南山楂总黄酮提取工艺优化研究

ｔｃｎｌｇｆｔｅｔｔｌａｏｏｄｏＣａａｇｓｃｎａａＳｅ．ｔＺｃ．ａｐｉｚｄｂｒｏｏａｘｅｍｅｔｉｈｉｌｆｔｔｌａｅｈｏｏｙｏｏａｖｎｉｓｆｍｒｔｅｕｕｅｔｉｂｅｕｃｗｓｏｔｈｌｆｒｍｉｅｙｏｔｇｎｌｐｒｎｔｔｅｙｅｄｏａ－ｈｅｉｗｈｏｆｌ
（ｒｔｇｓｉａｉｄｇ．的干燥成熟果实” ，ＣａｅｕｐｎｔａＢｅ）ａｎｆｉ而南山楂为（ｒｔｇｓｃｎａａＳｅ．ｔｕｃ）ＣａｅｕｕｅｔｉｅＺｃ．的果实，ａｂ习称野山楂。前者主产于华北、东北地区；者主要分布于南部各地Ｊ后。南山
ｖｎｉｒｍａａｇｓｃｅｔｅｅｏｏｄｓｆｏＣｒｔｅｕｕｎａａＳｉｂ．ｔＺｕｃｃ．
Ｋｅｒｓｏｈｇｎｌｅｐｒｎ；ｒｔｅｕｕｅｔｚｔｎｙｗｏｄ：￣ｏｏａｘｅｍｅｔｃａａｇｓｃｎａａｓｅｅｕｃｔｃｎｌｇｏｔｉｙｍｉｉａｏ
ｖｎｉｓｆｍｒｔｅｕｕｅｔｉｂｅｕｃａｎｅｎｉｈｏｃｎｒｔｎｏｔａｏ，ｈａｉｆｓｌｏｌｕｄ，ｘｒｃｉｎｔｏｏｄｒｏＣａａｇｓｃｎａａＳｅ．ｔｃ．ｓｉｄｘａｄｗｔｔｅｃｎｅｔｉｆｅｈｎｌｔｅｒｔｏｏｉｔｉｉｅｔｔｉＺｈａｏｏｄｑａｏｍｅ
ａｄｎｍｂｒｏｉｓａａｔｒ．ｓｌＴｅｏｔｍｘｒｃｉｎｔｃｎｌｇｏｈｏａａｏｏｄｏＣａａｇｓｅｎａａＳｅ．ｔｎｕｅｆｔｍｅｓｆｃｏｓＲｅｕｔｓｈｐｉｍｕｅｔａｔｅｈｏｏｆｒｔｅｔｔｌｆｖｎｉｓｆｍｒｔｅｕｕｅｔｉｂｅｏｙｌｒ
Ｔｅｏｔｍｘｒｃｉｇｔｃｎｌｇｓｓｍｐｅａｄｒａｏａｌ，ｎｔｅｖｓａｏｄｒｆｒｎｅｆｒｔｅｅｔｃｉｇｐｏｅｓｏｅｔｔｌｌ— ｈｐｉｍｕｅｔｔｈｏｏｉｉｌｅｓｎｂｅａｄｉｓｒｅｓａｇｏｅｅｅｃｏｘｒｔｒｃｓｆｏａａａｎｅｙｎｈａｎｈｔｆ
山楂分为北山楂和南山楂，中北山楂为蔷薇科植物山其
里红（ｒｔｇｓｐｎａｉｔｇ．ａ．ａｏ．Ｂ．或山楂ＣａａｕｉｎｔｕａＢｅｖｒｍｊｒⅣ Ｅｒ）ｅｆ
徽省阜阳市药检所鉴定为正品。其他试剂均为分析纯。
２方法与结果２１南山楂总黄酮含量测定方法．
ＺＨＡＮＧｅ—ｅｇＷｉｆｎ
（
ＴｍｒｏｉｌｆＦｙｎＦｙｎ，ｎｕ２６１）ｕｏｓｔｕａｇ，ｕａｇＡｈｉ３０８Ｈｐａｏ
Ａｂｓｒｃ：ｍＴｏｏｉｚｈｅｅｔａｔｎｇｐｏｅｓｆｔｅｔｔｌｆａｏｏｄｒｍａａｇｕｅｔｉｂ．ｔＺｕｃ．ｅｈｏｓＴｈｘｒｃｔａｔＡｉｐｔｍｉｅｔｘｒｃｉｒｃｓｏｈｏａｖｎｉｓｆｏＣｒｔｅｕｓｃｎａａＳｅｅｃＭｔｄｌｅｅｔａｔ
优化的提取工艺简便、合理，可为南山楂总黄酮工业化提取提供重要的参考。
Ｅｘｒｃｉｎｔｃｎｌｇｆｔｔｌｆａｏｏｄｒｍｒｔｅｕｔａｔｏｅｈｏｏｙｏｏａｖｎｉｓｆｏｃａｌａｇｓｃｎａｉｂ．ｔＺｕｃｕｅｔｓｅｅｃ．ａ
Ｚｃ．ｒｓｆｌｗ：ａｉｎｏｔａｏａｏ，ｅｒｔｆｓｌｏｓｌｔｎ１１ｅｔａｔｇ２ｔｓｅｃｒ２ｈｕｓＣｏｃｕｉｎｕｃｗｅｅａｌｓｒｔｆｈｎｌｗｓ６％ｔａｉｏｏｉｔｏｕｉ：２，ｘｒｃｉｉｏｏｏｅｈｏｄｏｎｍｅ，ａｈｆｏｒ．ｎｌｓｏｓｏ
・
８０‘ ９
安徽医药Ａｈｉｄｃｌｎｈｒｃｕｃｌｏｒａ２１ｕ；４８ｎｕｉｄＰａｍａｅｔａｕｎｌ００Ａｇ１（）ＭｅａａｉＪ
南山楂总黄酮提取工艺优化研究
张威峰
（安徽省阜阳市肿瘤医院，安徽阜阳２６１）３０８
摘要：目的优化南山楂总黄酮的提取工艺。方法以南山楂总黄酮的含量为评价指标，以乙醇浓度、料液比、提取次数、提取优化的提取工艺为６％乙醇、０料液比１１、次２ｈ提：２每、
时间为考察因素，采用正交试验优化南山楂总黄酮的提取工艺。结果取２次。结论关键词：正交试验；山楂；南工艺优化

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山楂叶总黄酮提取的主要影响因素研究

试验对提取山楂叶总黄酮的主要影响因素进行了研
究，为进一步开发利用山楂资源提供依据。
１材１标准曲线的建立参照药典方法，加改．．略进。准确称取烘干至恒重的芦丁标准品配成０２．ｍＬ的对照溶液，分别量取Ｏ１．０３０４０５０ｍ，、．２．、，．Ｌ各加７０．．．０乙醇至５０ｍＬ加入显色剂显色，５０Ｆ．，于１ｆｎ处测其吸光度值，绘制标准曲线。１３２重复性试验和稳定性试验称取０５０ｇ充分．．．０混匀的山楂叶片，按照１３１法提取并测定总黄酮含．．方量。取９次重复的平均值验证其重复性试验；定同一测
Ｋ５０ＤＱ００Ｂ型数控超声波清洗器（山市超声仪昆器有限公司）７４型紫外可见分光光度计（；５上海光谱仪
粉、中粉、粗粉３个梯度）木同提取方法（、选择冷浸法、热
回流法、超声波法３种提取方法）和不同提取时间（设计
第一作者简介：志霞（９１）女，士，主要从事果树栽培与李１８一，博现
重要。研究证实，山楂叶和果含有相近的营养及药用器有限公司）Ｊ５０Ａ型千分之一电子天平；ＨＧ；Ａ－０３Ｄ－
９４Ａ型电热恒温鼓风干燥箱（海精宏实验设备有１６上限公司）Ｒ－２型旋转蒸发仪（海亚荣生化仪器；Ｅ５Ａ上
厂）芦丁（海试剂二厂）。上乙醇、酸铝、硝酸钠、硝亚氢氧化钠等均为分析纯。１３试验方法．

山楂中黄酮提取的研究

机中离心，使之快速分相，５ｍｉｎ后取出。用胶头滴管分别吸取上、下相溶液进行分析，分别测定上、下相体积，双水相中山楂
总黄酮的含量。１．５山楂中总黄酮含量的测定
具有良好的调节作用；而且黄酮还具有防癌的作用，对一些冠状动脉心脏疾病相关的症状有一定的预防作用。因此这些化合物能够广泛应用在医药、保健食品添加剂和杀虫剂等领域，于是在国内外越来越成为人们研究的热点。
１．０ｍＩ、３号管中加人２．０ｍＩ、４号管中加入３．０ｍＩ、５号管中
加入４．０ｍＬ、６号管中加入５．０ｍＩ，分别加入５Ｏ乙醇使成５ｍＬ；精密加入５ＮａＮＯ２溶液０．３ｍＩ，摇匀，放置６ｍｉｎ；加入１ＯＡｌ（Ｎ０３）３溶液０．３ｍＩ，摇匀，放置６ｍｉｎ；加入１ｍｏｌ／ＩＮａＯＨ溶液４ｍＩ；用５０％乙醇加到１０ｍＬ处，混合均匀。向１号管中加入５ＮａＮＯｚ溶液０．３ｍｉ，摇匀，放置
入１ｍｏｌ／ＩＮａＯＨ溶液４ｍＩ；用５０乙醇定容到１０ｍＩ处，混
芦丁对照品（批号１０００８０ — ２００７０７）购自中国食品药品检定
研究院，山楂购白国药控股福建有限公司中药部。
１．４双水相体系的配制将一定量的聚乙二醇、硫酸铵、３ｍＩ粗提液，加入一部分蒸馏水，用０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ和０．１ｍｏｌ／Ｉ的ＨＣ１调节ｐＨ，

响应面法优化山楂叶中黄酮提取工艺

ＺＯａ．Ｕ，ＧＯＨｎ，ＵＬａｇｍａＬｈｎ．ａ‘ ＨＵＨｉＡａＱｉｎ — ｉｏ，ＩｏｇｈｉＸＺ
（．ｏｌｅｏｏｄＳｉｃｎｎｉｅｉｇＣｎｒｌｏｔＵｉｒｉｆｏｅｔｎｅｈｏｇ，１ＣｌｇｆｏｃｅｅａｄＥｇｅｒ，ｅｔｕｈｎｖｓｙｏｒｓｙａｄＴｃｎｌｙｅＦｎｎｎａＳｅｔＦｒｏ
Ｃｈｎｓａ４１０４，ａｇｈ００Ｃｈｉａ；２．ｃｏｌｏｏｃｅｃＨｅａｎｔｕｅｏｃｅｃｎｃｎｌｇｎＳｈｏｆＦｏｄＳｉｎｅ，ｎｎＩｓｉｔｆＳｉｎｅａｄＴｅｈｏ Nhomakorabea ｙ，ｔ
工艺条件为：乙醇体积分数６％，取温度７５提０℃ ，取时间６ｎ料液比４：，条件下黄酮提取量为７４提０ｍｉ，２１此．４
ｍｇ・ｇ～．
关键词：楂叶；酮；山黄响应面分析；艺优化工
中图分类号：Ｓ０Ｔ２２文献标志码：Ａ
山楂为蔷薇科山楂属（ｒｔｅｕ．植物，ＣａａｇｓＬ）其叶片中含有的黄酮类化合物具有降压、降血脂、软化血管、加冠状动脉流量、增助消化等药理作用．随
响应面法优化山楂叶中黄酮提取工艺
周海旭，高晗，曲良苗，李忠海
（．１中南林业科技大学食品科学与工程学院，南长沙４００；湖１０１２河南科技学院食品学院，南新乡４３０）．河５０３

山楂总黄酮的提取及其抗氧化性研究

ｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｘｔｒａｃｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｈａｗｔｈｏｒｎ
ＳｔｕｄｙｏｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＡｎｔｉ．ｏｘｉｄａｎｔＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＴｏｔａｌＦｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍＨａｗｔｈｏｒｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓ￣ｌｌｏｗｓ：ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｍａｔｅｒｉａｌｔｏｌｉｑｕｉｄｗａｓ１：４４（ｇ／ｍＬ），ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｅｔｈａｎｏｌｗａｓ６０
ＧＡＯＨｏｎｇ—ｍｅｉ，ＤＩＮＧＺｈｉ —ｇａｎｇ，ＧＵＯＹｕａｎ—ｘｉｎ，ＷＵＪｉｎｇ
（ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｌｌｅｇｅ，ＡｎｈｕｉＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｅｎｙａｇｎｇ２３３１００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｍｉｃｒｏｗａｖｅ—ａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｈａｗｔｈｏｒｎｔｏｔａｌｌｆａ —

长白山野生山楂叶中黄酮类化合物提取工艺研究

ｌ材料与方法
１１材料．
滤，渣重复提取１次，并提取液，入６的乙醇定容滤合加０至１０，吸光度。结果表明，度在６ ℃ 时提取率随浸０ｍｌ测温Ｏ提剂浓度递增，醇浓度超过６提取率下降。因此，择乙０选
—－— —
４４・— ４－ —
过１０提取率下降。因此，取剂用选择１０。２ｍｌ提２ｍｌ．（积分数）醇，解并定容至５ｍｌ准确量取上述溶液２２各种提取因素对总黄酮提取率的影响体乙溶０，在单因素试验的基础上，择提取温度（、醇浓度选Ａ）乙００、．ｍｌ２０、．ｍｌ４０、．ｍｌ６０，入５．ｍｌ１０、．ｍｌ３０、．ｍｌ５０、．ｍｌ加准确称取１０干燥至恒重的芦丁００４ｇ加入６２℃ ．１６，ＯＢ、Ｃ为以亚硝酸钠溶液０３，匀，置６分钟后加入１％硝酸铝（）浸提剂量（）考察因素，总黄酮提取率为考察指．ｍｌ摇放０标，用（３进行正交实验。极差分析结果表明，响总黄选３）影溶液０７ｍ１摇匀，置６分钟后加入４氢氧化钠溶液４．５，放。０，３％乙醇定容，匀，置１ｍｌ用Ｏ摇放Ｏ分钟。用紫外可见分光光度计在５０ｍ处测吸光度Ａ。线性回归方程为：（，／１ｎｙｔｇｍ１一５６２３）４．９Ａ＋１６９７其中Ｙ为芦丁含量，为吸光．８９，Ａ度，＝０９９。ｒ．９８

从山楂叶中提取总黄酮

碱提法提取流程原料一加10倍原料重的水一加热至沸一加饱和石灰水调p H值至8～9一加热维持沸腾30 min一过滤(滤渣重新提取2 次)一合并3次滤液一减压浓缩至一定体积一加HCl调p H值至5～6 一加多倍量浓醇(除去蛋白质、多糖等杂质)一过滤(弃去滤渣)一滤液(总黄酮粗提液)一过聚酰胺柱(分别用水和95％甲醇洗脱)一醇洗脱液一减压蒸馏(回收醇)一干浸膏(总黄酮物) 碱提法提取黄酮类化合物在实际生产中应用较广泛，具有经济、安全、方便等优点。但用碱提法时，应当注意所用碱液浓度不宜过高，以免在强碱性下，尤其加热时破坏黄酮母核；在加酸酸化时，酸性不宜调至太强，以免生成盐致析出的黄酮类化合物重新溶解，降低收率。
PA RT.
山楂叶的药理作用
山楂叶具有消食化积，活血散瘀的作用。可降低血压和胆固醇以及血脂。它还可以去油脂，促进胃肠消化的作用。另外它能提高人体免疫力，增强体质，常喝山楂叶茶会有一定的防衰老、美容、防癌功效。
降血脂现代研究证明,山楂不同提取部分对不同动物造成的各种高脂模型均有较肯定的降脂作用。山楂及山楂黄酮提取物能明显的降低实验性高脂血症的家兔和乳幼大鼠的血脂,并对实验性动脉粥样硬化有治疗作用。用菊花、双花、山楂5∶5∶4配方代茶饮治疗血流变学异常的高脂性高血压病人、动脉硬化症患者,总有效率达95%。
抗疲劳作用 :山楂多糖能增加小鼠负重游泳时间 ,增强小鼠缺氧耐力 ,降低小鼠血清尿素氮、血乳酸量 ,提高肝糖原的量 ,具有显著抗疲劳作用。对尿液影响 : 张璐等研究表明 ,山楂总黄酮经腹腔注射 ,对尿液的生成有抑制作用。因药量、给药途径、提取方式的不同 ,也有报道其有泻下、增加尿液的作用。止痛和止血作用 :山楂用于瘀阻肿痛 ,可入血分 ,能通行气血 ,化瘀散结而止痛。可治月经不调、痛经 ,如生山楂冲红糖水热服可治妇女月经过期不来。山楂内金散可用于血滞月经量少 ,气滞瘀经闭腹痛。山楂肉桂红糖汤可温肾阳 ,通经脉 ,温血行痹 ,祛寒止痛。其方剂简单 ,疗效良好。药理研究证明 ,山楂有收缩子宫的作用 ,可排出宫腔内血块 ,促进子宫复原 ,而奏止痛止血之效。其与活血化瘀药配伍 ,可治产后恶露不尽 ,少腹疼痛者 ,疗效甚佳。

微波提取山楂中黄酮类化合物的工艺优化

微波提取山楂中黄酮类化合物的工艺优化施昶;黄海飞;李梦园;沈诗偲;韩伟【期刊名称】《生物加工过程》【年(卷),期】2017(15)1【摘要】The microwave extraction was applied to extract flavonoids from hawthorn leaves, selecting flavonoid yield as indicator.Extractiontime,ethanal volume fraction,radiation time,and liquid⁃solid ratio for single factor experiment were selected.Influencing factors of the extraction yieldof total flavonoids were chosen using the Design⁃Expert 8�0�5b for response surface analysis test. The optimum extracting parameters were as follows:microwave ethanol volume fraction 56%,liquid⁃solid ratio 51mL/g,radiation time 3�7 min. Under this condition, the yield of flavonoids from hawthorn leaves was 8�923%.%以总黄酮得率为指标，采用微波法辅助提取山楂叶中的总黄酮，选取浸提时间、乙醇体积分数、微波辐射时间、液固比等参数进行单因素试验，选择影响较大的因素，利用Design Expert 8�0�5b进行响应面分析，得到优化的提取工艺条件：乙醇体积分数56％，液固比51 mL／g，微波辐射时间3�7 min，在此条件下，山楂叶中总黄酮得率为8�923％。

山楂中总黄酮的提取分离研究

附作用，它物化性质稳定耐酸碱，耐氧化，耐溶剂，耐热。能多次吸附反复再生使用。２－３大孔吸附树脂分离提取总黄酮ＩＩ将各种提取法所得山楂浸膏分别加入适量蒸馏水，使得所有溶液大致都为２００ｍｌ，搅匀，分别加人ｌｇＣａＣ１，静止过夜。次日离心，离心时分批次加入离心，每一种提取法一批，加入５０ｍｌ瓶以３０００ｒ／ａｒｉｎ的速度离心分离５ａｒｉｎ，离心后出现明显分层，分别收集
２．１．２乙醇回流提取。１３１取山楂细粉３０ｇ，以６０％乙醇２００ｍｌ回流提取１．５ｈ，温度控制在６５度左右，提取后用抽滤机抽滤，分离渣液，将滤渣加入６０％乙醇２００ｍｌ继续回流提取１．５ｈ，温度控制在６５度左右提取后用抽滤机抽滤，分离渣液，合并两次提取液，回收乙醇，得山楂浸膏。２．１．３超声提取。ＨＪ取山楂细粉３０克，６０％乙醇２５０ｍｌ加入锥形瓶超声４５ｍｉｎ提取，温度控制在４５度左右，提取后用抽滤机抽滤，
关键词：山楂；黄酮；吸附树脂；提取１仪器与试药
ｌ＿１仪器ＳＫ５２００ＬＨＣ型超声波仪（上海科导超声仪器有限公司）；ＳＹ一８０００高效液相色谱仪（北分瑞利集团）；ＹＰ６０１Ｎ电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；ＴＤＬ一４０Ｂ型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；ＳＨＺ — ＩＩＩ型循环水真空泵（上海亚荣生化厂）；ＲＥ一２０００旋转蒸发仪（上海亚荣生化厂）；２０２ — ２一Ｓ型电热恒温干燥箱（上海

响应面分析法优化南方红豆杉总黄酮超声提取工艺研究

常综合征３６例［Ｊ］．中医杂志，２０１１，５２（３）：２４１－２４２．［９］国家药典委员会．中国药典（二部）［Ｍ］．北京：化学工业
出版社，２００５：附录７６．
［１２］周文富，何清松．不可逆相转移法合成茶多酚砷配合物及光谱研究［Ｊ］．精细化工，２００８，２５（４）：３４７ — ３５０．［１３］ＩｒｉｓＫｏｃｈ，ＳｔｅｖｅｎＳｙｌｖｅｓｔｅｒ，ＶｉｖｉａｎＷＭ，ｅｔａ１．ＬａｉＢｉｏａｃ —
・
工艺研究・
响应面分析法优化南方红豆杉总黄酮超声提取工艺研究
倪亚杰，李石清，徐
（浙江中医药大学，浙江摘要：目的
磊，张春椿
杭州３１００５３）
优化南方红豆杉Ｔａｘｕｓｍａｉｒｅｉ（ＬｅｍｅｅｅｔＬｅｖ１．）ｓ．Ｙ．ＨｕｅｘＬｉｕ枝叶中总黄酮的超声提
１２（４）：４７８ — ４７９．
［１１］汤毅珊，王宁生．雄黄中砷及其代谢物在大鼠体内的排
泄动力学研究［Ｊ］．中药药理与临床，２００９，２５（３）：３９ —
４２．
［８］刘锋，郭小青，胡晓梅，等．益髓青黄散治疗骨髓增生异
取工艺。方法

超声波法提取山楂叶中总黄酮条件研究论文.

本科生毕业设计（论文）题目：超声波法提取山楂叶中总黄酮的条件研究学生姓名：李友鹏刘浩刘高鹏学号：院系：化学工程学院专业年级：2011级应用化学3班指导教师：2015年6月12日摘要总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。

山楂叶的化学成份复杂，从山楂叶中分离出的最多的功效组分是黄酮类物质。

利用超声波法，以芦丁为参照品，硝酸铝作显色剂，在510nm波长以分光光度法测定总黄酮含量。

结果测得工作曲线的回归方程为A=0.0091C+0.0023，r=0.9980，a=0.0023，b=0.0091。

线性相关系数R=0.9980。

采用单因素考察法对不同提取溶媒、乙醇浓度、温度、时间、料液比进行总黄酮含量的测定，得出较佳的实验条件为：乙醇的体积分数为70%，料液比1:20、超声温度50℃，超声时间60min，此时得到的黄酮质量为137.555mg。

通过四因素三水平的正交实验，得出影响总黄酮提取率的主要因素为乙醇浓度＞超声温度＞料液比＞超声时间。

关键词：山楂叶；黄酮类化合物；超声波法；分光光度法ABSTRACTRefers to the total flavones, it is a kinds of natural products, widely exist in the plant kingdom, is many effective components of Chinese herbal medicine.Hawthorn complex chemical composition, isolated from hawthorn leaves most of the efficacy ingredient is flavonoids.This experiment using ultrasonic method，use Rutin as reference，Aluminum nitrate as chromogenic agent。

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