ELISA实验常见问题
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
实验步骤1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品1 0µl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（O D值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/mL上清液（pg / mL），并表示为平均值±SEM。
常见问题一、白板现象：显色结束后，酶标板所有孔均无颜色，阳性对照不显色。
ELISA试验中常出现的问题及解决方法
ELISA试验中常出现的问题及解决方法作者：吴召坤，巩雪英，刘粉红来源：《兽医导刊》 2016年第8期吴召坤巩雪英刘粉红/陕西省丹凤县畜牧兽医中心ELISA试验，即酶联免疫吸附试验，具有敏感性高的特点，兽医实验实常用ELISA试验检测样品的抗原或抗体，ELISA试验中很多因素都会影响试验的结果，试验中常出现的有显色淡，灵敏度偏低、样品重复试验差异大、假阳性和假阴性等。
这些都会使我们对样品的真实结果做出误判，现就ELISA试验中非正常检测结果产生的原因进行分析，寻讨其解决的办法，以提高检测的准确性。
一、显色淡，灵敏度低1.查看试剂盒是否在有效期内，是否按照保存温度保存。
试剂盒过期或保存温度过高（正常保存温度2℃～8℃）都会影响显色。
2.试剂盒从2℃～8℃冰箱取出后在室温平衡至少20～30min。
3.温育时间不足或培养箱温度不足37℃，在ELISA试验中一定要注意温育时间和温度的重要性，在温育的过程中尽量不要打开温箱，僻免温度忽上忽下。
温育时间不足，温度过低都会影响显色。
4.严格按照试剂说明书要求的洗涤方法洗涤，洗涤时加洗涤液不能冲击过大，浸泡时间过长，要按照说明书上要求的洗涤次数洗涤。
5.加样不足，加样时要按照加样量调整好移液器的刻度，使用配套，内壁光滑清洁的吸头，吸头不能交叉使用，同时要对移液器进行校准，僻免加样不足使显色不足。
6.配制洗涤液的水要用纯水机过滤的水，水质应清洁无异常，不能用酸性过大或碱性过大的水，最好用新鲜合格的蒸馏水。
二、样品重复试验差异较大在检测过程中有时同一样品两次检测结果不一样，差异较大，这种情况可能存在以下几种原因。
1.两次检测样品数量可能不同，加样时间长短不一，反应时间长短不一，所以重复检测某一样品时，尽量与第一次加样时间一致。
2.加样量不一致，样品稀释倍数要准确，充分混匀，两次加样要使用同一个移液器。
3.温育时间和温度不一致，洗涤及操作人员不一致。
重复检测样品，操作条件，人员等检测过程应与上次保持一致。
ELISA实验操作中常见问题分析
ELISA实验操作中常见问题分析严峻溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时刻快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中能够形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不完全、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。
2、试剂的阻碍a.分子量大。
合成肽采纳化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
d.纯化难度大。
基因工程抗原的纯化技术难度较大。
合成多肽抗原是按照蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。
合成肽抗原有以下特点：a.分子量太小；b.一样只含有一个抗原决定簇；c.纯度高；d.稳固性差。
国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏锐性分别为89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。
有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳固比较差。
使用质劣的试剂必定导致结果的假阳性或假阴性。
因此。
选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。
•选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳固性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的要紧依据。
•要注意试剂的批号和出厂日期，尽管试剂的有效期多为1年。
最好选择刚出厂的试剂使用。
不同厂家的试剂不能混用。
不同方法学的检测试剂，会使两对半结果显现一些不同。
例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。
【VIP专享】ELISA实验操作中常见问题分析
由于ELISA(酶联免疫试验)具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。
虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。
如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。
尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。
现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。
1 标本及采集、贮运因素严重溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。
血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。
一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。
超过一周测定的需－20℃保存。
冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。
elisa常见实验方法
elisa常见实验方法摘要：1.ELISA实验原理简介2.ELISA实验步骤概述3.常见ELISA实验方法分类4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景5.提高ELISA实验效果的方法6.ELISA实验中常见问题及解决策略正文：ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于生物医学领域，用于检测蛋白质、抗原和抗体等生物分子的方法。
ELISA实验通过特异性抗体与待检测物结合，再通过酶标记的二抗检测结合物，从而实现对目标分子的定量分析。
以下是ELISA常见实验方法的详细介绍。
1.ELISA实验原理简介ELISA实验基于抗原抗体反应原理，将抗原或抗体固定在固相载体上，待检测样品中的目标分子与固定在载体上的抗体结合，再加入酶标记的二抗，与结合在载体上的抗原或抗体发生反应。
最后，通过底物显色反应，根据颜色的深浅判断待测物含量。
2.ELISA实验步骤概述ELISA实验一般分为以下四个步骤：（1）抗原或抗体固定：将抗原或抗体吸附在固相载体（如酶标板）上；（2）样品处理：对待测样品进行适当处理，使其与实验体系相适应；（3）加样：将处理后的样品和酶标记的二抗加入酶标板，incubate；（4）底物显色：加入底物，酶标记的二抗与抗原或抗体结合后，底物被酶催化显色；（5）读数：用酶标仪测定显色程度，换算成待测物浓度。
3.常见ELISA实验方法分类根据实验过程中抗原抗体结合的方式，ELISA实验可分为以下几类：（1）双抗原夹心法：待测物为抗原，实验中使用两种针对抗原不同表位的抗体；（2）竞争法：待测物为抗体，与固定抗原竞争结合酶标抗体；（3）间接法：待测物为抗体，通过酶标记的二抗检测；（4）免疫共沉淀法：利用抗原抗体结合后形成的免疫复合物与底物结合。
4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景（1）双抗原夹心法：优点为特异性高、灵敏度高，适用于抗原含量较低的检测；缺点为操作复杂，易出现交叉反应。
（2）竞争法：优点为操作简便，适用于抗体含量较低的检测；缺点为特异性相对较低，易受其他物质干扰。
浅析ELISA中的常见问题
浅析ELISA中的常见问题ELISA是蛋白定量的金标准，也是免疫学研究中最常用的实验方法之一。
很多人觉得ELISA很简单，其实不然。
ELISA中出现的各种问题，正是很多人对其认识不足而产生的。
今天跟大家分析一下ELISA 实验中的常见问题，希望对大家有所帮助。
一、标曲不显色或显色很弱，样本显色溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。
标准品溶解时，需要涡旋震荡，以保证充分溶解。
在做倍比稀释时，也要涡旋震荡以保证充分混匀。
单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。
二、标曲和样本均不显色在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。
推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。
对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。
三、标曲显色，样本不显色遇到这种情况，很多人觉得是试剂盒问题，这其实是一个误区。
任何一种实验方法，都有其局限性，当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。
目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。
如采用信号增强剂的高敏ELISA、ECL为底物的化学发光ELISA、采用荧光法检测的ELISA、结合PCR扩增的免疫PCR等等。
对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。
因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，甚至低于标准品浓度最低的S7点，虽然可以计算得到数值，但实际上这个数值的可信度已经降低了。
而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。
需要指出的是，国内某些所谓的高敏ELISA试剂盒，并没有采用信号增强剂的方法，而只是简单地提高了抗体浓度，较普通ELISA其灵敏度的提升有限。
ELISA常见问题及处理方法4页
ELISA常见问题及处理方法一、概述ELISA试验以灵敏度较高,特异性较好的特点在临床上、兽药残留检测得到了广泛的应用,但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大,如不注意,有可能导致实验失败。
二、样本的处理步骤：采样与样品的制备（样品预处理）提取净化浓缩检测三、样品制备（1）样本采集来后应应注意：1.遵循代表性原则2.除去不可食部分3.防止处理样本时被污染3.如需制成同一样本，应将其混匀后再分次匀将4.匀将后分袋分装(一般用2号自封袋,每袋约30g)5.样品储存在–20℃6.不使用有异味或坏了的样本.四、药物提取用溶剂将待测样品中兽药溶解、分离出来的操作步骤。
根据样本和待测兽药种类，用不同溶剂和方法进行提取。
✶原理：相似相溶。
选择与待测兽药极性相似的溶剂，提取剂沸点应45～80℃，且不能与样本发生作用，毒性低，价格便宜，必须能溶解待测兽药。
对含水量高的样本，一般选与水相混溶的溶剂（乙腈、丙酮等），要求溶剂对样本有较强的渗透能力，以便能将样本中兽药充分提取。
当单一溶剂效果不理想，可选择2种或2种以上不同极性的溶剂，以不同比例配成混合提取剂。
四、提取方法✶①振荡法：将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使容器内的样品与提取溶剂充分接触，以深入到样本组织内部提取待测组分✶振荡方式：✶振荡器上进行上下、往返式振荡。
手摇式上下振荡✶注：1、在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。
②均质法：用均质机对加提取剂的样本快速均质。
特点是快速、简便。
③超声法：样本加入提取剂，以超声波提取。
④索氏提取：提取效果好，但时间长，干扰物多。
多用于动物样本。
⑤快速混匀法：适用于液体样品。
五、净化将样本中待测兽药与干扰杂质分离的步骤。
原则是尽量完全除掉干扰杂质，而又使待测兽药损失尽量少。
但经过提取的待测组分，提取物中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似的杂质，这就导致我们在检测过程中出现假阳性。
ELISA常见问题及措施分析
样本不可使用NaN3。 如有怀疑，可复检。
目测结果正 常，但酶标 仪读值偏低
读取吸光值时使用了错误的 滤光片
TMB为底物时应在450nm波长读取 吸光值，并以650nm作为校正波 长。
标 准 曲 线 不 佳 /重 复 性 不 好
结果描述
可 能的 原 因
建议或预防措施
严格按照说明书标准品配制进行
标准品配制有误
终止后，整
除去残余的缓冲液。
板结果显现 孵育时间过长
严格按照说明书操作。
均一的黄色 或淡黄色； 或标曲有线
酶标记物污染了吸头及盛放 显色剂容器或阳性对照污染 了微孔
吸取不同的试剂时应更换吸头， 配置不同的试剂组分时，应使用 不同的储液器皿。操作时请使用 移液器。
性但背景过
高
检测抗体或Avidin-HRP的浓 检查浓度计算是否正确或进一步
加液时，过多残留于孔壁上
加液时，吸头在不碰到孔底的前 提下尽量沿着孔壁下方加液。
吸取不同的试剂时应更换吸头，
耗材重复使用
配置不同的试剂组分时，应使用
不同的储液器皿。
操作时细心，注意不要触碰底部。
微孔底部被划伤或存在污垢 擦拭酶标板底部，以去除污垢或
指纹。
阈值附近时阴时阳
同一样品做3个复孔，以2个（含 2个以上相同结果为准）。
enzyme-linked immunosorbent assay
酶联免疫吸附测定（ELISA）是指将可溶性的抗原或抗体 结合到固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反 应的定性和定量检测方法。
但在实际操作及分析中，总会出现各种问题，本次就ELISA 常见问题分析汇总，希望对科研菌的实验有所帮助。
加样时交叉污染
ELISA实验可能出现的问题及原因分析
ELISA实验可能出现的问题及原因分析1.应该注意试剂4°c冷藏时水化层形成，蛋白分子分布异常；2.标本由于冷藏时Ig G聚合成多聚体，Fib非特异性吸附，反复冻融机械切力致使蛋白分子受损；3.加样时不准，枪头吸样时插入样本液面下2mm为宜；4.常采用的温度有43、37°c、室温、或者4°c等。
37°c最常用，4°c效果最好，但孵育时间有异；5.要注意内源如风湿因子，补体，高浓度非特异性免疫球蛋白，异嗜性抗体及某些自身抗体等；外源如标本溶血，细菌污染，储存时间过长及凝固等因素影响。
6、在使用ELISA试剂盒时应注意：2-8℃保存（特殊情况除外）、同一品种不同批号试剂不能混用、不同品种试剂盒显色剂不能混用。
常见问题及分析1阳性对照不显色漏加阳性对照阳性对照孔忘加酶或忘加显色剂阳性对照受污染2、阳性对照显色浅（HBeAb HBcAb阴性对照显色浅）试剂和保存不当、活性下降在使用前试剂盒未放置在室温平衡温育时间不够或孵育温度过低洗板浸泡时间过长、洗板次数过多使用不正确的洗液洗液中含有防腐剂同时残留量过多洗板后酶标板被干透读数时使用波长不正确滤光片不清洁或滤光片位置错误读数时酶标板放置位置错误阳性对照活性下降酶标失活3、阴性对照显色（HBeAb、HBcAB除外）实验过程受污染阴性对照污染酶滴在孔壁上4、整板不显色试剂和保存不当、已经失活忘记加酶、可检查滴瓶内酶量忘记加抗原或中和试剂忘记加显色剂A或显色剂B5、阳性对照读数不正常加入标本后未进行必要的混匀标本稀释错误加样量不正确冷冻标本未完全溶解混匀标本中含有防腐剂6、血清本底高试剂盒灵敏度高加样时使用同一枪头、交叉污染孵育时间过长或温度过高洗板次数不足，浸泡时间短洗板时洗液量少或残留量多洗板时洗液量过多、串孔洗板机管道中有霉菌生长洗液瓶混用洗板机洗板头阻塞或洗板机洗板头位置错误配置洗液的去离子水或蒸馏水被污染终止液浓度不够，没有充分混匀，或终止液被污染读数时酶标板底部有水蒸气凝结酶标仪偏差7、假阳性结果实验器具被污染血清中出现纤维蛋白凝集血清标本中出现过多的红细胞血浆标本处理不当标本中含有灰尘、颗粒或细菌等标本被反复冻融加标本后进行不正确的振荡沿孔壁上加入标本，加样后出现过多的气泡酶标滴加在孔壁上，洗板未洗净混用洗液或洗液稀释错误洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌洗板次数不足或浸泡时间短洗板时洗液量少或残留量多洗板时洗液量过多、串孔读数时酶标板底部有水蒸气凝结洗液瓶、废液瓶混用读数过程中板孔中有气泡酶标仪偏差8、同一板内重复性差标本混匀不充分试剂混匀不充分标本与酶结合物混匀不充分加样技术差异加样器故障或加样器被污染加样时间过长导致孵育时间不同孵育器内部的温度不一致，造成酶标板孔间的孵育温度差异读数时酶标板孔间有气泡9、HCV血清本底高灵敏度高样本稀释液加液量不足100ul枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多（>10ul）同一孔加了两次样本10、HIV阳性对照低误将阳性对照稀释阳性对照未混匀加液量不足11、HIV血清本底高标准变更，灵敏度提高标本稀释液加液量不足100ul枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多（>10ul）同一孔加了两次样本。
ELISA试验操作中常见问题分析
ELISA实验操作中常见问题分析由于 ELISA(酶联免疫试验)具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。
虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。
如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。
尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。
现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。
1、标本及采集、贮运因素严重溶血，以 HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。
血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。
一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。
超过一周测定的需－20℃保存。
冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。