宣GIST患者有预后相关性。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
前列腺癌
• 探针：PTEN/CEN10 FGFR1/CEN8 ERG
套细胞淋巴瘤
• 探针：CCND1/IGH（双色双分离探针）
CCND1基因位于11q13，IGH基因位于14q32。 CCND1/IGH融合基因导致CCND1蛋白过度表达，可促进细胞 增生。
• CCND1/IGH融合基因检测意义
CCND1基因重排和(或)高表达是MCL的特征，FISH探 针检测CCND1/IGH的阳性率可以达到96%。
• 检测意义：
PTEN基因缺失，前列腺癌患者预后差。 FGFR1基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重 要过程。 没有ERG基因改变的前列腺癌患者8年生存期达90%。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
神经母细胞瘤、神经胶质瘤
• 探针：1p36/1q25 19q13/19p13 NMYC/2q11
• MALT1及API2/MALTI融合基因检测意义
荧光原位杂交检测ppt课件
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❖辅助血液疾病的诊断，判断预后，疗效检测及 微小残留检测
❖ 应用：
❖骨髓移植术后（性别不同的移植献者）、 性别鉴定 、CMPD和ALL初诊、CML末次化 疗结束两周 以上、AML-M3/M2等疾病
❖ 技术特点
❖ 可分析间期细胞，不需培养；操作简单、检测快速 重复性好、空间定位精确；灵敏性和特异性高
❖ 禁忌：冰冻或凝块
注意：建议做FISH的同时做常规细胞遗传学分析。若 只要求做FISH，请转交一份近期的细胞遗传学报告 。如果无细胞形态学或遗传学的检查，建议作进一 步检查！！
❖ 报告时间：周一至周五，7个工作日
❖ 报告示例：略
❖ 结果判读：每个探针检测镜下分析200个细胞核。 20例没有造血系统疾病且核型正常的骨髓标本作为 正常对照，以此计算分裂信号的平均数和标准差。 如果有异常杂交信号的细胞百分比超过正常标准差 的3倍，结果将被认为异常。
荧光原位杂交（FISH）检测
概述
FISH-目前新兴的分子遗传学技术，原理是采用
荧光标记的DNA探针，利用探针与检测样本中 DNA碱基对的互补性，在探针与标本的DNA杂交 后，通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从 而检测细胞、组织样本中的染色体和体和基因的异常
❖ 当染色体核型分析不成功或不明确时，可利用FISH 检测弥补不足，并可发现复杂易位
❖ 探针种类
❖双色单融合探针 双色分离探针
❖ ES探针
双色双融合探针
每类探针的检测和适用范围不同，决定其用处不同
❖ 标本要求
❖ 送检标本：骨髓3ml（CML和CLL患者可直接用外 周血2ml）
❖ 保存条件：肝素钠抗凝，4摄氏度，24h送检
免疫荧光原位杂交技术FISH
EGFR基因扩增检测试剂盒 （FISH）
无荧光信号
没有用酶进行处理, 用了不恰当的滤光镜
镜下观察可能出现的问题 没有加入探针(或探针没有经过适当变 性),杂交条件不够恰当 探针不合格(或探针没有适当保存),荧光 显微镜没有适当地起作用
荧光信号微弱
杂交条件不够充分
探针过分稀释造成浓度太低, 没有适当变性,探针和杂交液没有充分 混合,洗涤条件不够恰当(或洗涤太过), 滤光镜不对
37ºC 蛋白酶k
5-30min
洗片
DAPI染色
阅片
脱蜡
石蜡切片浸于二甲苯中3次,每次10分钟 浸入100%的乙醇中5分钟.然后梯度复水
各2分钟 浸入去离子水3分钟
(脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交率降低,荧光背景高等)
预处理
I. 100 ºC沸水处理组织切片30分钟
II. 100ug/mL的蛋白酶K溶液,37 ºC孵育5-30 分钟
有背景荧光 荧光信号计数问题
杂交后洗涤不够充分 洗涤缓冲液盐的浓度过高 洗涤时温度过低
选择分散较好不重叠的细胞计数
IGH/C
HER-2扩增
C-MYC
CBFB基因断裂重组检测试剂盒
探针：GLP CBFB CBFB基因（Core binding factor β，CBFB）：核心结合因子 ,位于 16号染色体上。
III. 2*SSC漂洗,梯度脱水各2分钟,干燥玻片.
• 探针变性 • 玻片变性
变性
83 ºC
5min
DAPI复染
杂交
42ºC 湿盒
孵育过夜
洗涤
• 50%甲酰胺 • 2XSSC • 0.1%NP-40 • 75%乙醇
FISH法检测石蜡miRNA总结(共25张PPT)
2、FISH 技术和 RFLE （ RESTRICT FRAGMENT LENTH POLYMORPHSIM ）结合，可以精确地描述染色体长， 短臂等结构改变和染色体核型或复杂片段的性质。 在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较 精确地确定下来。
（2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。
（3） 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。
（4）梯度(70%、90%、100%)酒精脱水（-20℃预冷），空气中干 燥。
变性
（1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液； （2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； （3）78℃孵育8 min；
（10）每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体（抗地高辛 单克隆抗体）或FITC卵白素，室温下孵育20 min；
（11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS 室温下洗3次，每次2 min。
杂交
方法敏感，敏感程度等同甚至超过放射性同位素原位杂交。 （1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；
放（射2 性）原（20位×杂S1S交2C方）（法p，H从7用. 特1殊×的荧PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
荧光显微镜观察FISH结果
（13）每张切片滴30~60 μl -卵白素抗体 抗 ，加塑料盖膜，室 1×PBS室温下洗3次，每次2 min。
在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地确定下来。
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▪ 6）杂交后洗液：100ml 2×SSC+0.3ml NP-40。
▪ 7）70%、85%、100%乙醇，置于-20oC保存。
▪ 8）DAPI溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储 存液，按体积比1:300，以antifade溶液稀释成工作 液。（DAPI—4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-
由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成
➢ 特异性位置探针。
由一个或几个克隆序列组成
实验相关溶液的配置
▪ 1）20×SSC：175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，加水 至1000mL（用10mol/L NaOH调pH 至7.0）。
▪ 2）2×SSC：40ml 20×SSC+360ml H2O。 ▪ 3）0.2N Hcl：0.5ml浓Hcl+29.5ml H20。 ▪ 4）10%中性福尔马林：4ml甲醛+36mlPBS。 ▪ 5）变性液（pH7.0）：24.5ml甲酰胺+10.5ml
荧光原位杂交
Fluorescence in situ hybridization （FISH）
▪ 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞 遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有 的放射性原位杂交技术的基础上发展起来 的一种非放射性原位杂交技术。
5min×2次，室温风干。
二、样品变性
1.将变性液倒入染色缸中，水浴加热至72±1oC，片 子放入前确认温度已达到72±1oC。（变性液倒入 染色缸中水浴加热约需30min）
2.放入波片至变性液中，继续72±1oC变性5min。 3.取出波片至70%冷乙醇中浸泡1min。 4.85%、100%冷乙醇各脱水1min。 5.吸去多余的乙醇，置于40oC-50oC烤片机上2-5min
0.2N Hcl处理 20min
蒸馏水
3min
2×SSC
3min×2次，室温晾干
预处理液80oC反应40min（预处理液需预热）
蒸馏水
1min
3.蛋白酶处理：
吸干组织周围液体后，加蛋白酶在37oC反应15min（蛋白酶需预热， 片子需放在湿盒上滴加）
4.后固定：
10%中性福尔马林 10min
2×SSC
2. 在盖玻片的周围注射少量的树胶于盖玻片和载玻 片交界处重叠，在盖玻片和载玻片周围形成密 封圈。
3.将封好的片子放入37oC预热的杂交盒中盖ห้องสมุดไป่ตู้盖子，
孵育14-18h。
五、杂交后洗涤
1.从杂交盒中取出片子，用镊子轻轻拉掉密封胶。 2.将片子放入预热过的杂交后缓冲洗液
（2XSSC/0.3%NP-40）中，漂洗掉盖玻片。 3.盖玻片小心被去掉后，吸干载玻片边缘过多液体，
或者室温风干。
三、探针准备
1.室温下让探针复温，降低探针的黏度，以便 探针充分准确吸取。
2.涡流混合。把内容物装入试管底部，每个试 管用台式离心机离心2-3秒，然后再次轻 轻涡流混合。
四、杂交
1 .加10uL混合后的探针到载玻片的靶区，立刻在探 针上加盖盖玻片，让探针均匀的在盖玻片下扩 散。气泡会干扰杂交应该避免。探针使用后需 要及时再冷冻保存。
phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料 ；
antifade—抗荧光淬灭剂 ）
实验方法和步骤
➢ 标本前处理 ➢ 样品变性 ➢ 探针准备 ➢ 杂交 ➢ 杂交后洗涤 ➢ 衬染及封片
一、标本前处理
1.脱蜡：
依次通过二甲苯15min×3次，无水乙醇10min×3次，室温风干。
2.预处理：
把载玻片浸入杂交后缓冲洗液中72±1℃2min。 4.从杂交后缓冲液中移出载玻片，把载玻片放在暗
处竖立空气中干燥。
六、衬染及封片
1.加10uL DAPI复染载玻片靶区并加盖盖 玻片。
2.荧光显微镜观察或在暗处-20oC保存。
荧光显微镜观察FISH结果
▪ FISH在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在 的位置，以HER-2 DNA Probe来说，它会把 HER-2基因部位橘红色荧光亮点，还将第17 对染色体的中心颗粒（centromere）呈现绿 色亮点，我们只要对比橘色和绿色亮点的 数目，若橘色点/绿色点大于2，就表示有 HER-2扩增，正常细胞橘色点/绿色点数目 比值小于2。
▪ FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸 为探针，按照碱基互补的原则，与待检材 料中未知的单链核酸进行特异性结合，形 成可被检测的杂交双链核酸。
探针
➢ 染色体特异重复序列探针；
如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重 复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测。
➢ 全染色体或染色体区域特异性探针；
1+
2+
3+
正常
Her2基因低度表达
Her2基因高度表达