持续瘤胃发酵方法测定混合饲料体外发酵产气量和pH值的试验研究

持续瘤胃发酵方法测定混合饲料体外发酵产气量和pH值的试验研究摘要：pH值和产气量是瘤胃发酵参数的重要指标，pH值的变化直接影响着反刍动物的瘤胃内环境，影响着微生物的活动；本试验的目的是通过体外发酵方法测定混合饲料的体外发酵参数，为混合饲料在生产上应用提供理论参数。

而产气量则在一定程度上反映了饲料的发酵类型和发酵程度，是评价饲料营养价值的重要指标。

关键词：pH值；瘤胃发酵参数Continuous rumen fermentation method for determining mixed feed in vitro fermentation gas production rate and pH value of the test researchAbstract: ph value and gas production is rumen fermentation parameters of important indicators ，ph value change directly affectsthe ruminant of rumen internal environment ，affect microbialactivity ，the purpose of this study is through the in vitrofermentation method for determining mixed feed in vitro fermentation parameters ，for mixed feed in the production application provide theoretical parameters ，and the gas production is in a certain extent reflects the feed fermentation type and degree of fermentation .Key words: ph value ; rumen fermentation parameters目录引言 - 1 -1材料与方法 - 1 -1.1试验材料 - 2 -1.1.1试验动物 - 3 -1.1.2试验材料 - 3 -1.1.3试验仪器 - 4 -1.2试验方法 - 4 -1.2.1样品采集与处理 - 4 -1.2.1.1瘤胃内容物的采集 - 5 - 1.2.1.2瘤胃微生物的培养 - 5 - 1.2.1.3开始培养 - 6 -1.2.1.4更换饲料袋和取样 - 7 - 1.2.1.5样品采集 - 8 -1.2.2瘤胃发酵指标测定方法 - 9 - 1.2.2.1pH值的测定 - 10 -1.2.2.2产气量的测定 - 11 -2讨论 - 12 -3结论 - 13 -4参考文献 - 14-5致谢 - 15 -6附录 - 16 -前言目前要以整体上全面清楚地实施瘤胃发酵调控以期获得能发挥动物最大生产性能的最佳发酵模式还不太现实这是因为人们对瘤胃发酵系统本身还不十分清楚, [2]特别是缺乏瘤胃微生物生态学、生理学和生化代谢方面的详尽知识, 就现阶段来说, 瘤胃发酵调控只停留在局部表面上, 是模糊被动的, 很多方面是知其然不知其所以然。

[3]所以本试验通过体外发酵方法测定混合饲料的体外发酵参数，模拟瘤胃的内环境，通过数据进行分析，从而为混合饲料在生产上应用提供理论参数。

pH值和产气量是瘤胃发酵参数的重要指标。

[1]人们在生产实践中, 有意或无意的改变,从而导致发酵终产物数量或质量的变更改善了饲料利用率, 提高了生产性能, 因而, 瘤胃发酵调控便一直被作为一个专门的研究课题受到人们的重视。

本实验分别测定9种不同营养水平的混合饲料对pH的影响，分别在3、6、9、12、24小时进行测定，表明在同一时间内高能高蛋的饲料pH最高，而随时间的延长pH逐渐下降。

产气量随着时间延长而增加，在中能时候产气量最大。

1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物瘤胃液供体动物为12只安装永久瘤胃瘘管的杂交绵羊，体重为35±2kg、健康，日粮组成精粗比为30:70。

每天6：00和18：00两次等量饲喂，[4]自由饮水。

日粮的具体组成及营养水平（见表1-1）。

表1-1 日粮组成及营养水平（干物质基础）1.1.2 试验材料本试验配制9种不同营养水平（不同能氮水平）的混合饲料，参照中国绵羊饲养标准，[7]按1.2倍的维持需要水平为中能量中蛋白水平（ME：9.36MJ/kg，CP：12.55%），在此基础上代谢能0.9倍为低能量水平（8.42MJ/kg）、1.1倍为高能量水平（10.29MJ/kg），CP 0.8倍为低蛋白水平（10.04%），1.2倍为高蛋白水平（15.06%）。

营养水平和组成比例见表1-2。

表1-2 不同营养水平混合日粮的组成和比例（DM基础上%）单外流体外培养系统Rusitec缓冲液配制按照McDougll’s buffer（见表1-3）。

表1-3 McDougll’s缓冲液成分组成1.1.3试验仪器Rusitec单外流连续培养系统pH计（上海雷磁分析仪器厂，玻璃电极）分光光度计1.2试验方法本试验以12只健康、安装永久瘤胃瘘管的杂交绵羊为瘤胃液供体，9种不同营养水平的混合饲料为发酵底物，采用单外流连续培养系统（Rusitec）进行单因素体外试验。

共9个处理，每个处理3个重复。

适应期7d，[5]试验期3d。

采用SPSS分析处理。

1.2.1 样品采集与处理1.2.1.1瘤胃内容物的采集于早饲前从12只装有永久瘤胃瘘的杂交绵羊瘤胃中采集瘤胃内容物。

在温度较低的环境中，即使动物只少量饮水也会给采集带来困难。

将采集的瘤胃内容物用四层纱布过滤，液体和固体分别装在不同的塑料瓶或袋子中，尽可能避免空气的污染。

Rusitec的每个发酵罐需要450mL到500mL的瘤胃液和70g的固态内容物。

将采集到的瘤胃内容物尽快带回实验室。

1.2.1.2瘤胃微生物的培养通过四层纱布的过滤将液体滤出，并放在已通入CO2的桶中，同时将滤出的固态内容物放入另一个桶中，同样通入CO2。

称取70g滤出的瘤胃固态内容物置于饲料袋中（始终保持其在CO2的环境中），并将其与装有日粮的饲料袋共同放在发酵罐中。

[6]再在发酵罐中放入400mL过滤得到的瘤胃液，用缓冲液将发酵罐填满直至溢出线。

1.2.1.3开始培养安装发酵罐，用水将发酵罐的外壁清洗干净，浸入水浴中，连接动力装置与缓冲液导管，水浴的温度必须在39℃左右，连通电源，开始培养。

1.2.1.4更换饲料袋和取样在培养了22-24h后，关闭电源，更换饲料袋。

如果需要测量产气量，首先将集气袋断开，并测量产气量。

测量废液缸中废液的量，用于调整稀释度。

将输送缓冲液的导管断开，把发酵罐从水浴中取出，对发酵罐中的液体和固体分别进行取样。

取样完成后更换饲料袋，当打开发酵罐的盖子时应通入CO2，以保证其始终处于厌氧环境中，被更换的饲料袋是已经是培养了48h的，将新加入的饲料袋置于发酵罐底部。

被更换的饲料袋需用缓冲液冲洗，洗液倒回发酵缸中。

重新连接，继续培养。

1.2.1.5样品采集适应期结束后，连续3d每天早晨8点采样，采集发酵罐中和收集瓶中的培养液及饲料袋中的发酵底物，-20℃保存。

1.2.2 瘤胃发酵指标测定方法1.2.2.1pH值的测定采用PHS-3C酸度计测定（上海雷磁分析仪器厂，玻璃电极）。

1.2.2.2 产气量的测定在每天更换饲料袋前，用gasometer直接测量集气袋中气体体积。

1.3结果1.3.1不同营养水平混合饲料pH值表1-4不同营养水平混合饲料pH值注：同类同列上角标不同字母表示差异显著（P<0.05），3小时低能高蛋，中能中蛋中能高蛋差异显著，6小时低能中蛋、高能低蛋、高能中蛋差异不显著。

9小时低能中蛋、高能低蛋差异不显著。

12小时低能高蛋、中能低蛋差异显著。

24小时低能中蛋、低能高蛋、高能中蛋差异显著；同一组间低能低蛋在6、9、24小时时差异显著，低能中蛋均不显著，低能高蛋24小时差异不显著，中能低蛋3小时差异不显著，中能中蛋12小时差异不显著，中能高蛋12小时差异不显著，高能低蛋24小时差异显著，高能中蛋9小时差异显著，高能高蛋3、12小时差异显著。

1.3.2.2不同营养水平混合饲料产气量（单位：L）表1-5不同营养水平混合饲料产气量（单位：L）注：3小时中能低蛋差异显著，6小时中能高蛋差异显著，9小时中能高蛋差异显著，12小时差异均不显著，24小时不显著；组间只有中能中蛋、中能高蛋差异显著。

同类同列上角标不同字母表示差异显著（P<0.05）2 讨论活体外人工瘤胃产气量法（In Vitro GasProduction Method）是目前发达国家采用最多的用来评价反刍动物饲草饲用价值的技术之一。

[8]本实验通过体外发酵方法测定混合饲料的体外发酵参数，为混合饲料在生产上应用提供理论参数。

本研究的各个不同比例组合的p H值都在 6 . 5 ～ 7 . 0之间，在瘤胃微生物适宜生活的p H值范围内，[10] 这一结果与 S o m m a r t ( 1 9 9 8 ) 的研究结果基本一致。

而且产气量则在一定程度上反映了饲料的发酵类型和发酵程度，是评价饲料营养价值的重要指标，在不同时间不同营养水平时测得的产气量中能的混合饲料差异显著；在组间的比较中产气量有了明显变化，更加凸显了中能混合饲料的显著性。

瘤胃内的pH 值是反映瘤胃内部的环境状况的重要指标之一，同时它也是饲料在瘤胃内的发酵程度和模式的一个表观征。

本实验pH 在高蛋的混合饲料在不同的时间里差异显著；而且在组间比较中也显著，而其他各组差异不显著。

根据Menke 最早提出的人工瘤胃产气量法评价饲草料的营养价值，体外发酵产气量是反刍动物瘤胃底物发酵一个很重要的指标，它与饲料有机物的发酵强度成正相关。

[9]3结论确测定混合饲料发酵产生的pH值和产气量，不同营养水平混合饲料PH值，同类同列上角标不同字母表示差异显著（P<0.05）。

不同营养水平混合饲料产气量，同类同列上角标不同字母表示差异显著（P<0.05）。

实验结果表明中能高蛋的饲料在不同时间和组内比较中差异显著，所以中能高蛋的混合饲料更利于瘤胃内环境，提高饲料利用率及降解率。

4参考文献[1]钱文熙，崔慰贤．瘤胃发酵过程及其调控[J]．宁夏农学院学报，2004，25(1)：61-64.[2]Cone J W, Van Gelder A H, Soliman I A, et al. Different techniquesto study rumen fermentation characteristics of maturing grass and grass silage[J]. J Dairy Sci., 1999, 82(5):957-966.[3] Johnson R R. Techniques and procedures for in vitro and in vivo rumen studies[J]. J Anim Sci., 1966, 25(3): 855-875.[4]Tilley J M S, Terry R A. A two-stage technique for the digestion of forage crops[J]. Journal of the Briish Grassland Societ, 1963,18:104-111.[5]张乃峰，王中华，等．反刍动物饲料蛋白质瘤胃降解率的评定技术[J]．中国饲料，2002(9)：26-27.[6]Mould F L, Kliem k E, Morgan R,et al. In vitro miceobial inoculum:Areview of its function and properties [J]. animal Feed SciTechnol,2005, 123-124: 31-50.[7]张乃峰，王中华，等．反刍动物饲料蛋白质瘤胃降解率的评定技术[J]．中国饲料，2002(9)：26-27.[8]反刍动物人工瘤胃技术研究及应用崔彦召南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095[9]秸秆和苜蓿干草不同比例组合对人工瘤胃pH 值、氨态氮及产气量的影响阳伏林《饲料工业》·2007 年第28 卷第17 期[10]肉牛饲喂前后瘤胃液对饲料体外发酵产气量及pH 值和氨态氮的影响李亚君中国农业大学动物科技学院, 北京100094）。