明胶酶谱实验
读书报告lzmc
图6
LCN2对在AGEs诱导下HAGE通过与其受体结合，激活NADPH-氧化酶活性通路激活PI3k-Akt-C/EBPβ 通路及JNK-C/EBPβ通路，进而促进LCN2的表达，从而表现出相应的生物学特性。 此外，实验中我们发现，通过shLCN2抑制LCN2的表达能够阻碍AGE诱导的HASMCs的 侵袭和迁移特性。
D：接下来，我们要验证C/EBPβ是否参与LCN2的转录激活。 实验：HASMCs,AGEs200μg /ml 24h 裂解细胞后加入各种检测物对应的抗体，经沉淀后CHIP分析。 IgG被用于排除非特异性免疫沉淀反应。 CHIP分析（染色质免疫沉淀分析）数据后显示绑定在LCN2启动子上的C/EBPβ在AGE处理后明显增加。而 经同样处理后的P65和c-fos却没有明显增多。 E、F:启动子分析也表明LCN2启动子的转录活性被AGE处理后显著增强（图3E） 为了探究C/EBPβ的哪个结合位点引起的上述结果，我们对C/EBPβ结合位点进行点突变(对HASMCs同时转 染带有LCN2启动子和PCMV-β-半乳糖苷酶的质粒，培养24h之后，AGEs处理，24h后荧光素酶分析)，结 果显示C/EBP-2参与转录激活HASMCs中AGE诱导LCN2的表达.
B图：检测NF-κB的亚单位p65, c-fos, c-jun, 和 C/EBPβ的核易位。数据显 示，C/EBPβ的核易位在经AGE处理后的3-6h内明显增加，易位的p65从1h 之后轻度增多，而c-fos, c-jun的位置却几乎没有明显的改变。（左右分别为 细胞质细胞核提取物）
C图，对C/EBPβ进行免 疫荧光染色清楚地显示 AGEs诱导C/EBPβ易位进 入细胞核。
实验表明:LCN2的表达与RAGE-NADPH活性氧通路有关，该通路可以引起PI3K-Akt和 JNK信号的激活。
2-酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性
催化剂
丙烯酰胺
N,N′-甲叉（亚甲基） 甲叉（亚甲基） 甲叉 双丙烯酰胺
烯酰胺凝胶有下列特性：
在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 1. 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； 2. 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； pH和温度变化较稳定 和温度变化较稳定； 3. 对pH和温度变化较稳定； 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； Acr纯度高 4. 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10 5. 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g； 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度， 6. 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓 度调节凝胶的孔径； 度调节凝胶的孔径； 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。 7. 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
SDS－PAGE的原理 － 的原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应， 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电泳中保持完整的状 态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。 蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。 仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。 而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是 仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白 这个技术首先是1967年由 年由 shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后， 建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后， 建立 蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。 蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。 SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断 （ ）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂， 裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。 裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还 原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。 原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中 加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白 后 分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和 加入还原剂和 结合成蛋白 - SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间 胶束， 胶束 所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量， 的电荷差异和结构差异。 的电荷差异和结构差异。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。
多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP-2、MMP-9表达的影响
多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP-2、MMP-9表达的影响刘泊明;张冰洁;杨贲;郝继龙【摘要】目的观察多核白细胞弹性蛋白酶与白细胞介素-1α对人角膜基质细胞表达的MMP-2、MMP-9的影响,进而探讨角膜溃疡的发生机理.方法体外培养人角膜基质细胞,在培养液中添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶或白细胞介素-1α,培养5天,通过明胶酶谱分析的方法测定培养上清中的MMP-2和MMP-9的表达.结果体外培养的人角膜基质细胞无任何刺激下可释放MMP-2;白细胞介素-1α可加强并激活MMP-2的表达,同时可诱导MMP-9前体的释放;多核白细胞弹性蛋白酶在白细胞介素-1α诱导下可完全激活前体MMP-9转化为活化形式.结论多核白细胞弹性蛋白酶和白细胞介素-1α协同作用参与角膜溃疡的发生.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2010(014)006【总页数】3页(P855-857)【关键词】多核白细胞弹性蛋白酶;白细胞介素-1α;角膜基质细胞;MMP-2;MMP-9【作者】刘泊明;张冰洁;杨贲;郝继龙【作者单位】伊通满族自治县第一人民医院,眼科,吉林,伊通,130700;吉林大学中日联谊医院,眼科,吉林,长春,130033;吉林大学中日联谊医院,眼科,吉林,长春,130033;吉林大学中日联谊医院,眼科,吉林,长春,130033【正文语种】中文【中图分类】R772.21角膜溃疡是指角膜组织缺损超越前弹力层、伴有角膜基质溶解的病理状态,角膜基质的溶解是由于角膜细胞外基质蛋白以及I型胶原和蛋白多糖的过度降解造成的,白细胞浸润参与这一过程,多核白细胞可以通过释放过氧化氢、自由基、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶和明胶酶等导致病理性组织损伤,而其中的多核白细胞弹性蛋白酶可降解许多种细胞外基质蛋白如弹性蛋白,糖蛋白,胶原,纤维连接蛋白等[1]。
角膜基质细胞可产生多种类型的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)[2],这些MMP均以酶原即潜酶的形式分泌到细胞外,需在细胞外经酶活化之后才能发挥其酶的作用。
明胶液化试验
明胶液化试验文章目录*一、明胶液化试验的基本信息1. 定义2. 专科分类3. 检查分类4. 适用性别5. 是否空腹*二、明胶液化试验的正常值和临床意义1. 正常值2. 临床意义*三、明胶液化试验的检查过程及注意事项1. 检查过程2. 注意事项*四、明胶液化试验的相关疾病和症状1. 相关疾病2. 相关症状*五、明胶液化试验的不适宜人群和不良反应1. 不适宜人群2. 不良反应明胶液化试验的基本信息1、定义明胶液化试验是利用某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶,能使明胶分解为氨基酸,从而失去凝固力,半固体的明胶培养基成为流动的液体这样的原理进行的试验方法。
2、专科分类传染病检查3、检查分类病原微生物检查4、适用性别男女均适用5、是否空腹非空腹明胶液化试验的正常值和临床意义1、正常值体内菌群的种类和比例正常,人体处于动态平衡。
2、临床意义肠杆菌科细菌的鉴别,如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶,而其他细菌很少液化明胶。
有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。
另外多数假单胞菌也能液化明胶。
异常结果:肠杆菌属临床上可引起胃肠炎、肠热症、菌血症或败血症等。
其中肠热症属法定传染病。
厌氧类梭菌属所致疾病: 破伤风梭菌——破伤风;产气荚膜梭菌——气性坏疽;肉毒梭菌——肉毒中毒;艰难梭菌——假膜性结肠炎。
假单胞菌属要分为绿脓杆菌感染、马鼻疽杆菌感染、类鼻疽等。
明胶液化试验的检查过程及注意事项1、检查过程原理:有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽,又进一步水解为氨基酸,失去凝胶性质而液化。
培养基:明胶培养基。
方法1、明胶琼脂平板法可于普通琼脂加入1%明胶倾注平板后,分为四个区,每个区分别划线接种一种被检菌,经24-48小时培养后,于培养基表面注入氯化汞溶液(氯化汞12g,蒸馏水80ml,浓盐酸16ml),如细菌液化明胶,则在菌落周围出现透明带。
方法2、将被检菌穿刺接种于明胶培养基,于20℃培养7天,逐日观察明胶液化现象。
2019-2-酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性-文档资料
NGAL的三级结构
➢ 由N 端的310螺旋、C 端的α螺旋和中间的和中间的八段反平行的β折叠所构成，这 八段反平行式β折叠构成了一个β折叠桶结构。
➢ 此β折叠桶结构一端是开放的，为与配体结合提供了进口；而另一端则被短的N 端 310螺旋所封闭。在β折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基， 形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点。
➢ 胶原是ECM的主要成分，目前已发现，至少有12种不同胶原类型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ 型胶原是间质结缔组织中的主要成分。Ⅳ型胶原则主要存在于基底膜内。
➢ 肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变 和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。
➢ 虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关 键分子及其信号通路。
综合性设计性实验-2
酶谱法检测血清中基质金属蛋白 酶MMP-2和MMP-9活性
此实验共包括如下三个部分
1. 第一部分，电泳技术简介 2. 第二部分，酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2
和MMP-9的活性 3. 第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性
变化及其临床意义
第一部分，电泳技术简介
基质金属蛋白酶蛋白家族
➢ MMPs家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分 布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型MMPs根据其作用底物的特异性、敏感性及氨 基酸序列的同源性分为三大类：
（1）间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间 质胶原, 即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型胶原, 但不能降解明胶和Ⅳ型胶原；
基质金属蛋白酶酶谱分析法
基质金属蛋白酶酶谱分析法刘 煜 张嘉宁 朱正美 基质金属蛋白酶(m atrix m etallop ro teinases, MM P s)是一组重要的蛋白水解酶,可以水解细胞外基质中胶原、纤维连接蛋白等多种成分[1],参与了人体内许多生理和病理过程,如骨的重建[2]、肿瘤转移[3]等都与MM P s密切相关。
近年来研究发现MM P s与生殖过程关系密切[4,5],如在月经的发生,着床与分娩过程都有一定的MM P s的变化,因而对MM P s的活性及种类的分析有着很重要的意义。
目前分析MM P s活性及酶量的方法有多种,其中酶谱法是将非还原性SD S2 PA GE电泳分析酶种类与检测酶活性有效结合的一种酶学方法。
尤其是具有在电泳中可将组织内与MM P s 紧密结合的组织抑制剂(T I M P s)分离,进而表现出酶的活性,从而达到在分离不同MM P s的同时又可直接显示其活性条带一举两得的特点。
鉴于MM P s酶谱分析法具有方法灵敏,结果直观,能同时观察酶与酶原种类和活性等优点,且其方法较简便,适于在不同实验室应用。
本研究用早孕子宫内膜样品经组织培养后,将其所分泌的MM P s运用酶谱分析法进行鉴别种类和活性分析,对方法的实验原理及条件进行了介绍,并就其优缺点进行讨论。
一、材料与方法11材料:丙烯酰胺(A cry),十二烷基磺酸钠(SD S),T riton2X100,Pep statine A,苯甲基磺酰氟(P M SF),N,N2亚甲基丙烯酰胺(B is),1,10菲洛林(1,10phenan th ro line),ED TA,明胶蛋白,DM E M F12无血清培养基,考马斯亮蓝G250,以上均为Sig2 m a公司产品;冰醋酸,甲醇(国产分析纯);72、92×103明胶酶标准品(美国N I H,D r.Stetler2Steven son W G 惠赠)。
21子宫内膜组织块培养:子宫内膜用灭菌冷生理盐水冲洗血迹后,剪成2mm2大小,在24孔培养板中加重量约50m g 孔组织块及1m l培养基后,于5% CO2、37℃条件下,培养5小时,收集上清,-20℃冰箱冻存用于酶谱分析[6]。
实验室微生物鉴定常见生化反应及应用价值
实验室微生物鉴定常见生化反应及应用价值明胶液化试验(1)原理：某些可以产生一种胞外蛋白水解酶(明胶酶)，能使明胶分解为氨基酸，使明胶失去凝固能力而液化，因而使半固体的明胶培养基成为流动的液体。
(2)方法：将待检菌接种于明胶培养基中，22℃培养7d或更长时间，每天观察结果有无凝固。
(3)结果：如无凝固，则表示明胶已被水解，液化试验阳性。
如凝固，则继续培养。
(4)应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙雷菌属和阴沟肠杆菌等到能液化明胶，肠杆菌科中的其它细菌很少液化明胶。
有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。
另外，许多假单胞菌也能产生明胶酶而使明胶液化吲哚试验(靛基质试验)(1)原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂(对二甲氨基苯甲醛)后则形成红色的玫瑰吲哚。
(2)培养基：蛋白胨水培养基。
(3)方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35℃孵育24~48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂，观察结果。
(4)结果：于两液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。
(5)应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等的鉴别。
硫化氢试验(1)原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢遇亚铁离子或铅离子则结合形成黑色沉淀物(硫化铁或硫化铅沉淀)。
(2)培养基：醋酸铅培养基。
(3)方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，于35℃孵育24h -48h，观察有无黑色沉淀出现。
(4)结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。
(5)应用：主要用于鉴别肠杆菌科中属及种的鉴别，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其它菌属大多为阴性。
但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。
尿素分解试验(1)原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。
酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP生物化学与分子生物学
酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP生物化学与分子生物学引言酶谱法是一种常用的方法，用于测定血清基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，简称MMP）的活性。
MMP是一类重要的蛋白酶，参与多种生理和病理过程，包括组织再生、肿瘤转移等。
本文将介绍血清基质金属蛋白酶MMP的生物化学特性以及酶谱法的原理和操作步骤。
血清基质金属蛋白酶MMP的生物化学特性血清基质金属蛋白酶（MMP）是一类富含锌离子的蛋白酶，在生物体内起到调节基质降解的重要作用。
MMP主要由细胞外基质成分和细胞表面的蛋白酶组成，包括胶原酶、明胶酶等。
这些酶在正常生理过程中，如组织再生和修复中，起到调节细胞迁移、基质降解的作用。
然而，在许多疾病的进展中，MMP的活性过高或过低都可能导致病理性结果，如肿瘤的转移和心肌梗塞。
MMP的活性可以通过多种方法进行检测，其中酶谱法是一种常用且灵敏的方法之一。
酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP的原理酶谱法是一种使用荧光信号来测定酶活性的方法。
在血清基质金属蛋白酶MMP的检测中，常使用一种荧光基质作为底物，这种底物在未被酶降解时会发出弱的荧光信号，但在被酶降解时会发出明显的荧光信号。
利用这种差别，可以通过测量荧光信号的强度来反映MMP的活性。
酶谱法的操作步骤包括以下几个方面：1.实验前准备：清洗试管和工具，准备所需试剂和样品。
2.底物制备：制备稀释的荧光底物，使其浓度适用于实验。
3.样品处理：将待测的血清样品加入试管中，同时添加荧光底物。
4.反应混合：轻轻摇动试管，使样品和底物充分混合，然后放置在恒温器中反应一段时间。
5.测量荧光信号：使用荧光检测仪器来测量样品中荧光信号的强度。
6.数据分析：根据荧光信号的变化来计算MMP的活性，并进行数据统计和分析。
酶谱法是一种常用的方法，用于检测血清基质金属蛋白酶MMP的活性。
通过测量荧光信号的强度，可以间接反映MMP的活性水平。
酶谱法具有操作简单、结果可靠、灵敏度高等优点，在生物化学和分子生物学研究中得到了广泛应用。
明胶酶的原理和应用
明胶酶的原理和应用1. 引言明胶酶（也称作明胶酶A、胶原酶）是一种能够降解和水解明胶的酶类。
明胶是一种常见的蛋白质，主要存在于动物的结缔组织中，具有重要的生物学功能。
在本文中，我们将详细介绍明胶酶的原理以及其在不同领域的应用。
2. 明胶酶的原理明胶酶是一种内切酶，能够断裂明胶多肽链中的特定键，产生明胶片段。
其作用基于酶-基质相互作用，具体过程包括以下几个步骤： - 明胶酶与明胶发生非共价相互作用，形成酶-底物复合物。
- 明胶酶通过水解作用，将明胶分子切割为较短的明胶片段。
- 切割后的明胶片段可以进一步被其他酶类降解为氨基酸。
3. 明胶酶的应用明胶酶在生物技术和食品工业等领域有着广泛的应用。
以下是明胶酶主要的应用领域和具体应用案例：3.1 食品工业•明胶的提取：明胶酶可以用于提取和制备明胶，用于食品工业中的胶凝、稳定、乳化等处理过程。
•制作果冻和糖果：通过明胶酶对明胶的降解，可以制作出具有特殊口感的果冻和糖果产品。
•啤酒的澄清：明胶酶可以用于啤酒酿造过程中的澄清处理，使啤酒呈现出清澈的外观。
3.2 医药领域•胶原蛋白治疗：明胶酶可以将胶原蛋白分解为较小的片段，用于治疗关节问题和皮肤问题。
•伤口愈合：明胶是伤口愈合过程中重要的组成部分，通过明胶酶的应用可以促进伤口愈合的速度和质量。
3.3 生物技术•基因测序中的消除阻碍：明胶酶可以用于去除PCR反应生成的非特异性产物，提高基因测序的准确性。
•DNA电泳：明胶酶可以用于DNA电泳过程中，消化掉电泳胶上的明胶，便于观察和分析DNA条带。
4. 结论明胶酶作为一种重要的酶类，在食品工业、医药领域和生物技术中有着广泛的应用。
了解明胶酶的原理和应用可以帮助我们更好地利用该酶的特性，开发出更多的应用领域。
随着科技的进步和技术的创新，相信明胶酶的应用领域还会不断扩展和完善。
注意：本文档仅供参考，切勿用于商业用途。
酶谱分析报告
酶谱分析报告1. 引言酶谱分析是一种通过检测和分析生物体内酶的活性来研究其生物功能和代谢过程的方法。
酶是生物体内的蛋白质分子，可以加速化学反应的速度，并在许多生物过程中起关键作用。
通过酶谱分析，我们可以揭示不同生物体内酶的特点、功能和调控机制，进一步了解生物体的生理和代谢状况。
2. 实验目的本实验旨在通过酶谱分析，研究某种酶在不同条件下的活性变化，并分析其对不同底物的亲和力和催化效率。
3. 实验方法3.1 实验材料•酶样品：某种酶的提取物•底物：不同浓度的底物A、底物B、底物C•缓冲液：pH 7.0的磷酸盐缓冲液3.2 酶活性测定1)准备不同浓度的底物溶液A、B、C，并具体记录其浓度。
2)预热分光光度计至37℃。
3)在离心管中分别加入以下试液：•100 μL 酶样品•200 μL 缓冲液•300 μL 底物A•300 μL 底物B•300 μL 底物C4)迅速混匀，置于37℃恒温水浴中孵育一段时间（一般根据酶的反应速度及底物的降解情况而定）。
5)取出离心管，停止酶反应。
可以通过加入一定体积的抑制剂或改变pH值的方法来进行反应的停止。
6)使用分光光度计测定不同底物的吸光度，并记录到实验数据表中。
7)根据实验数据计算酶的活性。
4. 实验结果及分析通过实验测定不同底物的吸光度，我们可以得到以下数据：底物浓度 (mol/L) 吸光度A 0.001 0.150A 0.002 0.303A 0.003 0.455B 0.001 0.125B 0.002 0.253B 0.003 0.376C 0.001 0.135C 0.002 0.270C 0.003 0.400根据上述实验数据，我们可以画出酶活性随底物浓度变化的曲线图。
从曲线图中可以看出，酶对底物的亲和力随着底物浓度的增加而提高。
在低浓度时，酶活性与底物浓度呈正相关关系；而在一定浓度范围内，酶活性达到饱和状态，与底物浓度的增加呈线性关系；随着底物浓度进一步增加，酶活性逐渐趋于稳定，不再改变。
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1) 母液配制：
1. 10X明胶溶液（50ml）：称取500mg明胶，加入高压灭菌三蒸水约
40ml，室温放置2h，使其吸水膨胀，然后置于65°C水浴，在15min之内溶成均匀的液体，最后定容至终浓度10mg/ml，于4°C备用。
注：样本量较多时一次性配制50ml，分装于5ml EP管中-20°C备用。
2. 10X 50mM Tris-HCl母液（2L）：即0.5M Tris-Hcl。
称取121.14g Tris-base，双蒸水溶解后浓盐酸调节pH值至7.5，定容至2L。
3. 20X 5mM CaCl2母液（1L）：即100mM CaCl2（分子量111）。
称取11.1g CaCl2，双蒸水溶解后定容至1L。
4. 2000X 1uM ZnCl2母液（1L）：即2mM/L ZnCl2（分子量136.30）。
称取0.2726g ZnCl2，双蒸水溶解后定容至1L。
（注：使用浓度实在太小，只好配大体积的母液增加精准度。
ZnCL2在水中呈絮状，用前剧烈震荡均匀）
5. 10X 2.5% Triton X-100母液（400ml）：即25%TritonX-100。
100mlTriton X-100原液双蒸水稀释至400ml。
4度保存备用。
6. 10X Brij-35 0.02%母液（500ml）：即0.2%Brij-35。
称取1g Brij-35至400ml双蒸水，65度水浴加热至完全溶解后定容至500mL。
4度保存备用。
2) 使用液配制：
1. 5×loadingbuffer配方:用培养细胞上清等浓度较低样本检测
Tris-HCl(PH6.8) 0.4M
SDS 10%
Glycerol 50%
Bromophenol blue 0.03%
2. 2×loadingbuffer配方:用血清、组织样本等浓度较高样本检测0.125 M Tris–HCl, pH 6.8
4% (w/v) SDS
20% (v/v) glycerol
0.04% (w/v) bromophenol blue.
3. 洗脱缓冲液1L：
4. 漂洗液1L：
5. 孵育缓冲液1L：
6. 考马斯亮蓝R-250染色液（可重复使用）：
Methanol 30%
Acetic acid 10%
Coomassie R blue 0.25%
7. 脱色液：
Methanol 20%
Acetic acid 10%
3) 操作步骤：
1. SDS-PAGE胶的灌制：灌制8%SDS-page分离胶（同western blot，现配现用）和5%浓缩胶，分离胶加入1/10体积的10mg/ml的明胶溶液，使明胶终浓度为1mg/ml。
配方：
8%分离胶：
除多加了胶总体积1/10的明胶外（水的体积相应减少胶总体积的1/10），其余成分与常规SDS-page相同。
比如：配制15ml胶，需1.5ml明胶，双蒸水体积减少1.5ml。
5%浓缩胶：同常规SDS-page
d3H2O 2.1ml
30%丙烯酰胺溶液 0.5ml
1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml
10% SDS 30μl
10%过硫酸铵(AP) 30μl
TEMED 3μl
终体积： 3ml
2. 电泳：上清与5×上样缓冲液以4：1混匀，上样后，4°C、60V浓缩胶、120-150V分离胶电泳3-4小时，至溴酚兰完全涌出，72KD 蛋白marker 到达分离胶将近一半的位置。
3. 洗脱：胶置于100ml洗脱液中，摇床高频震荡1小时，以洗脱SDS，使蛋白质复性，每15分钟更新一次洗脱液。
4. 漂洗：适量漂洗液中漂洗5minX2次。
5. 孵育：胶置于100ml孵育缓冲液中，于37°C水浴缓慢震荡孵育24-
48h。
6. 染色：将充分孵育后的胶以双蒸水漂洗5分钟，重复两次，然后置于0.25%的考马斯亮蓝R250染液中，放在平缓摇动的摇床上于室温染色3小时。
7. 脱色：将染色后的胶置于脱色液中，放在平缓摇动的摇床上于室温脱色，每30分钟更新一次脱色液，至深蓝色背景上显出无色清晰酶谱条带停止。
然后以双蒸水漂洗残留染料。
8. 扫描分析：将胶以ImageScanner（Amersham）扫描成像，ImageQuant TL V2003软件分析各酶谱条带灰度值，比较各组样本MMPs活性
的差别。
3、胶原酶谱法检测MMPs的表达及活性胶原溶液配制：称取10mg胶原，溶于0.3M醋酸溶液中，最后定容至10mg/ml，于4°C备用。
其余步骤同明胶酶
谱法。
4、反向明胶酶谱法检测TIMPs的表达及活性将5µg的Active-MMP2溶于1%SDS溶液中，终浓度为10µg/ml,冻存于-80°C备用。
配制12%的SDS-PAGE 分离胶，其中含明胶终浓度为2mg/ml，Active-MMP2终浓度为0.1µg/ml,孵育时间为24小时，脱色至看到无色背景中显出深蓝色清晰TIMPs条带，其余步
骤同明胶酶谱法。
丁香园童鞋及本人的经验，可借鉴：
1、SDS－PAGE电泳分为分离胶和浓缩胶，浓缩胶可以不加底物明胶（当然也可以加），因为明胶凝固后形成网络状结构，不会随电泳而迁移；
2、SDS－PAGE浓度的选择要根据我们要检测的MMP分子量的大小而定，一般MMP2、9的MW在90及70KD左右，因此用10％胶即可；
3、明胶终浓度的不同是因为我们检测的样本MMP的含量有很大差别，若代检样本MMP的浓度较高，相应底物明胶浓度要高些，但检测灵敏度降低了，反之亦然，因此实验要摸索一下，既要检出差别，还要酶谱条带漂亮；
4、加入还原剂后会扩散到其他泳道抑制MMP的酶活性，有低分子量marker 可以不用HT1080细胞作为对照，但染色后marker往往被明胶遮掩掉，可用预染marker代之，并在电泳完毕后预扫描；
5、洗脱缓冲液和孵育缓冲液都是自己配制的，开始很麻烦，做几次之后就很easy了。
培养细胞上清样本制备方法：
按2.5×106细胞每皿，将HepG2-XB细胞及HepG2-HIS细胞分别接种至6cm 平皿，培养24小时后以无血清DMEM洗3遍，以2ml含G418 400μg/ml的
无血清DMEM继续培养，24小时后收集上清，离心去除细胞，上清冻存于-20°C备用；细胞以胰酶消化后重悬计数，以校正酶谱检测时各样品上样量。
HT1080细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养，至细胞覆盖约70%时，无血清DMEM洗3遍，以5ml无血清DMEM继续培养，24小时后收集上清，离心去除细胞，上清冻存于-80°C备用。
血清及血浆MMPs检测预处理：
因两者MMPs含量相对较高，本人将其稀释后上样10ul使用。
稀释方法：10ul 样本+20ul双蒸水+2Xloading buffer 30ul。
即实际上样量只有1.67ul。
不过，做完整个实验才觉得：也许血清原液上样2ul可能更合适。
肝组织样本MMPs检测
预实验中测试了两种裂解液，效果相似。
一种是普通的三相蛋白裂解液（RIPA）；一种是一篇英文protocol上推荐的单相裂解液，配方如下：25mM Tris-HCl，pH7.5；100mM NaCl；1% NP-40（Nonidet-40）。
常温可储存6个月。
用前加入蛋白酶抑制剂PMSF及cock tail（三种混合的蛋白酶抑制剂）。
预实验中肝组织上样量设了5个梯度：10ug、20ug、50ug、80ug、100ug。
目测50ug效果较好；明胶浓度为0.5mg/ml。
结果：MMP-2比较明显，MMP-9较浅甚至难以检出。
另外还有大分子的酶复合体和小分子的降解后的活性片段。