(环境管理)初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程1、准备工作1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。
2）采样数量：每批产品随机抽取10件样品.3）检测标准《GB 15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准》：≤100cfu/件次。
4）洗脱液、稀释液采用0.9％无菌氯化钠溶液。
2、试验步骤：1）用无菌手续取出10个样品，分别放入10支装有10ml0.9％无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打80次，混匀，分别吸取1ml放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养48±2h观察结果。
2）用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。
3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数×稀释倍数/件次。
阴性对照试验：将使用的0.9％无菌氯化钠溶液吸取1ml放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
制备2个平板均不得有菌生长。
3、注意事项：1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。
2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。
编制：审核：批准：ZC-14-8初始污染菌监测操作规程1范围适用于对刚包装好的外科手套和检查手套的初始污染菌的监测和对新购进的小包装（接触手套的小包装）的监测。
第一个月每周进行一次监测，如果监测结果是稳定的以后每个月监测一次，如果3个月都稳定，监测周期改为每季度一次。
2职责质管部负责取样、按ISO 11737进行试验、如试验结果初始污染菌超过6 cfu/cm2,要及时查找原因，提出改进措施，包括工艺中产品防护和进行环境消毒。
3 生物负载测定方法A.1 概要A.1.1 生物负载测定，可使用不同的方法内容。
负责进行测定的人员应运用原材料、部件、生产环境、生产过程和产品的特性方面的知识为每一步选择适当的方法。
A.1.2 图A.1给出了生物负载测定程序主要步骤和顺序。
建议负责人员在决定取样率、培养基范围和培养条件以及方法开发和确认水平时要根据情况而定。
样品选择试验样品的收集送人实验室处理(如果需要)TREATMENT TEBHNIQUES移人培养基培养计数和定性数据解释图1--生物负载测定程序主要步骤和顺序A.2 获取微生物所用方法A.2.1 概要A.2.1.1 本附录中所述的几种方法可以组合使用，以便增加所发现生物体的数量和降低可变性。
A.2.1.2 微生物在表面附着的程度受表面特性、微生物自身和存在的其他材料(如润滑剂)的影响。
污染源也会影响到附着程度。
为获取微生物，所进行的处理包括漂洗或直接表面取样。
表面活性剂可以用于提高回收，但应认识到，较高浓度的表面活性剂可能会抑制微生物。
A.2.1.3 在相当一部分材料中，有些微生物可能以生物膜的形式出现，在生物膜的结构中，微生物在牢固附着于材料表面上的被囊状包围。
生物膜状微生物可能会表现更强的抗灭菌性。
生物膜可以在数分钟年形成，而且可能在与组织附和或已经使用过的医疗器械上生长出大得多的生物膜。
在这种情况下，就应考虑生物膜形成的可能性，而且也不应认为A.2.2中列出的处理方法能完全将微生物从生物膜中释放出来。
在对获取技术进行确认时，如果在重复回收过程中重复记录到较高的微生物数，则表明有生物膜出现。
A.2.1.4 在生物负载估计中所用的任何处理都应具有重现性，并应避免会明显影响微生物活性的条件，如过分空化、剪切力、温度升高或渗透震动。
A.2.1.5 有些处理方法要比其他一些方法易于控制。
在选择方法和设计适宜的变量组合时，建议考虑方法中的变量和控制这些变量的途径。
例如，对一给定的方法，可以通过延长时间或调整机械搅动的特性来增加微生物的回收。
A.2.1.6 有些处理方法可能会分解待测产品(例如碎解、袋蠕动和涡旋)。
分解的材料会给微生物计数造成困难，这时则需要进行其他处理，如将分解的材料从洗提液中分离出来。
应注意保证所得到的计数具有代表性。
A.2.1.7 应尽力尽快将试验样品移至试验室。
如果必须要推迟转送，试验样品的保存条件应能避免微生物的丢失或改变。
应规定贮存的最长时间。
干燥可能是微生物数量减少的重要原因，所以在选择贮存条件和贮存时间时应加以考虑A.2.2 获取方法A.2.2.1袋蠕动A.2.2.1.1将试验样品和一已知体积的洗脱液包封于一无菌胃型袋中开动往复式搅拌，使洗脱液穿过并环绕试验样品。
A.2.2.1.2应规定处理的时间长度。
A.2.2.1.3该方法因为使用了相对大量的洗脱液，所以可能会生成微生物浓度较低的悬浮液。
如可行，洗脱液应予过滤处理。
A.2.2.2 搅动(机械或手工)A.2.2.2.1将试验样品浸于装有已知体积洗脱液的适宜器皿中，并用机械搅拌器(往复式、环绕式或手腕作用式)进行搅动。
也可使用手工搅动，但其效力会因操作人员而异。
A.2.2.2.2应规定搅动的时间和频率。
A.2.2.2.3可以加人一定大小的玻璃珠来增加表面磨损以提高回收效率玻璃珠的大小以及搅动频率和时间不应导致过热和/或对微生物造成破坏。
注：加人玻璃珠会增加微生物可附着的表面积。
A.2.2.4 冲洗A.2.2.4.1让洗脱液通过试验样品的内腔。
可以靠重力或泵来使液体流动。
另外还可将洗脱液充人产品中，夹住并抖动。
A.2.2.4.2应规定器械与洗提液的接触时间、冲洗速度和液体体积。
A.2.2.4.3 设备结构和内腔大小可能限制从表面彻底取下生物体所需的力的大小。
A.2.2.5搅切(碎解)A.2.2.5.1将试验样品浸于装有已知体积洗提液的适宜容器中。
在规定的时间内进行搅切。
A.2.2.5.2搅切时间取决于试验样品和搅切器，但不宜过热，以免会引起洗脱液过热和对微生物造成破坏。
A.2.2.5.3该方法能将试验样品分割成足够小，以便能用适当的方法对微生物计数。
A.2.2.6擦拭A.2.2.6.1 含有可吸收取样材料的棉拭子通常被固定于杆或把手上。
样品材料可以是也可以不是可溶性的。
A.2.2.7.2 通常的使用方法是用缓冲液或液体培养基湿润棉拭，用棉拭擦拭界定好的取样表面。
在有些情况下，可以先湿润样品表面，然后用干棉拭擦拭，这样可以提高回收效率。
随后将棉拭放至缓冲溶液或液体培养基中，并搅动以从棉拭上取下微生物。
另外，有时也可用可溶性棉拭，使棉拭溶解于缓冲液。
A.2.2.6.3拭擦是从不规则形状产品或相对难以接近的区域取样的有效方法，该方法对取样面积必须大时也有效。
A.2.2.7.4但该方法因擦拭方式的不同而更易出错。
而且，通过擦拭不太可能将样品上所有的微生物都收集到。
有些微生物可能会被棉拭本身吸附，从而不会被测到。
A.2.2.6.5棉拭中不应有微生物杀灭剂或微生物抑制剂。
A.2.3洗脱液、稀释液和转送培养基A.2.3.1在生物负载估计过程中，洗脱液可用于从产品上取下微生物;传送培养基可用于将取下的微生物移去计数;稀释液可用于获得含有可计数微生物的悬液。
A.2.3.2 洗脱液和稀释液的特性对所用方法的效率有显著影响。
在选择稀释液或洗提液时，应注意它们的成分(如组成、浓度、渗透性和pH) 这些成分不应使微生物增殖或失活。
A.2.3.3 当用液体从固体表面取下微生物时，可考虑使用表面活化剂。
A.2.3.4 常用的洗脱液和稀释液见表A.1 。
表A.1 --洗脱液的稀释液示例溶液水中的浓度应用缓冲的蛋白胨水溶液Auffered peptone water 0,067 M 磷酸phosphate0,43 %氢氧化钠sodium Bhloride0,1% 蛋白胨peptone 通用林格氏溶液Balgon Ringer 1/4强度溶解藻酸钙棉拭Dissolution of BalBium alginate swaAs蛋白胨水溶液Peptone water 0,1%--1,0% 通用磷酸盐缓冲盐水溶液Phosphate Auffered saline 0,02 M 磷酸phosphate0,9 % 氢氧化钠sodium Bhloride 通用林格氏溶液Ringer 1/4强度通用氯化钠溶液Sodium Bhloride 0,25 % -- 0,9 % 通用硫代硫酸盐林格氏溶液Thiosulphate Ringer 1/4强度中和残留氯Neutralization of residual Bhlorine水Water NA 水稀释含水样品Dilution of aqueous samples计数前制备可溶材料Preparation of isotoniB solutions ofsoluAle materials prior to Bounting注: 本表并不是全都包括的。
表面活化剂如聚山梨醉醋(吐温. 80)可以加人洗提液和稀释液中。
根据具体的应用，通常使用的浓度在0.0l% --0.1%之间。
应使用适当浓度的表面活性剂，并加以特殊处理以防止泡沫形成。
A.3 非洗提方法A.3.1接触板A.3.1.1接触板或玻璃片可用于将凝固的培养基放在样品表面上，使存活微生物能附着在培养基表面，然后再培养接触板或玻璃片，至形成可以计数的菌落。
A.3.1.2 该系统的优点在于易于使用，结果与凝固的培养基的接触表面直接相关。
A.3.1.3 表面上天然集聚的细胞群、菌落在琼脂介面散布、琼脂干燥、可能存在的厌氧菌等都是潜在的不利因素。
A.3.1.4 由于该方法的效率普遍较低，所以只有在其他方法都不适用的情况下使用接触板和玻璃片一般只适用于平的或至少是规则的表面。
A.3.2琼脂覆盖A.3.2.1 当生物负载低和在产品构型适宜时，在产品表面涂上熔化的琼脂培养基(最高温度在45B)，培养至生成可见菌落。
当生物负载低以及产品构型适宜时，适用本方法。
A.3.2.2 表面上天然集聚的细胞群、菌落在琼脂介面散布、琼脂干燥、可能存在的厌氧菌等都是潜在的不利因素。
A.3.3 连续稀释的最大可能数(MPN)法A.3.3.1 MPN法，是业已建立并且充分文件化的用于估测产品上随机分布的活性微生物数量的方法。
其主要应用为使用液体、粉体和半固体产品或原材料的食品和水工业。
MPN法特别适用于生物负载平均值低的产品。
A.3.3.2如果具有足够多的洗脱液，可将其一系列的稀释液接种于营养培养基中，使接种的培养基部分在随后的培养中不产生可见生长。
用表现出生长的稀释度，用统计学方法来估计微生物的原始数量。
目前利用统计学假设已经设计出了MPN表格，可查表直接估计出微生物的最可能数目(MPN) 。
A.3.3.3 MPN法易于操作，但是可以使用的培养条件范围则很有限，而且因该方法是基于统计学，所以它更适于一般性评价而不是精确测定。
产品初始污染菌和微粒污染控制验证方案
产品初始污染菌和微粒污染控制验证方案产品初始污染菌和微粒污染是产品质量管理过程中非常重要的一环。
产品初始污染菌是指产品在生产过程中受到外界环境的污染，例如空气中的细菌和真菌；微粒污染则是指产品中存在的微小颗粒物质，例如灰尘、纤维和金属碎屑。
为了确保产品质量和用户安全，对于这两种污染的控制需要进行验证。
一、初始污染菌的验证方案初始污染菌的验证是为了检验产品在生产过程中是否受到了外界环境的污染，以下是一个可能的验证方案：1.选择合适的验证样本：根据产品的特性，选择适当的验证样本。
比如，如果是食品类产品，可以选择食品样本进行验证。
2.收集样本：在生产过程中，从不同环节收集样本。
包括原材料、生产设备以及成品等。
3.分离和培养：使用适当的培养基将样本中的细菌和真菌分离出来，并培养出纯种。
4.定量检测：使用合适的方法对细菌和真菌进行定量检测，比如菌落数、菌群总数等。
5.数据分析：分析定量检测结果，并与相应的标准进行比较，以确定产品是否达到要求。
6.结果记录和分析：记录所有的验证结果，并进行数据分析。
如果产品未达到要求，需要进一步分析原因，并采取相应的措施进行改进。
7.验证报告编制：根据验证结果，编制相应的验证报告。
报告中应包括验证方法、样本信息、检测结果、分析和结论等内容。
二、微粒污染的验证方案微粒污染的验证是为了确保产品中不存在过多的微小颗粒物质，以下是一个可能的验证方案：1.选择合适的验证样本：根据产品的特性，选择适当的验证样本。
比如，如果是医疗器械，可以选择器械表面进行验证。
2.收集样本：在生产过程中，收集验证样本。
可以使用适当的方法，如粘取法、吸尘法等，将待验证的表面的微粒物质收集到相应的样品容器中。
3.预处理：对样品进行适当的预处理，如过滤、离心等，以获得适合检测的样品。
4.检测方法选择：选择合适的检测方法对样品中的微粒进行分析。
常用的方法有显微镜分析、粒径分析法等。
5.定量检测：使用选择的方法对样品中的微粒进行定量检测，并得到相应的数据。
初始污染菌检测
-所需供试液的用量和浸提时间需验证 处理方法：振动、冲洗、擦拭法、袋蠕
动、超声、涡旋混合、搅拌
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举例—振动
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小型医疗器械可以投 入无菌的自封袋中， 加入缓冲液充分振动。
另外，用缓冲液冲洗 内包装袋的内壁。并 与产品缓冲液相混。
A 试验组
供试液+试验菌（50~100cfu）
B 菌液组
试验菌（50~100cfu）
C 供试品对照组
D缓冲液对照组 缓冲液+试验菌（50~100cfu）
(A-C)/B>70%
D/B>70%
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菌落计数报告规则—平板法
选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落数在 30~100之间的稀释级作为报告菌落数的依据。
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薄膜过滤法
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培养
药典中的培养条件： 细菌 30-35℃ 48h 霉菌、酵母菌 23-28 ℃ 72h 必要时，可适当延长培养时间至5-7天
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菌落计数
计数方法：将平板置菌落计数器或从平板的背面直接 以肉眼用标记笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细 观察，计数。必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。
菌落特征： ⑴ 形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、
淡黄色（如果培养基中加入0.1%TTC(氯化三苯基四 氮唑试剂)，菌落为红色） ⑵ 边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起 或扁平。 ⑶ 大小差异很大。
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初始污染菌验证方案
初始污染菌验证方案、报告文件编号：起草人：质管部：日期：审核人：质管部：日期：批准人：日期：有限公司1 验证目的：为减少初始污染菌对产品的影响，更有效的控制产品质量，对一次性使用无菌溶药器、一次性使用无菌注射器带针、一次性使用输液器带针、一次性使用静脉输液针、一次性使用延长管产品的初始污染菌进行控制。
2 验证依据GB15980—1995《一次性使用医疗用品卫生标准》3 验证小组：负责验证过程的组织指导工作。
：负责验证现场人员的安排组织工作。
：负责验证过程检测工作。
4 验证方案在有效环境监控下，任意连续三批取产品进行初始污染菌检测5 验证方法使用仪器设备：压力蒸汽灭菌器、超净工作台、天平、HH.B11.360型电热恒温培养箱，202—A0型台式干燥箱（以上设备经上海市计量测试技术研究院检定合格）以及试管、培养皿Φ9cm、刻度吸管、有盖广口瓶、玻璃注射器、营养琼脂（均经无菌处理）。
操作步骤：制备检验液，取产品剪碎后浸泡在有100ml灭菌生理盐水的有盖广口瓶中，充分震荡后制备成1：10的检验液，用灭菌吸管吸取2ml，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml，另取1ml 注入到9ml灭菌生理盐水试管中，更换1支吸管，并充分混匀，使成1：100稀释液。
吸取2ml，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml，另取1ml注入到9ml灭菌生理盐水试管中，更换1支吸管，并充分混匀，使成1：1000稀释液.将溶化并冷至45℃—50℃的营养琼脂培养基傾注于平皿内，每皿约15ml，另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照。
随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后翻转平皿，置30℃—35℃培养箱内培养48小时。
6 验证确认：通过3批对产品的初始污染菌检测，确认每批产品初始污染菌在有效的环境监控下是能达到要求的。
7 方案会签表1.验证目的：为减少初始污染菌对产品的影响，更有效的控制产品质量，对一次性使用无菌溶药器、一次性使用无菌注射器带针、一次性使用输液器带针、一次性使用静脉输液针、一次性延长管5个产品的初始污染菌进行控制。
医疗器械的无菌和初始污染菌检验
器械的无菌和初始污染菌检验
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培养基适用性检验
血琼脂平板上金黄色葡萄球菌 （大金黄色菌落）
在划线过程中，细胞逐步分散，培养后可形成单个菌落。
器械的无菌和初始污染菌检验
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培养基适用性检验
定时移植法:亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜斜 面培养基上，最适条件下培养，完成培养于(4～6)℃进行保 留并间隔一定时间进行移植培养一个短期菌种保藏方法。
细胞核及核膜、核仁，直径普通为1μm ~ 10μm。
器械的无菌和初始污染菌检验
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真菌：为多细胞或单细胞微生物，其细胞分化完善， 有细胞核和各种细胞器，故易在体外生长繁殖，直径普
通为10μm ~ 100μm。
器械的无菌和初始污染菌检验
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医疗器械无菌检验所需设备
超净工作台
器械的无菌和初始污染菌检验
医疗器械的无菌和初始污染菌检验
医疗器械无菌检验技术
器械的无菌和初始污染菌检验
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什么是无菌检验法？
用于检验要求无菌医疗器械是否无菌一个方法。 若供试品符合无菌检验法要求，仅表明了供试品在 该检验条件下未发觉微生物污染。
无菌试验目标：将医疗器械或其浸提液接种于培 养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染。
无菌检验人员必须具备微生物专业知识，并经过 无菌技术培训。还应该含有高度责任心和严谨细 致工作作风。
器械的无菌和初始污染菌检验
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无菌检验法 环境要求
器械的无菌和初始污染菌检验
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无菌检验法 环境要求
隔离系统
器械的无菌和初始污染菌检验
初始污染菌方法验证
初始污染菌方法验证公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]1.目的验证产品初始污染菌数的试验方法。
2.范围适用于质量部门对产品初始污染菌数验证试验的检测。
3.职责质量检验人员负责执行此规程。
4.依据标准及相关文件2010 版《中华人民共和国药典第二部》附录Ⅺ J 微生物限度检查法GB/《医疗器械的灭菌-微生物学方法-第一部分产品中微生物数量的估计》GB15980-2009 《一次性使用医疗用品卫生标准》5.试验产品6.注意事项本操作应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的无菌操作台内进行。
操作过程应尽量避免任何可能使结果发生偏差的污染。
无菌操作台必需定期进行洁净度检测??试验前提前开紫外灯15min 后方可进行实验操作。
过滤器、滤膜、镊子以及无菌设备杯使用前应进行灭菌??使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。
7.器材与试剂器材35℃恒温培养箱、23℃恒温培养箱、灭菌器、洁净工作台、无菌过滤装置、镊子、剪子、电子天平、移液器、接种环稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后按说明书要求进行灭菌。
pH 无菌氯化钠溶液—蛋白胨缓冲液%无菌氯化钠溶液。
培养基营养琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
玫瑰红钠琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
改良马丁液体培养基：按说明书方法保存配制。
改良马丁琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
营养肉汤培养基：按说明书方法保存配制。
8.计数方法的验证试验当建立产品初始污染菌数检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：以确认所采用的方法适合于该产品细菌、霉菌及酵母菌的测定。
若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。
对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为0代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
赵月琳初始污染检测
初始污染菌检测
菌落计数
细菌计数结果及报告方法
两稀释 度菌数 之比 菌落总数 个/g或个/ml 报告方式 个/g或个/ml
不同稀释度的平均菌落数 例次 10-1 10-2 10-3
1 2 3
4 5 6
1365 2760 2890
不可计 27 不可计
164 295 271
4650 11 305
20 46 60
11
梯度稀释 倒臵35 ℃±2℃ 恒温恒湿培养48h
加 样
培 养
初始污染菌检测
梯度稀释
1ml 1ml 1ml
1:10
供试液 9mlNacl 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
1:100
9mlNacl 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
1:1000
9mlNacl
1ml
1ml
1ml 1ml
初始污染菌检测
1
初始污染菌检测
一．检验依据 二．环境要求 三．试验器具 四．初始菌检测目的 五．初始污染菌检测步骤 六．结果判断
2
初始污染菌检测
检验依据 GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准 GB 15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准
引用标准： • GB7918.2 化妆品微生物标准检验方法 细菌总数测定 • 2010年版《中国药典》无菌检查法 • YY 0033-2000 无菌医疗器具生产管理规范
• 当菌落数在100以内，按实有数报告，大于 100时采用二位有效数字。
• 如果样品菌落总数超过本标准的规定，应 将留存的复检样品依前法复测2次， 2次结 果平均值都达到本标准的规定，则判定被 检样品合格；其中有任何一次结果平均值 超过本标准的规定，则判定被检样品不合 格。
产品初始污染菌检测操作规程
产品初始污染菌检测操作规程编号：版本：编制：日期：审定：日期：批准：日期：生效日期：管理部门：发放部门：生产部 质管部 工程部 研发部 PMC 采购部 仓库 营销中心 人事行政中心 财务部一、目的规范产品初始污染菌数检验标准操作。
二、适用范围适用于产品初始污染菌检验。
三、职责微生物实验员对此规程负责。
四、参考资料1. 参考2020版《中国药典》四部非无菌微生物限度检查法；2. GB/T 19973.1-2015《医疗器械灭菌-微生物学方法-第一部分：产品中微生物数量的估计》；3. GB15979-2002 《一次性使用医疗用品卫生标准》五、内容1.设备与材料：薄膜过滤器、恒温培养箱、霉菌培养箱、培养皿、锥形瓶、蓝盖瓶、量筒、烧杯、镊子、剪子、橡皮塞、纱布、灭菌棉球、酒精灯，超净工作台，高压灭菌锅，电子称，0.45um滤膜等、无菌取样袋、无菌手套。
2.稀释液及培养基0.9%无菌氯化钠溶液、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙式葡萄糖琼脂培养基3.取样规则a、PMC配合质管部每月月初计划多生产6套产品；b、等生产完成后取样员戴无菌手套，将随批量同等条件生产的6套产品装进无菌自封袋后将封条密封；c、做好记录d、送至实验室e、暂时处：冷藏箱规定样品暂存区，存放时间最迟两个小时。
4.检验方法4.1 取8个灭菌平皿分别倒入胰酪大豆胨琼脂和沙氏葡萄糖琼脂培养基15—20ml 晾干。
4.2 将每批送至实验室的产品样品，分为编号：1、2、3、4、5、6，再将每个编号的样品分别投入灭菌后的均质袋中，再倒入灭菌生理盐水浸没整个样品，生理盐水的位置应能完全浸没整套样品，根据样品体积的大小适量倒入灭菌生理盐水，充分混匀，使微生物尽可能洗脱后将无菌镊子把样品取出，剩下样液待过滤集菌。
4.3 检测一般细菌，将编号1、2、3混匀后的样液倒入滤杯中，开启滤器过滤后将滤膜取出，正面贴于胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）平皿中，同时做阴性对照，检测一般需氧菌。
初始污染菌数检测
一、目的：为测试灭菌前以及内包装袋的初始污染菌是否符合标准。
二、适用范围：本厂产品以及包装袋.三、引用标准：GB15980-1995四、所用的仪器和设备1、高压消毒锅：使用时严格按照仪器说明书操作。
2、恒温培养箱:必须定期对培养箱的温度计进行检定.3、培养皿：一般采用90mm×15mm的硼酸玻璃培养皿。
4、生理盐水：浓度为0。
9%5、灭菌规格板：5×5cm；玻璃试管：13×150mm6、培养基:普通肉汤琼脂培养基,其配制方法见试剂说明书五、、操作步骤1、对敷料类可用无菌手续取10g，放入100mL灭菌生理盐水中，充分震荡80次后。
取各管洗液进行检测。
2、对导管类：选取三套新制备的样品，在净化操作台上，将每套样品用无菌的剪刀剪成大约1厘米长的段，放入事先灭菌的具塞三角瓶中，加50毫升生理盐水，加塞,充分震荡，使样品的内壁、外壁得到充分的洗脱,然后将冲洗液转移到另一个无菌的具塞三角瓶中,立即盖好备用.将每一样本洗液充分均匀后,接种2个平皿,每个平皿加入1ml洗液.当估计含菌量过高时（每个平板生长菌落数超过300个），应对洗液进行稀释倍数再接种，一般需2-3个不同稀释度，每吸取一个稀释度洗液，更换一支无菌吸管.3、将凉至45℃普通琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿约15-20ml培养基。
4、将培养基与样液小心摇匀，待琼脂凝固后倒置平皿,置37℃培养箱内培养48h,计算最终结果菌落数。
六、采样数量：各类产品每批随机抽取10件样品。
七、结果计算计算公式为:菌数/每件次（或g）= 平均菌数×稀释倍数———--————--——-——-—---（C2）件次或重量（g）初始菌试验报告检品名称生产批号检验日期检验人复核人一、细菌数测定（37±1℃，3天）初始菌试验报告检品名称生产批号检验日期检验人复核人一、霉菌数测定(27±1℃，3天）。
初始污染菌方法验证
初始污染菌方法验证1.目的验证产品初始污染菌数的试验方法。
2.范围适用于质量部门对产品初始污染菌数验证试验的检测。
3.职责质量检验人员负责执行此规程。
4.依据标准及相关文件2010版《中华人民共和国药典（二部）》附录Ⅺ J微生物限度检查法GB/T19973.1-2005《医疗器械的灭菌-微生物学方法-第一部分：产品中微生物数量的估计》GB15980-2009 《一次性使用医疗用品卫生标准》5.试验产品————6.注意事项6.1 本操作应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的无菌操作台内进行。
操作过程应尽量避免任何可能使结果发生偏差的污染。
6.2 无菌操作台必需定期进行洁净度检测，试验前提前开紫外灯15min后方可进行实验操作。
6.3 过滤器、滤膜、镊子以及无菌设备杯使用前应进行灭菌，使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。
7.器材与试剂7.1器材（1）35℃恒温培养箱（2）23℃恒温培养箱（3）灭菌器（4）洁净工作台（5）无菌过滤装置（6）无菌镊子（7）无菌剪子（8）电子天平（9）移液器（10）接种环7.2稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后按说明书要求进行灭菌。
（1）pH 7.0无菌氯化钠溶液—蛋白胨缓冲液（2）0.9％无菌氯化钠溶液。
7.3培养基（1）营养琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
（2）玫瑰红钠琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
（3）改良马丁液体培养基：按说明书方法保存配制。
（4）改良马丁琼脂培养基：按说明书方法保存配制。
（5）营养肉汤培养基：按说明书方法保存配制。
8.计数方法的验证试验当建立产品初始污染菌数检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品细菌、霉菌及酵母菌的测定。
若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。
对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
初始污染菌试验操作指导书教学内容
初始污染菌试验操作指导书初始污染菌、车间工作台面及工作服表面细菌总数、生产工人手细菌总数试验操作指导书文件编号: XX/JG-002版本：A修改状态：0受控状态：发布日期：实施日期：编写: 校对: 核准:1. 引用标准：GB15980-1995，GB7918.2，2010版药典2. 技术指标：一次性使用引流袋，一次性使用透析护理包等非管道类、敷料：≤100cfu/g；一次性使用静脉留置针，一次性使用内瘘针，血液净化装置的体外循环血路等管道类：内腔≤10cfu/件次，外部≤100cfu/件次；车间工作台面（尤其是关键操作点）及工作服表面细菌总数≤10cfu/cm2，生产工人手细菌总数≤300cfu/每只手。
3. 检测环境要求：环境洁净度10000级下的局部洁净度100级单向流空气域内进行。
4. 测试数量及频率：产品每批随机抽取10件；车间工作台面（尤其是关键操作点）及工作服表面细菌总数、生产工人手细菌总数每周检测一次。
5 试验设备：培养皿、镊子、5×5cm的灭菌规格板等采用干热灭菌205℃，4h；移液管、棉拭子、注射器等用牛皮纸包好，采用高压蒸汽灭菌，121℃，20min。
6. 试验试剂：6.1 生理盐水：NaCl:8.5g + 蒸馏水：1000mL，溶解后，去分装到试管中，锥形瓶中，每瓶90mL,121℃,20min高压灭菌；6.2 营养琼脂培养基制备：①溶化：按照说明书称取溶解培养基；②校正酸碱度：调节PH指到7.1-7.4；③灭菌：采用高压灭菌，121℃，30min。
7 试验步骤：7.1 供试液的制备：7.1.1 供试品是一次性使用引流袋，一次性使用透析护理包时，用无菌手续取样品10g，放入100mL灭菌生理盐水中，充分振荡后得到1：10的供试液；7.1.2 供试品是一次性使用静脉留置针，一次性使用内瘘针，血液净化装置的体外循环血路时，做内腔时，取10mL灭菌生理盐水，注入到产品中，得到的洗脱液即为供试液。