7_8_二羟基黄酮改善慢性应激小鼠认知功能_古训瑚

MMP - 8 在不同转移潜能人肝癌细胞株的差异性表达 及其对肝癌细胞迁移侵袭的影响
陈军泽1 ，覃贵慧2 ，骆 敏2 ，阳 洁2
（ 1． 广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科，2． 广西医科大学药学院药理学教研室，广西 南宁 530021）
The differential expression of matrix metalloproteinase-8 in human hepatocellular carcinoma cell lines with different metastatic potential and its influence on invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cell lines CHEN Jun-ze1 ，QIN Gui-hui2 ，LUO-Min2 ，YANG-Jie2
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中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Jul； 31（ 7） ： 1034 ～ 5
网络出版时间： 2015 － 6 － 5 11： 22 网络出版地址： http： / / www． cnki． net / kcms / detail /34． 1086． Ｒ． 20150605． 1122． 030． html
（ Dept of Neurology，the Second Affiliated Hospital to Nanchang University，Nanchang 330006，China） doi： 10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2015． 07． 030 文献标志码： A 文章编号： 1001 － 1978（ 2015） 07 － 1034 － 02 中国 图 书 分 类 号： Ｒ-332； Ｒ322． 81； Ｒ338． 64； Ｒ345． 57； Ｒ916. 4； Ｒ977. 6 关键词： 慢性应激； 认知功能； 7，8-二羟基黄酮； 受体酪氨酸 激酶 B； T 形迷宫； 新物体识别； 海马 Key words： chronic stress； cognition； 7，8-dihydroxyflavone； tyrosine kinase receptor B； T-shaped maze； new object recognition； hippocampus
7，8 - 二羟基黄酮改善慢性应激小鼠认知功能
古训瑚，刘志强，钟芳君，王 伟，徐丽君
（ 南昌大学第二附属医院神经内科，江西 南昌 330006）ห้องสมุดไป่ตู้
7，8-dihydroxyflavone improves cognitive impairment caused by chronic stress in mice GU Xun-hu， LIU Zhi-qiang， ZHONG Fang-jun， WANG Wei，XU Li-jun
收稿日期： 2015 － 03 － 08，修回日期： 2015 － 04 － 09 基金项目： 广西自然科学基金青年基金项目（ No 2012GXNSFBA053096） 作者简介： 陈军泽（ 1988 － ） ，男，硕士生，研究方向： 肿瘤学，外科学，
E-mail： 455622006@ qq． com； 阳 洁（ 1978 － ） ，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方 向： 肿瘤药理学，通讯作者，Tel： 0771-5350258，E-mail： yanglz2005@ 126． com
慢性应激影响认知功能，包括海马依赖的空间和陈述性 记忆等认知过程［1］。7，8-二羟基黄酮（ 7，8-dihydroxyflavone， 7，8-DHF） 可透血脑屏障，与脑源性神经生长因子（ brain-derived neurotrophic factor，BDNF） 受体酪氨酸激酶 B （ tyrosine kinase receptor B，TrKB） 高 亲 和 力 药 物［2］。应 激 敏 感 的 海 马，且高表达 BDNF 及 TrKB ［3］。目前，关于 7，8-DHF 对慢 性应激所致海马依赖的认知损伤的影响，尚未有报道。本实 验利用慢性社会挫败应激（ chronic social defeat stress，CSDS） 模型，观察 7，8-DHF 改善小鼠海马依赖学习记忆及相关蛋 白质阻断后海马学习记忆变化。 1 材料与方法 1． 1 动物及分组 ♂ C57BL /6J 小鼠，8-10 周龄，♂ CD1 小 鼠（ 仅作攻击用） ，8 ～ 9 月龄，均购于北京维通利华实验动物 技术有限公司。第 1 步实验分组： control 组、control + 7，8DHF 组、CSDS 组、CSDS + 7，8-DHF 组； 第 2 步实验分组： CSDS 组、CSDS + U0126 组、CSDS + 7，8-DHF 组、CSDS + U0126 + 7，8-DHF 组。 1． 2 药品及试剂 7，8-DHF（ 美国 TCI 公司） ，腹腔注射 5
（ 1． Dept of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Cancer Hospital， Guangxi Medical University，2． Dept of Pharmacology，School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning Guangxi， 530021，China） doi： 10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2015． 07． 031 文献标志码： A 文章编号： 1001 － 1978（ 2015） 07 － 1035 － 02 中国图书分类号： Ｒ345． 9； Ｒ73-37； Ｒ735． 702． 2； Ｒ977． 3 关键词： 基质金属蛋白酶-8； 肝癌细胞； 迁移； 侵袭； 转染； 逆
中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Jul； 31（ 7） ： 1035 ～ 6
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网络出版时间： 2015 － 6 － 5 11： 22 网络出版地址： http： / / www． cnki． net / kcms / detail /34． 1086． Ｒ． 20150605． 1122． 031． html
转录 － 聚合酶链反应； 蛋白免疫印迹 Key words： matrix metalloproteinase-8； hepatocellular carcinoma cell lines； migration； invasion； transfection； ＲT-PCＲ； Western blot
收稿日期： 2015 － 03 － 27，修回日期： 2015 － 04 － 25 基金项目： 江西省青年科学基金资助项目（ No 20122BAB215035） 作者简介： 古 训 瑚 （ 1989 － ） ，男，硕 士 生，研 究 方 向： 神 经 药 理，E-
mail： 540523118@ qq． com； 徐丽君（ 1962 － ） ，女，教授，硕士生导师，研究方向： 神经 系统疾病新药，通讯作者，Tel： E-mail： xulijun20050901 @ sina． com
基质金属 蛋 白 酶-8 （ matrix metalloproteinases-8，MMP8） 属于基质金属蛋白酶（ matrix metalloproteinases，MMPs） 家 族，在肿瘤的发 生 发 展 中 起 重 要 作 用。近 年 来 研 究 发 现， MMP-8 在肿瘤侵袭转移中具有双重作用，在不同的肿瘤中， 既可促进 肿 瘤 的 进 展，又 可 抑 制 肿 瘤 的 进 展［1］。但 目 前， MMP-8 与肝癌侵袭转移的关系尚不清楚。本研究通过观察 不同转移潜能人肝癌细胞株的 MMP-8 表达情况，以及过表 达 MMP-8 对肝癌细胞迁移侵袭的影响，以期为寻找抑制肝 癌转移侵袭的分子靶点提供新的实验依据。 1 材料与方法 1． 1 材料 实验所用细胞株均购自美国 ATCC，pcDNA3． 1MMP-8 重组质粒由中国广州赛业生物科技有限公司构建并 测序证实； 兔抗人 MMP-8 及 β-actin 一抗、HＲP 标记的羊抗 兔二抗均购自英国 Abcam 公司。 1． 2 方法 1． 2． 1 细胞培养、转染及筛选 细胞株用含胎牛血清、青霉 素及链霉素的 DMEM 高糖培养基于培养箱中常规培养。按
挫败应激鼠的海马依赖工作记忆及新物体认知明显减 退，7，8-DHF 可明显改善海马依赖的学习记忆，而 7，8-DHF 对正常鼠无改善作用，推测 7，8-DHF 可特异性改善慢性应 激所致学习记忆减退。挫败应激鼠 EＲK、TrKB 磷酸化水平 降低，7，8-DHF 逆转挫败应激所致的 TrKB、EＲK 磷酸化水平 下 降 ，提 示7，8-DHF 提 高 TrKB、EＲK 磷 酸 化 水 平 发 挥 其 改
mg·kg － 1 ，每天 1 次，共 10 d［3］。U0126（ 美国 Selleck 公司） ， 7，8-DHF 给药前 30 min 双侧背侧海马微量注射，每天 1 次， 共 10 d［4］。 p44 /42MAPK （ Erk1 /2 ） 抗 体、Phospho-p44 / 42MAPK（ Erk1 /2） 抗体、TrKB 抗体、Phospho-TrKB 抗体、Synapsin I 抗体，均购于 Abcam 公司。 1． 3 慢 性 社 会 挫 败 应 激 模 型 参 照 以 往 方 法［5］。 取 C57BL /6J 小 鼠 1 只，放 入 陌 生 ♂ CD1 小 鼠 饲 养 笼，使 C57BL /6J 小鼠遭受♂ CD1 小鼠攻击约 10 min； 然后用铁丝 网隔开，持续 4 h，如此连续应激 14 d，保证每天 C57BL /6J 小 鼠受不同 CD1 鼠的攻击。 1． 4 T 形迷宫实验与新物体认知实验 观察小鼠海马依赖 的工作记忆和新物体识别记忆。 1． 5 Western blot 检测突触小体相关蛋白表达变化。 1． 6 脑立体定位及套管安置 前囟为基点，定位于双侧海 马坐标（ － 1. 7 mm，± 1. 5 mm，－ 2. 3 mm） 。 1． 7 数据处理及分析 计量数据表示为 x珋± s，SPSS 20． 0 软 件对数据进行 ANOVA，两两比较用 Bonferroni 法。 2 结果 2． 1 7，8-DHF 逆转应激导致的海马依赖空间记忆和物体认 知功能 实验各组旷场实验运动总路程差异无显著性（ P ＞ 0. 05） 。小鼠 T 形迷宫交替率： 与 control 组相比，CSDS 组空 间记忆明显减退，7，8-DHF 逆转其减退（ P ＜ 0. 05） 。新物体 认知实验结果： 与 control 组相比，CSDS 组新物体识别功能 减退，且 7，8-DHF 逆 转 海 马 依 赖 的 新 物 体 认 知 减 退 （ P ＜ 0. 05） 。 2． 2 7，8-DHF 提高应激鼠海马 TrKB、EＲK 磷酸化水平和 突触膜蛋白表达 海马蛋白印迹条带相对灰密度值： 与 control 组 相 比，CSDS 组 EＲK、TrKB 磷 酸 化 水 平 降 低 （ P ＜ 0. 05） ，7，8-DHF 逆转应激所致的 TrKB、EＲK 磷酸化水平下 降（ P ＜ 0. 05） 。与 control 组相比，CSDS 组突触膜蛋白表达 明显下调（ P ＜ 0. 01） ，7，8-DHF 逆转其变化（ P ＜ 0. 05） 。 2． 3 U0126 阻断 7，8-DHF 改善认知 T 形迷宫实验结果： CSDS + 7，8-DHF + U0126 组与 CSDS 组差异无显著性（ P ＞ 0. 05） 。新物体认知实验结果： CSDS + 7，8-DHF + U0126 组 与 CSDS 组差异无显著性（ P ＞ 0. 05） 。 3 讨论