水产品中的组胺的检测
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实验二 水产品中的组胺的检测
一、 实验目的
l．了解偶氮试剂比色法测定水产品中组胺的方法原理。
2．掌握正戊醇提取组胺的操作技术。
3．学会用偶氮试剂比色法检测水产品中组胺的检测技术。
二、实验原理
水产品中的组胺用正戊醇提取，遇偶氮试剂显橙色，与标准系列比较定量。组胺是水产
品中游离的组氨酸在组氨酸脱羧酶作用下，发生脱羧反应而形成的一种胺类物质。脱羧酶来
自一些含有组氨酸脱羧酶的微生物，如某些肠杆菌、弧菌属等，其中最主要的是摩根变形杆
菌和组胺无色杆菌。当水产品受到这些细菌污染后，会产生大量的组胺，从而反映出水产品
受微生物污染的程度。
三、仪器与试剂
(1) 正戊醇；三氯乙酸溶液(100g/L)；碳酸钠溶液(50g/L)；氢氧化钠溶液(250g/L)；盐酸
(1+11)。
(2) 偶氮试剂
① 甲液：称取0.625g对硝基苯胺，加6.25mL盐酸溶液溶解后，再加水稀释至250mL，
置冰箱中。
② 乙液：亚硝酸钠溶液(5g/L)，临用现配。
甲液5mL、乙液40mL混合后立即使用。
(3) 磷酸组胺标准贮备液准确称取0.2767g于(100士5)℃干燥2h的磷酸组胺，溶于水，
移入100mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液每毫升相当于1.0mg组胺，
(4) 磷酸组胺标准使用液 吸取5.0mL磷酸组胺标准贮备液，置于250mL容量瓶中，
加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于20μg组胺。
四、实验步骤
1．样品处理
称取5.00～l0.00g切碎样品，置于具塞锥形瓶中，加入15～20mL三氯乙酸溶液，浸泡
2～3h，过滤。吸取2.0mL滤液，置于分液漏斗中，加氢氧化钠溶液使呈碱性。每次加入3mL
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正戊醇，振摇5min，提取三次。合并正戊醇提取液并稀释至10.0mL。吸取2.0mL正戊醇提
取液于分液漏斗中，每次3mL盐酸(1+11)振摇提取三次，合并盐酸提取液并稀释至10.0mL。
备用。
2．测定
吸取2.0mL盐酸提取液于10mL比色管中。另吸取0、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、
l.0mL组胺标准使用液(相当于0、4μg、8μg、12μg、16μg、20μg组胺)，分别置于10mL比
色管中，加水至lmL，再各加lmL盐酸溶液。样品与标准管各加3mL碳酸钠溶液、3mL偶
氮试剂，加水至刻度，混匀，放置10min后用lcm比色杯以零管为参比，于480nm波长处
测吸光度，绘制标准曲线比较，或与标准系列目测比较。
管号 0 1 2 3 4 5 样品管
组胺标准使用液/mL 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.0
2mL
提取液
纯水/mL 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0
盐酸溶液/mL 标准管加1.0 样品管不加
碳酸钠溶液/mL 样品与标准管各加3.0
偶氮试剂/mL 样品与标准管都加3.0，加水至刻度，混匀，放置10min
组胺含量/μg 0 4 8 12 16 20
吸光值（A）
五、结果计算
(1) 计算公式
m1
x=
m2×(2/v1) ×(2/10) ×(2/10)×1000
式中，x为样品中组胺的含量，mg/100g；
V1为加入三氯乙酸溶液的体积，mL；
m1为测定时试样中组胺的含量，μg；
m2为试样质量，g。
(2) 结果的表述报告算术平均值精确至小数点后一位。
六、注意事项
1. 本方法的最低检出浓度为5mg/100g，允许相对误差≤10％。
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2. 用正戊醇提取三氯乙酸溶液中的组胺时，必须用氢氧化钠溶液调pH至碱性，以便于
游离组胺的提取。
七、思考题
1. 影响组胺含量测定准确性的因素有哪些?
2. 组胺与偶氮试剂的反应中，酸碱度控制不当会给实验结果造成怎样的影响?
水产品的理化检验
水产品的理化检验(一)水产品的主要平安间题水产品(aquatic products)包括鱼类、贝类、甲壳类等鲜、冻品及其加工制品，其主要平安问题是腐败变质、自然毒素及各种污染等。
水产品的腐败变质与肉类相像，其中蛋白质分解产生多种产物，挥发性盐基氮增强，而且有些青皮红肉鱼体中含有较多的组氨酸，腐败变质时组氨酸脱羧形成大量的组胺(histamine)。
反应式为：组胺分子式为C5H9N3，属于生物碱，溶于水及乙醇等极性溶剂。
可引起过敏性中毒，表现出皮肤潮红、眼结膜充血、头痛、心跳加快、血压下降等症状。
水产品种类丰盛，其中绝大多数不含自然毒素，但也有少数品种含有自然有毒物质，如河豚含河豚毒素，文蛤及石房蛤等含岩蛤毒素，深海鱼中含雪卡毒素等。
水产品中化学污染物包括有害金属、药物残留、有机污染物等。
因为有些化学污染物的毒性与其存在的形态疏远相关，不同形态的毒性相差悬殊，如三价砷的毒性大于五价砷，无机砷毒性大于有机砷；有机汞的毒性大于无机汞，尤其甲基汞是汞不同形态中毒性最强的一种。
海产品易于富集砷化合物，其总砷含量高，并含有多种有机砷化合物。
汞污染水体后，在微生物的作用下可改变为，甲基汞通过生物富集和生物放大作用，在水产品中的含量沿着食物链逐级增高。
因此，对水产品中这些有害物质仅举行总量的测定不能正确反映其在食品中的平安性，更重要的是举行不同形态的分别测定。
(二)水产品平安国家标准我国制定了水产品的卫生管理方法、国家标准及其分析办法。
按照GB 2762、GB 2763及《鲜、冻动物性水产品卫生标准》(GB 2733)和《动物性水产干制品卫生标准》(GB 10144),水产品需要检测的主要理化项目有铅、镉、无机砷、甲基汞、铬、苯并[a]芘(熏、烤水产品),(罐头除外的水产制品)、、有机氯农药、兽药残留、挥发性盐基氮及组胺(非鲜活水产品)、酸价及过氧化值(动物性水产干制品)。
部分指标见表11-3。
本节重点研究组胺、无机砷及的分别测定。
组胺的理化检测方法
组胺的理化检测方法1．原理鱼体中组织胺用正戊醇提取，遇偶氮试剂显橙色，与标准系列比较定量。
2．试剂5％碳酸钠溶液。
25％氢氧化钠溶液。
偶氮试剂－甲液：取0.5g对硝基苯胺，加5ml盐酸溶解后，再加水稀释至200ml，置冰箱中。
乙液：0.5%亚硝基钠溶液，临用现配。
甲液5ml、乙液40ml混合后立即使用。
正戊醇。
10％三氯乙酸溶液。
组织胺标准溶液：精密称取0.2767g于105℃干燥2h的磷酸组织胺，溶于水，移入100ml容量瓶中，再加水稀释至刻度。
此溶液每毫升相当于1㎎组织胺。
磷酸组织胺标准使用液：吸取1.0ml组织胺标准溶液，置于50ml容量瓶中，加水稀释至刻度。
此溶液每毫升相当于20μg组织胺。
3.操作方法样品处理：称取5～10g切碎样品，置于具塞锥形瓶中，加入15.0～20.0ml 10％三氯乙酸溶液，浸泡2～3h，过滤。
吸取1.0ml滤液，置于分液漏斗中，加25％氢氧化钠溶液使呈碱性，每次加入3ml正戊醇，振摇5min，提取三次，合并正戊醇并稀释至10.0ml。
吸取1.0ml正戊醇提取液于分液漏斗中，每次加3ml 1Ｎ盐酸，振摇提取三次，合并盐酸提取液并稀释至10.0ml。
备用。
测定：吸取1.0ml盐酸提取液，于10ml比色管中。
另吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0ml组织胺标准使用液（相当于0、4、8、12、16、20μg 组织胺），分别置于10ml比色管中，各加1ml 1N盐酸，样品与标准管各加3ml 15％碳酸钠溶液，3ml偶氮试剂，加水至刻度，混匀，放置10min后用1㎝比色杯以零管调节零点，与480nm波长处测吸光度，绘制标准曲线比较，或与标准色列目测比较。
4．计算A1×1001000Ｘ1= ………………………………….⑴1 1 1ｍ1×××Ｖ1 10 10式中：Ｘ1 样品中组织胺的含量，㎎/100g;Ｖ1 加入10％三氯乙酸溶液的体积，ml；A1 测定时样品中组织胺的含量，μg；ｍ1 样品质量，g。
分光光度法快速测定水产品中组胺的含量
分光光度法快速测定水产品中组胺的含量
赵宇明
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2014(000)008
【摘要】用三氯乙酸提取水产品中的组胺，再与偶氮试剂反应生成红色化合物，其吸光度与样品中的组胺含量成正比，依此建立了快速测定水产品中组胺的方法。
方法的检出限为2.0μg/mL，RSD（n=10）为2.6%，10次测定的平均回收率为99.5%，在0~40μg/mL范围内，r为0.9998。
该方法具有快速、稳定的特点，与国标方法所得测定结果基本一致。
【总页数】3页(P94-96)
【作者】赵宇明
【作者单位】大连市产品质量监督检验所，辽宁大连116021
【正文语种】中文
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2.液相色谱测定水产品中组胺含量不确定度评估 [J], 胡礼渊;孙高英;廖和菁
3.用可见-紫外分光光度法测定水产品中组胺的含量 [J], 江生;汪敏;白亚敏;韩燕
4.高效液相色谱荧光检测器快速测定水产品中的组胺 [J], 李佐卿;谢东华;王宇;杨娟芬;康继韬;俞雪钧
5.LC测定水产品中组胺含量 [J], 马烨晶;
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市售鱼类及其加工品中组胺含量的调查
市售鱼类及其加工品中组胺含量的调查摘要2006年3月对市售鲭鱼20尾、秋刀鱼30尾、金枪鱼6块等进行组胺含量分析,结果表明,20尾鲭鱼中有1尾组胺含量为20mg/kg;30尾秋刀鱼肉中有1尾组胺含量为16mg/kg,另一尾为10mg/kg;6块金枪鱼样品及其他鱼类样品未能检测到组胺。
鲭鱼20尾中1尾检出酪胺23mg/kg,尸胺为36mg/kg,腐胺及亚精胺未检出;秋刀鱼30尾中2尾检出10mg/kg和15mg/kg的酪胺,1尾检出52mg/kg腐胺,2尾检出35mg/kg和55mg/kg尸胺。
关键词鱼类;鱼肉加工品;组胺;生物胺;含量鱼肉组胺含量超标而引起的组胺中毒事件时有发生[1-5],主要因为鲭鱼、鲐鱼等鱼肉中的组氨酸在组胺菌脱羧酶作用下,发生脱羧反应生成组胺[6]。
人摄取含有高浓度组胺的鱼肉后,容易引起组胺中毒现象[7,8]。
组胺菌一般存在于海水、鱼的体表或内脏,鱼在捕捞后或者流通中温度管理不当,就会引起市售鱼肉组胺的蓄积现象。
通过对市售鱼类的组胺含量调查分析,掌握市售鱼肉组胺含有情况,使组胺超标现象得到有效控制,使组胺中毒现象防范于未然。
其他4种生物胺对组胺中毒起增强作用,在调查组胺的同时也调查了鱼肉其他4种生物胺的含量[9]。
1材料与方法1.1材料2006年3月,在日本仙台超市及水产品市场,购买了70个鲜鱼及其加工品作为调查样品。
根据鱼种进行分类如下:鲭鱼20尾,秋刀鱼30尾,金枪鱼6块;味调鲭鱼5块,醋渍5块,金枪鱼罐头4盒。
1.2试剂磺酸,亚硝酸钠,碳酸钠,乙醇,盐酸,高氯酸(日本和光纯药,分析纯),组胺、酪胺、尸胺、亚精胺标准(Sigma会社)。
1.3仪器组胺检测仪,搅拌器,离心机,恒温干燥箱,高效液相色谱(HPLC)(Waters会社)。
1.4待测样品制备取鱼肉及其加工样品1g,放入样品管中,加入80%的乙醇5mL,每个样品3次重复,用搅拌器绞碎均匀后,于12 000rpm离心15min,取上清液用于组胺测定。
乙醇法提取水产品中的组胺 共24页PPT资料
6
乙醇提取方法 去除鱼中不可食部分，将其捣碎、混匀，准确称取
10g (精确到0. 01g)样品于50ml小烧杯中，用20ml一定浓 度的乙醇溶液作提取剂，在一定温度和时间下对样品进行 处理，过滤。 乙醇提取条件的探讨
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组胺作为人体内源活性物质，在生物细胞中具有重要 的生理功能，但是当人体摄入过量的组胺时，会引起食物 中毒，严重的还会危及生命。据研究发现当鱼内组胺含量 达到4mg/g 或人体摄入组胺达到1.5mg/kg 体重以上时， 易发生中毒。许多国家的食品卫生标准中建议用组胺含量 作为鱼类和水产品中微生物腐败的指标。我国的食品卫生 标准中也明确规定各类海产品中组胺的允许摄入量为鲐鱼 不得超过100mg/100g，其它不得超过 30mg/100g，其它国 家也有对部分食品中组胺含量做了严格的限量要求。
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方法步骤
乙醇溶液对胶体金显色的影响 用无水乙醇和蒸馏水配制浓度梯度为100%、90%、80%、
70%、60%、50%、45%、40%的乙醇溶液，用移液枪准确吸 取各浓度的乙醇溶液20μ l与等体积的胶体金在1.5ml反应 管中均匀混合，静置3min后观察反应现象。 乙醇溶液对分光光度法测定的影响
考虑乙醇浓度、乙醇提取时间、乙醇提取温度三个因 素进行了单因素试验，在单因素基础上进行了L9(33)的正 交试验对组胺测定中的组胺提取条件进行优化。
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国标法中样品预处理方法 去除鱼中不可食部分，将其捣碎、混匀，准确称取
10g (精确到0. 01g)样品于50ml小烧杯中，加入20mL三氯 乙酸（10%）作提取剂，在室温下浸提2h-3h，过滤，取 1.0ml滤液于分液漏斗中，用氢氧化钠溶液（250g/L）调 pH9-10。加入3.0ml正戊醇，振摇5min，提取三次。合并 滤液并用正戊醇定容至10.0ml。取1.0ml正戊醇提取液于 分液漏斗中用1mol/L盐酸提取3次，合并盐酸提取液并用 盐酸溶液定容至10.0ml，备用。
用可见-紫外分光光度法测定水产品中组胺的含量
用可见-紫外分光光度法测定水产品中组胺的含量
江生;汪敏;白亚敏;韩燕
【期刊名称】《食品工程》
【年(卷),期】2016(000)001
【摘要】建立了水产品中组胺含量的测定方法。
采用正戊醇提取，偶氮试剂显色，可见-紫外分光光度计检测，测定波长为480 nm。
试验结果表明，当组胺的质量
浓度在0.40781μg/mL～4.0781μg/mL范围内，质量浓度与吸光度呈良好线性关系(R2=0.9997)。
平均回收率为94.8%， RSD为1.1%（n=9）。
本法简单，易操作，测定结果准确。
【总页数】3页(P62-64)
【作者】江生;汪敏;白亚敏;韩燕
【作者单位】重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121;重庆市食品药品检
验检测研究院，重庆 401121;重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121;重
庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121
【正文语种】中文
【中图分类】TS207.3
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组胺比色法——精选推荐
比色法：【GB/T 5009.45—1996】水产品卫生标准的分析方法4.4组胺适用于蓝圆鲹(池鱼)、鲐鱼。
4.4.1原理鱼体中组织胺用正戊醇提取，遇偶氮试剂显橙色，与标准系列比较定量。
最低检出浓度为5mg/100g。
4.4.2试剂4.4.2.1正戊醇。
4.4.2.2三氯乙酸溶液(100g/L)。
4.4.2.3碳酸钠溶液(50g/L)。
4.4.2.4氢氧化钠溶液(250g/L)。
4.4.2.5盐酸(1＋11)。
4.4.2.6组织胺标准溶液：准确称取0.2767g于100±5℃干燥2h的磷酸组织胺，溶于水，移入100mL容量瓶中，再加水稀释至刻度。
此溶液每毫升相当于1.0mg组织胺。
4.4.2.7磷酸组织胺标准使用液：吸取1.0mL组织胺标准溶液，置于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度。
此溶液每毫升相当于20μg组织胺。
4.4.2.8偶氮试剂。
4.4.2.8.1甲液：称取0.5g对硝基苯胺，加5mL盐酸溶液溶解后，再加水稀释至200mL，置冰箱中。
4.4.2.8.2乙液：亚硝酸钠溶液(5g/L)，临用现配。
甲液5mL、乙液40mL混合后立即使用。
4.4.3分析步骤4.4.3.1样品处理称取5.00～10.00g切碎样品，置于具塞锥形瓶中，加入15～20mL三氯乙酸溶液(100g/L)，浸泡2～3h，过滤。
吸取2.0mL滤液，置于分液漏斗中，加氢氧化钠溶液(250g/L)使呈碱性，每次加入3mL正戊醇，振摇5min，提取三次，合并正戊醇并稀释至10.0mL。
吸取2.0mL 正戊醇提取液于分液漏斗中，每次加3mL盐酸(1＋11)振摇提取三次，合并盐酸提取液并稀释至10.0mL。
备用。
4.4.3.2测定吸取2.0mL盐酸提取液于10mL比色管中。
另吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mL 组织胺标准使用液(相当于0、4、8、12、16、20μg组织胺)，分别置于10mL比色管中，加水至1mL，再各加1mL盐酸(1＋11)，样品与标准管各加3mL碳酸钠溶液(50g/L)，3mL偶氮试剂，加水至刻度，混匀，放置10min后用1cm比色杯以零管调节零点，于480nm波长处测吸光度，绘制标准曲线比较，或与标准系列目测比较。
第三章 原料鱼和肉的鲜 三甲胺和组胺
氧化三甲胺的生理功能
氧化三甲胺作为动物体内重要的无毒中间代谢物,氧 化三甲胺是一种蛋白质稳定剂和有机渗透剂,参与
海生硬骨鱼和某些广盐性硬骨鱼等的渗 透调节,在水产业中具有广阔应用前景。
三甲胺的产生
1. 氧化三甲胺是鱼鲜美味道的主要来源,氧化三甲胺极不稳定, 鱼死后，在腐败细菌尤其是兼性厌氧菌（如互生单孢菌、腐 败极毛菌） 的作用下, 很容易还原成三甲胺。 氧化三甲胺 是一种鲜味物质 含量与鲜度密切相关。 2.鱼类的红肌中含有内源性的氧化三甲胺还原酶。Fe2 + 在氧化 三甲胺转变为三甲胺和二甲胺(DMA) 中起重要的作用。在 Fe2 + 、血红蛋白和半胱氨酸存在下，4 ℃氧化三甲胺转变为 三甲胺和二甲胺。 2Cys＋2Fe3＋ → Cys－Cys ＋ 2Fe2＋ ＋2H＋ Me3NO＋ 2H＋ ＋ 2Fe2＋ → Me3N＋ 2Fe3＋ ＋ H2O 3.氧化三甲胺一经加热就会分解，罐头及其它海水鱼加工中常 有此反应。 Me3NO→ Me3N＋HCHO 4.水产动物中的卵磷脂经微生物分解产生三甲胺，但量较少。 －CH2OP－OCH2CH2－N（CH3）3
一、次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶法
（一）原理： 次黄嘌呤 黄嘌呤氧化酶
pH7.6缓冲液
波长600nm
尿酸
2,6一二氯靛酚
∆A/ ∆T
以次黄嘌呤为指标确定水产品的鲜度，黄鱼100－ 200ppm为新鲜，鲳鱼100－250ppm为新鲜，河鲫鱼 小于50ppm为新鲜。
黄嘌呤氧化酶法
（二）试验试剂 2,6一二氯靛酚溶液：用0.17mol/L磷酸缓冲液pH 7.6 配制成23 ug/mL 黄嘌呤氧化酶溶液：活力0.3单位/mL
比色 410nm比色
HPLC法检测海水鱼中组胺的含量
HPLC法检测海水鱼中组胺的含量作者：梁立广李绮敏雷艳来源：《食品安全导刊·下旬刊》2019年第01期摘要：本实验建立了检测海水鱼中组胺含量的高效液相色谱法，为检测海水鱼中组胺提供有效、快速定量的方法。
色谱柱条件为：C18柱（4.6 mm×100 mm，粒径5μm）;紫外检测波长254nm;以90%甲醇/10%（含0.1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液）和10%甲醇/90%（含0.1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液）作为流动相;流速0.8mL/min。
结果显示：该方法标准曲线良好稳定，组胺在1.0～50.0mL/L范围内线性系数为0.9996，出峰时间在21.654min附近，定量限为50mg/kg，平均回收率在99.8%附近，精密度RSD为5.2%。
本方法测定海水鱼中组胺含量，简单、快速、易操作，检测可靠方法，适用于样品数目较多检测。
关键词：HPLC;组胺;海水鱼生物胺是有生物活性含氮的低分子量有机化合物的总称，分为脂肪类、芳香类和杂环类[1]。
组胺为一种杂环类的生物胺，存在许多动植物当中。
海水鱼内含有一定游离组氨酸，海水鱼不新鲜或变质腐烂时，受到大量微生物细菌污染，在一定的条件下分解组胺酸形成组胺，组氨酸脱羧酶的脱羧作用而生成[2]。
组胺无味无色，肉眼无法辨别，是不挥发的有机胺，人体摄入变质或不新鲜的海水鱼，就会出现急性中毒症状或引起慢性病变，影响人体的神经系统、消化系统和心血管系统，分别会导致出现水肿、皮肤发红、头晕头痛、麻疹、腹泻、呼吸困难、发热、高血压等中毒症状[3-4]，严重是甚至会死亡，对人类健康有较大影响。
海水鱼常常作为餐桌上的美食，因此，针对海水鱼中组胺的含量检測具有重要的意义。
组胺的检测方法有分光光度法、高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、电化学生物传感器法等[5-6]，分光光度法[7-8]利用提取液提取，通过显色剂作用与标准系列比较定量，处理时间快，但重现性较差，线性不稳定。
HPLC 法检测海水鱼中组胺的含量
HPLC 法检测海水鱼中组胺的含量
□ 梁立广 李绮敏 雷 艳 广东省食品工业公共实验室 广东省食品工业研究所有限公司 广东省食品质量监督检验站
摘 要：本实验建立了检测海水鱼中组胺含量的高效液相色谱法，为检测海水鱼中组胺提供有效、快速定量的方法。 色谱柱条件为：C18 柱（4.6 mm×100 mm，粒径 5μm）；紫外检测波长 254nm；以 90% 甲醇 /10%（含 0.1% 乙酸的 0.01mol/L 乙酸铵溶液）和 10% 甲醇 /90%（含 0.1% 乙酸的 0.01mol/L 乙酸铵溶液）作为流动相；流速 0.8mL/min。结 果显示：该方法标准曲线良好稳定，组胺在 1.0~50.0mL/L 范围内线性系数为 0.9996，出峰时间在 21.654min 附近，定 量限为 50mg/kg，平均回收率在 99.8% 附近，精密度 RSD 为 5.2%。本方法测定海水鱼中组胺含量，简单、快速、易操作， 检测可靠方法，适用于样品数目较多检测。
达到各成分分离，但在高温及挥发性 （0.01mol/L），加入 100mL 甲醇。
时间 A（90% B（10% 流速 序号 （min） 甲醇 甲醇 （mL
/10%） /90%） /min）
1
0.0
60
40
0.8
2
22
85
15
0.8
3
25
100
0
0.8
4
32
100
0
0.8
5 32.01 60
40
0.8
检测具有重要的意义。
2.1 衍生剂溶液配制
254nm；梯度洗脱程序见表 1。
组 胺 的 检 测 方 法 有 分 光 光 度 法、