高免卵黄抗体提纯及提取液冻干的研究
作者简介胡晓苗（１９７１－），男，安徽望江人，在读硕士，助理研究员，从事兽医研究。收稿日期２００６!０４!１３由于高免卵黄抗体自身的一些缺陷，近年来在全国大部分地区禁止使用高免卵黄抗体。其缺陷是：①卵黄抗体往往由商品蛋所制作，带由鸡霉形体、禽白血病、鸡白痢、鸡传贫、沙门氏菌等多种病原体，这些病原体可经卵黄液的使用而垂直传播，从而引起相应的疾病。即使卵黄液中加入一定的防腐剂和抗生素，但对病毒无效［１，２］。另外，蛋黄中含有大量分子量很大的卵黄磷蛋白及脂肪等物质，注入肌肉难以吸收而造成局部肿胀、坏死、过敏反应［２］。②常规卵黄抗体经稀释分装而成，体积大，运输不便。另外，需低温保存和运输，由于反复冻融和运输不当而造成效价降低。因此，笔者进行了卵黄体抗体的提纯和提纯液的冻干研究，旨在克服卵黄抗体的缺陷。１卵黄抗体的提纯１．１材料与方法１．１．１材料。聚乙二醇（ＰＥＧ６０００，进口分装，购自合肥大药房）；高免鸡蛋（测其效价为１∶１２８）；法氏囊标准抗原及阳性血清（购自哈兽研）；琼脂糖粉（浙江某生物化工厂）。１．１．２方法。（１）提纯用高免卵黄液的制备。将收集的高免蛋浸泡消毒，无菌分离蛋黄，经无菌搅碎机搅拌５ｍｉｎ，按１∶１加入无菌生理盐水，用双层无菌纱布过滤，加入青霉素、链霉素各１０００单位、叠氮钠至０．０１％浓度，置４℃冰箱备用。（２）１％琼脂糖平板：称取琼脂糖１ｇ，溶于１００ｍｌ生理盐水中，加热融化，然后乘热倒入平皿中，冷却后放入冰箱备用。（３）ＰＢＳ缓冲液［３］。ＫＨ２ＰＯ４１３．６ｇ、ＮａＣｌ５８．４ｇ、ＮａＣＮ３１．０ｇ，用９８００ｍｌ蒸馏水溶解，装入１万ｍｌ血清瓶，用１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调至ｐＨ值７．５（大约用１００ｍｌ），定容至刻度处，高压灭菌后备用。（４）卵黄液中免疫球蛋白ＩｇＧ的提取［４］。在高免卵黄液中加入４倍体积的ＰＢＳ缓冲液，充分摇匀，再加入ＰＥＧ６０００，使其最终浓度达４％，搅拌１０ｍｉｎ后，４０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ。无菌收集上清液再加入ＰＥＧ６０００，使其最终浓度为１２％，搅拌１０ｍｉｎ，同上离心，弃上清液，所得产品即为粗提的ＩｇＧ。１．２结果与分析１．２．１ＩｇＧ效价。琼脂扩散法：将提纯的抗体稀释致原卵黄液体积，用事先准备的琼脂糖平板，放在事先画好的７孔图案上，打孔，加入标准抗原和ＩｇＧ稀释液。将平板放在湿盒中，置３７℃温箱中２４～４８ｈ观察，结果为平均效价１２８。说明用此法提取ＩｇＧ时能充分提取，即效价不变。１．２．２ＩｇＧ稀释液检验。（１）细菌学检验。将ＩｇＧ稀释液接种于营养琼脂试管斜面上，３７℃鸡胚培养２４ｈ，观察到无细菌生长。（２）病毒学检验。将９日龄ＳＰＦ鸡胚（购自山东家禽研究所）１０枚，分为２组，ＩｇＧ稀释液接种１组，０．２ｍｌ／枚；另一组作对照，接种生理盐水，３７℃鸡胚孵化５ｄ后通过照蛋，可以看出血管清晰，说明２组鸡胚均生长良好。将鸡胚放入４℃冰箱过夜，第２天观察鸡胚，２组均未发现病变。通过检验说明，用提纯卵黄抗体的方法，避免了细菌和病毒的垂直传播，而且排除了卵膦子等大分子物质的应激反应。２卵黄抗体提取液的冻干液体状的卵黄抗体在保存和运输上存在着体积大易失活等缺点，而冷冻干燥技术能使纯化的抗体在预先冷冻的状态下，不经液态直接升华除去水分而获得干粉型制剂，它避免了液态下保存的抗体易失活易变形的缺点，使产品体积大大缩小，便于运输及能够长时间保存［５］。２．１材料和方法２．１．１材料。ＩｇＧ稀释液，冷冻真空干燥机（安徽省农科院畜牧兽医研究所兽药制剂室），蔗糖，真空枪。２．１．２方法。在ＩｇＧ稀释液中加入浓度５％蔗糖作为冻干干燥剂，经定量分装机分装２ｍｌ于７ｍｌ西林瓶内，放入冷冻真空干燥机中制成冻干制剂。用真空枪检验，如果呈现蓝色荧光，表明瓶内处于真空保存状态，为合格产品。２．２结果与分析２．２．１安全性检验。取３０日龄健康鸡（河南故始三高集团提供）２０只，分为２组，一组肌注冻干稀释液（１∶４倍稀释，即每瓶加生理盐水８ｍｌ，稀释后效价为１∶３２）２ｍｌ，另一组肌注４ｍｌ，观察１０ｄ。结果２组精神状态一直良好，临床未见异常表现，剖检未见病变，说明ＩｇＧ冻干制剂使用安全。２．２．２抗体冻干前后的效价测定。琼脂扩散法测定效价变化情况：抽查２个批组，每批随机抽取１０瓶，测定结果都为１∶１２８，说明制成冻干制剂对效价无影响。２．２．３温度对抗体效价的影响。将常规未提纯卵黄抗体液和ＩｇＧ冻干制剂于不同温度下作用一定时间后，用琼脂扩散法测定效价变化情况，结果见表１。（下转第２１５０页）高免卵黄抗体提纯及提取液冻干的研究
胡晓苗１，２，李春芬２，汪丽１，赵磊２（１．安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥２３００３１；２．安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥２３００３６）
摘要针对高免卵黄抗体的缺陷，采用聚乙二醇法提纯卵黄抗体ＩｇＧ，ＩｇＧ稀释为原卵黄液体积时效价不变，为１∶１２８，细菌和病毒学检验均为阴性。将ＩｇＧ稀释液制成冻干制剂，实验表明冻干后效价不变且对温度的抵抗力大大提高，冻干制剂防治效果良好。说明此种方法可避免常规卵黄抗体临床传播疫病的危险，运输和保存更加方便，真正做到了安全、高效。关键词卵黄抗体；提纯；ＩｇＧ；冻干；琼脂扩散法中图分类号Ｑ９５９．９文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１（２００６）１０－２１４７－０１安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００６，３４（１０）：２１４７，２１５０责任编辑曹淑华责任校对曹淑华
表１温度和时间对２种不同剂型抗体效价的影响卵黄抗体液ＩｇＧ冻干制剂００１批００２批００３批００１批００２批００３批６０℃１ｈ－±±－－－３７℃３０ｄ＋＋＋＋＋＋＋＋＋±－－０～４℃琼脂糖１年＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－２０℃１年－－－－－－注：“－”为无影响，“±”为稍有影响，“＋”为影响较小，“＋＋＋”为完全失活。从表１可以看出，纯化的卵黄抗体冻干后对温度的耐受力大大增强，在４℃可保存１年以上，室温下可保存１个月以上。２．２．４防治实验。取１月龄易感病鸡（经琼脂扩散法监测为阴性）５０只随机分成５组，每组１０只，隔离饲养。每组处理及对鸡病的免疫效果见表２。从表２可以看出，卵黄冻干制剂预防保护率为１００％，紧急接种和治疗时保护率９０～８０％。笔者在合肥郊县进行现场使用观察，结果相似。３结论与讨论（１）通过纯化提取卵黄抗体ＩｇＧ，可彻底消除垂直传播疫病的危险性，同时可免除卵磷蛋白等大分子物质的副作用。（２）提纯ＩｇＧ稀释液制成冻干制剂，其效价不变，对温度的耐受力大大增强；由于冷冻干燥在低温高真空度下进行，不会改变产品中活性分子结构，产品不起泡不暴沸，且不粘壁易溶于水［６］。所有这些为长期于室温或普通冰箱内保存提供了依据。（３）不足之处：生产所需化学试剂量大，操作程序复杂，需要添置离心和冻干设备，由此构成的销售价格比常规卵黄抗体高。尽管如此，笔者认为这是发挥卵黄抗体作用的一条途径。参考文献［１］张家峥，施萍，牛桂玲．使用高免卵黄抗体液利弊及前景［Ｊ］．中国家禽，２００３，２５（２３）：４５．［２］温建新，沈敏，钟发刚．抗传染性法氏囊病高免卵黄抗体的使用［Ｊ］．中国兽医杂志，１９９９，２５（３）：２８．［３］李成文．现代免疫化学技术［Ｍ］．上海：科学技术出版社，１９９０：２６３－２６６．［４］易序权，黎杰红，魏爱兰．聚仪二醇提取卵黄ＩｇＧ的研究［Ｊ］．中国畜禽传染病
，１９８９（２）：４９－５１．［５］王世中．免疫化学技术［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８０：１９４－１９６．［６］陆萍，倪学英，胡贵贤．抗鸡传染性法氏囊病毒单克隆抗体冻干制剂的制备效检与应用［Ｊ］．上海农学院学报，１９９４，１２（２）：１００－１０３．处理实验鸡数发病鸡数死亡鸡数保护率％攻毒前２４ｈ注射冻干稀释液１ｍｌ１０００１００攻毒同时注射冻干稀释液１ｍｌ１０２１９０攻毒后２４ｈ注射冻干稀释液１ｍｌ１０５２８０肌注生理盐水１ｍｌ１０１０８不攻毒不注射组１０００表２卵黄抗体提取液对鸡病的免疫效果组与对照组差异显著（Ｐ＜０．０５）。这表明４０ｇ／ｄ的植物脂肪粉可能不太合适；添加４０ｇ／ｄ的过瘤胃脂肪有提高脂肪消化率的作用。４结论在绵羊日粮中添加４０ｇ／ｄ脂肪酸钙和植物脂肪粉对瘤胃液氨态氮浓度有一定的降低作用，但试验组与对照组以及试验组与试验组之间在０．０５水平上无差异；４０ｇ／ｄ的过瘤胃脂肪添加水平有降低瘤胃ｐＨ值的作用，但作用并不显著；绵羊添加４０ｇ／ｄ的脂肪酸钙提升了干物质采食量，而添加４０ｇ／ｄ的植物脂肪粉和硬脂肪却降低干物质采食量，但过瘤胃脂肪对采食量的影响并不显著。添加４０ｇ／ｄ过瘤胃脂肪对营养物质全消化道消化率有一定影响，其中蛋白、ＡＤＦ和ＮＤＦ消化率有一定的下降。各种过瘤胃脂肪之间存在着一定的差异，尤其是对蛋白消化率来说影响程度不同，这方面的工作还需更深入的研究。参考文献［１］韩正康，陈杰．反刍动物瘤胃的消化和代谢［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８８：１９．［２］卢德勋，谢崇文．现代反刍动物营养研究方法和技术［Ｍ］．北京：农业出版社，１９９３．［３］史清河，韩友文．全混合日粮对羔羊瘤胃代谢产物浓度变化的影响［Ｊ］．动物营养学报，１９９９，１１（３）：５１－５７．［４］谭支良，卢德勋，胡明，等．绵羊日粮中不同碳水化合物比例对瘤胃内环境参数的影响［Ｊ］．动物营养学报，２０００，１２（１）：４２－４７．［５］杨胜．饲料分析及饲料质量检测技术［Ｍ］．北京：北京农业大学出版社，１９９３．［６］赵广永．瘤胃发酵调控研究进展［Ｊ］．动物营养学报，１９９９（１１）：２１－２８．［７］菜青和，贾志海．绵羊日粮中添加不同水平脂肪酸钙对养分消化的影响［Ｊ］中国农业大学学报，２００１，６（３）：１１３－１１８．［８］ＨＯＯＶＥＲＷＨ，ＳＴＯＲＫＥＳＳＲ．Ｂａｌａｎｃｉｎｇｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｆｏｒｏｐｔｉｍｕｍｒｕｍｅｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｙｉｅｌｄ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉ，１９９１，７４：３６３０．［９］ＪＥＮＫＩＮＳＴＣ，ＰＡＬＭＱＵＩＳＴＤＬ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓｏｒｃａｌｃｉｕｍｓｏａｐｓｏｎｒｕｍｅｎａｎｄｔｏｔａｌｎｕｔｒｉｅｎｔｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆｄａｉｒｙｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉ，１９８４，６７：９７８－９８６．［１０］ＲＯＢＩＮＳＯＮＰＨ．Ｄｙｎａｍｉｃａｓｐｅｃｔｓｆｅｅｄｉｎｇｍａｎａｇｅｍｅｎｔｆｏｒｄａｉｒｙｃｏｗ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉ，１９８９，７２：１１９７－１２０９．［１１］ＲＯＧＥＲＳＧ．Ｆａｔｔｙａｃｉｄｃａｌｃｉｕｍｓｏａｐｓａｓｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｆｏｒｇｒａｚｉｎｇｄａｉｒｙｃｏｗｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＡｕｓｔｒａｌｉａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＡｎｉｍａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．１９８８（１７）：４５９．［１２］ＤＥＶＡＮＴＭ，ＦＥＲＲＥＴＡ，ＧＡＳＡＪ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｅｃｔｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ｒｕｍｅｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｒａｐｉｄｌｙｇｒｏｗｉｎｇｈｅｉｆｅｒｓｆｅｄｈｉｇｈ!ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｉｅｔｓｆｒｏｍ１００ｔｏ２３０ｋｇｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ［Ｊ］．ＡｎｉｍＳｃｉ，２０００，７８（６）：１６６７－１６７６．［１３］ＪＥＮＫＩＮＳＴＣ，ＦＯＴＯＵＨＩＮ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｅｃｉｔｈｉｎａｎｄｃｏｒｎｏｉｌｏｎｓｉｔｅｏｆｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｒｕｍｉｎａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｓｈｅｅｐ［Ｊ］．ＡｎｉｍＳｃｉ，１９９０，６８：４６０－４６６．［１４］ＣＨＲＩＳＴＩＡＮＳＥＮＷＣ．Ｒａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｒｕｍｅｎｐｒｏｔｏｚｏａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＡｎｉｍＳｃｉ，１９９０，２３：９８４．［１５］ＤＥＶＥＮＤＲＡＣ，ＬＥＷＩＳＤ．Ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｄｉｅｔａｒｙｌｉｐｉｄｓａｎｄｆｉｂｒｅｉｎｓｈｅｅｐ［Ｊ］．ＡｎｉｍａｌＰｒｏｄ，１９７４（１９）：７６－８４．［１６］ＢＯＯＤＩＯＬＵＰ．Ｆａｔｔｙａｃｉｄｃａｌｃｉｕｍｓｏａｐｓｉｓａｎｉｍａｌｆｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．ＲｉｖｉｓｔｓＩｔａｌｉａｎａ!ｄｅｌｌｅＳｏｓｔａｎｚｅＧｒａｓｓｅ，１９９３（７０）：６２７１－６２７４．［１７］ＹＯＵＮＧＢＫ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｄｉｅｔａｒｙｆａｔｆｒｏｍｅｘｔｒｕｄｅｄｓｏｙｂｅａｎｓａｎｄｃａｌｃｉｕｍｓｏａｐｓｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｆｏｒ１ａｃｔａｌｉｎｇｄａｉｒｙｃｏｗｓ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，１９９３（７６）：１９７－２０４．［１８］ＭＯＵＬＤＦＬ，ＯＲＳＫＯＶＥＲ．ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｕｍｅｎｆｉｕｉｄｐＨａｎｄｉｔｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｃｅｌｌｕｌｏｌｙｓｉｓｉｎｓａｃｃｏ，ｄｒｙｍａｔｔｅｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒｕｍｅｎｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｉｎｓｈｅｅｐｏｆｆｅｒｅｄｅｉｔｈｅｒｈａｙｏｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ［Ｊ］．ＡｎｉｍＳｃｉ，１９８３（１０）：１．［１９］ＡＬＩＩＡＤＲＡＭＩＧＡ，ＮＩＧＭＡＡ，ＫＨＯＬＩＦＡＭ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｒｏｕｇｈａｇｅｔｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｒａｔｉｏｓｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｄｃａｒｃａｓｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｌｏｃａｌｌａｍｂｓｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＡｒａｂＷｍｉｒａｔｅｓ［Ｊ］．ＡｒａｂＧｕｌｆＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，１５（１）：１３７－１４８．［２０］ＡＬＨＡＤＨＲＡＭＩＧ，ＨＵＢＥＲＪＴ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＡｌｆａｌｆａｈａｙｖａｒｙｉｎｇｆｉｂｅｒｆｅｄａｔ３５％ｏｒ５９％ｏｆｄｉｅｔｏｎｌａｃｔａｔｉｏｎａｎｄｍｕｔｒｉｅｎｔｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｂｙｄａｉｒｙｃｏｗｓ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉ，１９９２，７５：３０９１－３０９９．［２１］ＣＨＡＮＤＲＡＭＯＮＩＸＸ，ＪＡＤＨＡＯＳＢ，ＴｉｗａｒｉＣＭ，ｅｔａｌ．ＣａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｌａｎｃｅｓｔｕｄｉｅｓｉｎＭｕｚａｆｆａｒｎａｇａｒｉｓｈｅｅｐｆｅｄｄｉｅｔｓｖａｒｙｉｎｇｉｎｒｏｕｇｈａｇｅａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｒａｔｉｏ［Ｊ］．ＳｍａｌｌＲｕｍｉｎａｎｔＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，３１（３）：２２１－２２７．［２２］ＳＴＯＲＲＹＪＥ．Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄｌｉｐｉｄｓｉｎｒｕｍｉｎａｎｔｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｇｒｉｃｔ［Ｊ］．ＤｅｖＡｄｖＳｅｖ，１９７４（１５）：９６．!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第２１４７页）安徽农业科学２００６年２１５０
小鹅瘟冻干卵黄抗体被动免疫持续期研究
中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ
ｄｏｉ：１０．１１７５１／ＩＳＳＮ．１００２－１２８０．２０１８．０４．０２ ·７·
小鹅瘟冻干卵黄抗体被动免疫持续期研究
李厚伟 ，孙林杰 ，孙永珍 ，曹艳杰 ，徐进 。
（１．河南后羿生物工程股份有限公司，郑州４５１１６１；２．河南省兽用生物制品工程研究中心，郑州４５１１６１； ３．内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特０１００１８） ［收稿日期］２０１７－０９—１６［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２－１２８０（２０１８）０４－０００７—０７［中图分类号］￥８５２．６５
［摘 要］ 为探索小鹅瘟冻干卵黄抗体的被动免疫保护期及抗体效价与免疫持续期的平行相关
性．试验采用３种琼扩效价分别为１：１６、１：３２和１：６４的实验室试制冻干卵黄抗体各３批，分别
接种１日龄、４日龄健康易感雏鹅，１日龄雏鹅每只注射０．５ ｍＬ，４日龄雏鹅每只注射１．０ ｍＬ，并于注 射后０ ｈ、１２ ｈ、２４ ｈ、１２０ ｈ、１４４ ｈ、１６８ ｈ、１９２ ｈ、２１６ ｈ对试验组和攻毒对照组接种小鹅瘟强毒Ｗ株，
每只０．２ ｍＬ（含１００ ＬＤ ）。结果显示：不同效价的卵黄抗体免疫后１４４ ｈ内攻毒，卵黄抗体均可对
雏鹅提供１００％的免疫保护，雏鹅日龄越小，相对保护率越高，卵黄抗体琼扩效价越高，对雏鹅的免
疫保护持续期越长。 ［关键词］ 小鹅瘟冻干卵黄抗体；抗体效价；免疫持续期
Ｔｈｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｐｈａｓｅ ｏｆ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ
ｆｏｒ Ｆｒｏｚｅｎ Ｙｏｌｋ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ Ｇｏｓｌｉｎｇ Ｐｌａｇｔｉｅ
ＬＩ Ｈｏｕ－ｗｅｉ ，ＳＵＮ Ｌｉｎ－ｊｉｅ ，ＳＵＮ Ｙｏｎｇ—ｚｈｅｎ ，ＣＡＯ Ｙａｎ－ｊｉｅ。，ＸＵ Ｊｉｎ ＇
（１．Ｈｅｎａｎ １－１ｏ Ｂｉｏ—Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５１１６１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｈｅｎａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５１１６１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕｈｅｈａｏｔｅ ０１００１８，Ｃｈｉｎａ） Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＸＵ Ｊｉｎ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｅｎｅｘｕ＠Ｉｌｉｏｎ．ｃｏｒｎ
卵黄免疫球蛋白的制备
卫生与健康
Ｃｈｉｎａ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ
卵黄免疫球蛋白的制备
李宏娜
乌苏里江制药有限公司哈尔滨分公司
［摘要］文章就卵黄囊抗体的分离纯化方法及其应用研究进行了分析。 ［关键词］卵黄囊抗体 中图分类号：Ｒ６５７．７＋３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９—９１４Ｘ（２０１４）１ ｌ一０３２２—０１
卵黄囊抗体即卵黄免疫球蛋白（Ｅｇｇ Ｙｏｌｋ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＩｇＹ）是抗 原免疫禽类后由卵黄中分离得到的特异｝生抗体 与哺乳动物来源的ｌａｇ比较，卵
黄囊抗体具有取材方便、分离纯化方法简单、产量高，同时具有特异性高、稳定
性较好等优点，在疾病诊断、防治等诸多方面得到了广泛的应用，一直是生命科 学相关科研领域的研究热点。
与哺乳动物血清免疫球蛋白相似，卵黄囊抗体的基本结构包括绦轻链和
２条重链，分子量约为１８０ＲＤ。卵黄囊抗体的疏水性大于ＩｇＧ。Ｌｅｅ和Ｋｉｍ等研究
表明，卵黄囊抗体具有良好的稳定性，对ｐＨ及酶等作用引起的失活效应有较强 的抵抗力。
一 卵黄免疫球蛋白的制备
１、实验动物的免疫
Ｓｃｈｗａｒｚｋｏｐｆ￣研究结果表明：经皮下注射的方法比肌肉注射能产生更高
滴度的抗体，免疫间隔时间对抗体的产生影响较大。通常，初次免疫与第一次加 强免疫之间的时间间隔至少４周。另有研究分别于第０ｄ，ｌＯ周及１５周免疫产蛋
鸡，获得了高达１：１６００００的抗体滴度。
２、卵黄囊抗体的分离
从卵黄液中分离卵黄囊抗体的关键是除去卵黄中高含量的脂肪及脂蛋白，
以获得水溶性组分（Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ，ＷＳＦ）。根据纯度要求、技术工艺 以及对环境的影响等因素，可以选择不同的分离方法。常见分离方法包括以下
几种。
１）水稀释法先将卵黄液用蒸馏水稀释１Ｏ倍，调整ｐＨ值至５０～５２，４Ｅ静
置６ｈ【 上，上清液即为水溶性组分。水稀释法工艺简单，若采用适当的方法进行 纯化，可获得较高的回收率和纯度。
卵黄抗体制备及应用
抗鸡球虫卵黄抗体制备及初步应用
作者：钱玮霖 指导老师：徐前明
（安徽农业大学植保学院 合肥 230061）
摘要：本项目旨在研制抗鸡球虫卵黄抗体，为防治鸡球虫病提供一种新的手段。利用对临床所分离的球虫，经超声波裂解制备粗抗原，然后将所得抗原分别于弗氏完全佐剂和不完全佐剂混合，经肌肉注射方式对鸡蛋进行免疫，收集免疫后的卵黄；采用饱和硫酸铵法分离卵黄中的抗体，并用聚乙二醇浓缩获得较高浓度的抗体；采用凝集试验确定其抗体水平，并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法进行抗体纯度分析；最后将所分离的抗鸡球虫卵黄抗体用于鸡感染球虫保护试验。结果表明：（1）临床所分离得球虫多为混合感染，达3种以上；（2）蛋鸡经免疫后，经凝集试验可证实其抗体水平可达1:28，SDS-PAGE电泳显示：纯化后抗体大小为67.0kD 和23kD，且纯度较高。基于上述情况，认为本试验制备出抗鸡球虫卵黄抗体方法并初步阐明了其抗鸡球虫的基本功能。
关键词：鸡球虫病；卵黄抗体；保护试验
引言
鸡球虫病广泛存在于养鸡业中，常造成大批死亡，其死亡率可最高达80％，且病愈鸡生长严重受阻，抵抗力降低，易继发其他疾病。每年，全世界因为鸡球虫病造成的损失高达数十亿美元[1]。 因此，鸡球虫病是养鸡业中危害最严重的疾病之一。在我国，特别是在南方地区，由于气温高、湿度大，这种环境利于球虫卵囊的孢子发育，本病常常呈暴发性流行，危害更加严重。
然而，目前对鸡球虫病的防治措施绝大部分多依赖于药物的预防和治疗上,即化学合成药物和抗生素两大类，自从1936年首次出现专用抗球虫药以来，已报道的抗球虫药达40余种，但是因为球虫对药物极易产生抗药性，大量使用化学药物势必会造成严重的药物残留问题等，这也是当今养禽业所遇到最棘手的问题之一。上述问题存在，为临床防治鸡球虫病提出紧迫任务。
卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用。这种策略得到良好的运用，如鸡法氏囊卵黄抗体在一定程度上解决了临床治疗该病难题，为生产作出了一定的贡献。
(IgY)的性质、提纯及应用于寄生虫学的研究
中国人兽共患病学报
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｎｏｓｅｓ４４ｌ
文章编号：１００２—２６９４（２０１１）０５—０４４１一０３
鸡卵黄抗体（ＩｇＹ）的性质、提纯及应用于寄生虫学的研究
周彦１（综述），沈定文２（审阅）
中图分类号：Ｒ３８２．５文献标识码：Ｂ免疫学ＩｇＹ技术是近几年发展起来的一种新的生物技术领域及医药研究中的热点技术。本文简
要综述鸡卵黄抗体（ＩｇＹ）的特性、提纯及应用于寄
生虫病免疫诊断及免疫治疗等方面，以开拓寄生虫病防治。
弓形虫病（ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）危害严重，感染方式
多种多样，常规检测方法包括免疫学检测、分子生物学检测及病原学检测等。病原学培养和动物接种操
作复杂，却是弓形虫检测的金标准。现代ＰＣＲ方法
对实验室条件要求较高且具有经过严格训练的专门
技术人员才可上岗。传统的血清学方法，虽然在区分现症和既往感染及诊断免疫缺陷患者方面有缺
陷，但其操作简单，仍然是各实验室的首选方法。有
研究表明【ｌｊ，ｌｇＹ可应用于弓形虫病防治且抗体效
价高、特异性强、纯度高。鉴于此，ＩｇＹ作为新近研究的免疫诊断抗体是完全可行的，ＩｇＹ技术在弓形
虫病防治中越来越受到重视。
１卵黄抗体（ＩｇＹ）的性质研究证实心Ｊ，产蛋鸡的卵黄对抗体有浓集作用，
可使其不断储存于卵黄中。这种抗体称为卵黄抗体
（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｏｆｙｏｌｋ，ＩｇＹ）。经特定抗原免疫后的母鸡可产生相应的特异性抗体，进而进一步应
用于疾病诊断及防治中。ＷｉｌｍａｒＤｉａｓｄａＳｉｌｖａ等［３］报道，ＩｇＹ与哺乳动物来源抗体相比较在免疫诊断及免疫治疗方面具有
以下优势：
１．１产量高成年母鸡血清中ＩｇＹ大约为５—
７ｍｇ／ｍＬ。一只高产蛋鸡每月能产２０个鸡蛋，每月可获２９ＩｇＹ，相当于３００ｍｌ。血清中ＩｇＹ的含量及
６００ｍｌ，全血中ＩｇＹ的含量。生产等量的抗体只能
通过大型哺乳动物制得。因此，鸡卵黄抗体应用于免疫诊断方面更加经济。使用少量的抗原免疫禽类
氯仿法、水解法、卡拉胶法提取鸡蛋中卵黄抗体
氯仿法、水解法、卡拉胶法提取鸡蛋中卵黄抗体
【摘 要】卵黄抗体（egg-yolk antibody，IgY）具有一些IgG所没有的优良特性，与哺乳动物的IgG相比，IgY 的提取具有方法简单，提取率高且方法多样等优点。本文旨在对当前条件下卵黄抗体的提取方法进行比较。选取水溶法（Water Dilution，WD）、氯仿法（Chloroform，CHL）和卡拉胶法（Carrageenan，CAR）制备IgY，根据电泳结果，比较三种方法得率高低。SDS-PAGE结果表明，氯仿法的得率较其他两种方法高一些。
【关键词】卵黄抗体；提取；电泳
1.1 卵黄抗体的发现和命名
1893年，Klemperer首次报道了鸡蛋中存在抗体，发现蛋黄中抗体以IgG占优势，而IgM和IgA的含量很少，现已证明了免疫鸡的蛋是提供特异性IgG抗体最方便，最廉价的来源[1]。由于鸡蛋黄的英文名称是“Yolk”，故将鸡蛋黄中的免疫球蛋白IgG称为IgY。
1.2 卵黄抗体的一般性质
卵黄抗体相对分子量约为180kDa，有两条轻链和两条重链组成（2H+2L）。其中轻链（L）相对分子量约为22～30kDa，重链（H）相对分子量约为67～70kDa，等电点接近5.2，含氮量为14.8%，IgY的氨基酸组成与鸡血清IgG和牛IgG不同。此外，还具有以下优点：
（1）鸡卵黄中IgY纯度高，含量大。
（2）特异性高。
（3）稳定性好。在室温保存半年，其抗体活性不变，在4℃冰箱贮存6-7年，经免疫扩散法测定其活性降低不超过5%[2]。
（4）产量高。
（5）IgY不激活补体。
（6）IgY能耐酸耐热。
（7）安全。服用安全可靠，王泽中等用治疗剂量（80-300mg/kg）的10-40倍进行试验，没有发现毒性反应。
1.3 IgY的分离、提纯方法
卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白（α、β、γ）是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY。
鸡卵黄抗体的研究与应用
２（Ｄ７年９月
第２８卷 第９期 韶关学院学报・自然科学
Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｓｈａｏｇｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ・Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｐ．２（Ｄ７ Ｖ０１．２８ Ｎｏ．９
鸡卵黄抗体的研究与应用
刘博婷 。朱必凤
（１．南昌大学生命科学学院，江西南昌３３００２９；２．韶关学院英东生物工程学院，广东韶关５１２００５）
摘要：免疫母鸡的卵黄内舍有抗体这一发现，推动了卵黄抗体制备技术的发展．研究发现卵黄抗体更优于哺乳动 物所产生的抗体，而且减少了对动物的伤害．分析了卵黄抗体的生物学特性、作用机理以及用途， 关键词：卵黄抗体；提取；纯化
中图分类号：￥８５２，５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１１９０７—５３４８（２ｏ０７）０９一ＯＯ９４—０４
卵黄抗体（ＩｇＶ）指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体．鸟类、爬行类和两栖类动物的蛋黄中仅
含有免疫球蛋白ＩｇＧ一种成分．因为只有免疫球蛋白ｒｇＧ分子能通过卵黄囊转输至蛋黄中，因此用抗原免疫
的母鸡所生的鸡蛋黄中含有丰富的免疫球蛋白ＩｇＧ．由于鸡蛋黄的英文名称为“Ｙ０ｌｌ（”，特取它的第一个字母
“Ｙ”为代表，将鸡蛋黄中的免疫球蛋白ＩｇＧ称为ＩｇＹ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｈｎ—Ｙ０ｌｋ）．
１卵黄抗体ＩｇＹ的特性
ＩｇＹ的性质与哺乳动物的ＩｇＧ相似．正常鸡ＩｇＹ的等电点约为５．２，分子量约为１８０ ｋｕ，由两条轻链（２Ｌ）
和两条重链（２ｒｔ）组成．与应用抗原免疫哺乳动物所产生的血清ｒｇＧ相比，鸡卵黄免疫球蛋白ＩｇＹ具有以下特
性：（１）鸡卵黄中ＩｇＶ纯度高、含量大．用抗原免疫母鸡后，由免疫母鸡所生的鸡蛋黄中只有 Ｙ一种抗体，其
含量和纯度超过鸡血清ＩｇＧ．（２）特异性高．利用鸡蛋黄免疫球蛋白作为医学上的诊断试剂，其特异性高，不
产生假阳性反应，（３）稳定性好．ＩｇＹ在室温保存半年，其抗体活性不变，在４℃冰箱贮存６～７年，经免疫扩散
法测定其活性降低不超过５％“Ｊ．（４）产量高．免疫的产蛋母鸡是高效率、高质量的 “生产厂”．经用特定抗
卵黄抗体生产工艺流程
卵黄抗体生产工艺流程
卵黄抗体的生产工艺流程一般包括以下几个步骤：
1. 动物免疫：选择适合的动物（例如兔子或鸡等）作为免疫动物进行实验室饲养和管理。选择目标抗原或疫苗作为免疫原，通过注射或其他途径将免疫原引入免疫动物体内，激发免疫动物产生抗体。
2. 卵黄收集：根据免疫动物产生的抗体进入卵黄的特性，定期收集卵黄。一般在动物免疫后的数周或数月内开始收集卵黄。
3. 卵黄精制：收集到的卵黄通过离心或其他方法分离出卵黄清液，将卵黄清液进行过滤、澄清等处理手段，除去杂质。
4. 抗体提取：将精制后的卵黄清液与某种形式的固相抗原结合，例如通过固定化的蛋白A或蛋白G等进行结合。在温和的条件下，使抗体与抗原结合，形成固定的抗原-抗体复合物。
5. 分离纯化：使用适当的方法可以从抗原-抗体复合物中分离出目标抗体。例如，可以通过调节pH值、添加盐溶液、洗脱剂等方式，将抗体从固定相上洗脱。
6. 纯化抗体：得到的抗体需要进行进一步纯化，除去其他污染物。可以使用不同的技术，例如盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等方法。
7. 鉴定及质量控制：对纯化后的抗体进行鉴定，确定其抗体活性、纯度和规格等参数。常用方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot、稀释实验等。
8. 储存和包装：将鉴定合格的抗体进行储存和包装，通常采用低温冷冻保存，以保持其稳定性和有效性。
以上是卵黄抗体生产工艺流程的一般步骤，实际操作可能会根据具体情况的不同有所调整和变化。
IgY提取纯化方法
IgY提取纯化方法
鸡卵黄中含有水分48.0%，蛋白质17.8%和脂肪30.5%，其中大部分脂肪与结合以脂蛋白的形式存在。卵黄包括水溶性蛋白γ-卵黄球蛋白，α-卵黄球蛋白，β-卵黄球蛋白。γ-卵黄球蛋白和各种脂，如LDL、HDL等。所以分离纯化IgY的关键是除去卵黄中高含量的脂及脂蛋白。
早在20世纪60年代初，科学家就发现鸡卵黄中存在IgG抗体，其含量与血清相似甚至更高，但一直未引起足够的重视，显然是由于很难将IgG抗体从丰富的卵黄脂质中分离出来，使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制。直到80年代初，Polson和Jensenius相继建立了有效且相对简便的聚乙二醇（PEG）提取法和硫酸葡聚糖提取法，有关这方面的研究便如雨后春笋般大量涌现，并且被广泛应用在生物学的许多领域。
1 IgY的分离
分离的关键是除去卵黄中高含量的脂肪及脂蛋白，以获得水溶性组分（Water
Soluble Fraction，WSF）。常见分离方法有以下几种：
1.1 有机物沉淀法 聚乙二醇（PEG）法和硫酸葡聚糖（DS）法是比较常用的方法。一般采用PBS或TBS作缓冲液，将卵黄液稀释5倍，加入一定比例的聚乙二醇6000（以3.5%最佳）或硫酸葡聚糖，脂类即发生沉淀，IgY保留在上清液中。Schwarzkopf
C等在比较了6种分离方法后认为硫酸葡聚糖法具有快速、有效、简便等优点[2]。
1.2 有机溶剂抽提法 脂类易溶于有机溶剂，可采用氯仿等进行分离。一个经TBS冲洗过的鸡蛋黄制成15mL蛋黄液，加入40mLTBS充分混合后加入40mL氯仿，冷冻离心，分三相。弃去氯仿层，保留水层，中间的半固体相用40mLTBS萃取，取水层，与前一步水层合并即为水溶性组分Hamada将蛋黄溶于等体积的盐溶液中，再与二倍体积的氯仿混合，离心即得水溶性组分。还有学者使用丙酮分离获得水溶性组分。
1.3 天然胶法 Hatta等认为一些天然胶如卡拉胶和黄原胶可用于卵黄抗体分离。具体做法是将9倍体积的0.1%（w／v）卡拉胶溶液与卵黄混合，离心得水溶性组分。亦可将卵黄用双蒸水稀释一倍后与4倍体积的黄原胶混合，离心得水溶性组分。使用天然胶法去除脂类比较完全，水溶液中脂类含量少于0.4%。
卵黄免疫球蛋白IgY的提纯及应用研究进展
４＇ａ￣￣２０ｏ２年第２４卷第２０期 Ｃｈｉｎａ Ｐｏ Ｖｏ１．２４，Ｎｏ．２０．２００２ 卵簧免疫球蛋 ＩｇＹ 的猩纯厦应用研窈递展 １ ＩｇＹ的性质 穆海波，王洪新（江南大学食品学院，江苏无锡２１４０３６） 鸡卵黄免疫球蛋白（ＩｇＹ）是鸡卵黄中存在的 主要免疫球蛋白，当用某种抗原免疫母鸡时，母 鸡产生免疫反应，在卵黄成熟期，血液中的免疫 球蛋白ＩｇＧ选择性的转移到卵黄中，称卵黄免疫 球蛋白ＩｇＹ，ＩｇＹ在子鸡孵育过程中和孵育后对子 鸡起保护作用。 ＩｇＹ的性质与哺乳动物的ＩｇＧ类似，其分子 量约１８０ｋＤａ，由两条轻链和两条重链组成（２Ｈ＋ ２Ｌ），其中轻链（Ｌ）分子量约２２０００Ｄａ，重链分子 量约６７０００Ｄａ，等电点接近５．２。含氮量为１４．８％。 ＩｇＹ的氨基酸组成与鸡血清ＩｇＧ和牛ＩｇＧ不同（如 表１）。 表１ ＩｇＹ，鸡血清ＩｇＧ及牛ＩｇＧ的氨基酸组成 （质量分数） ６．９ ８．３ ｌ２．３ ９．３ ７．５ ９．８ ８．０ ２．３ ７．５ １．０ ３．１ ８．２ ３．２ ２．８ ３．５ １．６ ４．８ 收稿日期：２ｏ０２一Ｏ９—１Ｏ ＩｇＹ结构虽然和ＩｇＧ不同，但它仍具有免疫活 性，且抗体活性很高。ＩｇＹ的性质较稳定，活性保 持良好。根据Ｍａｋｏｔｏ Ｓｈｉｍｉｚｕ研究在低于７５℃条 件下，ＩｇＹ具有良好的热稳定性，高于８０￣（２，大部分 ［ｇＹ丧失结合活性。此外ＩｇＹ的酸碱稳定性较好， 在ｐＨ＜４时，有部分ＩｇＹ失活，ｐＨ为４￣１２，活性几乎 不受影响，在ｐＨ＞１２ ＥＩ￣迅速失活。并］ｔＩｇＹ对胃蛋 白酶有较好的抵抗力，但是对胰蛋白酶十分敏 感。 ＩｇＹ还有一些不同于哺乳动物ＩｇＧ的特殊生 物学特性，它不与金黄色葡萄球菌Ａ蛋白结合，不 与哺乳动物Ｆｃ受体结合，不与类风湿因子发生非 特异性反应，对哺乳动物补体无固定作用，因而 在检测诊断中特异性强，灵敏度高。 ２ ＩｇＹ的免疫制备 选健康产蛋母鸡隔离饲养后进行免疫，免 疫方法可选皮下、皮内、肌肉、静脉、腹股沟、法 氏囊注射或口服等。最常用的方法是翅下肌肉 注射。免疫抗原有多种，近年来国外已制备多种 不同抗原的ＩｇＹ，包括人和动物的疾病的病原体 以及细胞、激素、各种蛋白等。一般免疫３￣４次， 免疫后７￣１０天，鸡蛋中就产生了抗体，随后ＩｇＹ 逐渐增高，最后达到高峰，以后又缓慢下降。如 要维持高产量，每隔一个月后再强化免疫一次， ＩｇＹ又会产生一个高峰。Ｃａｒｒｏｌｌ测定了ＩｇＹ和血清 ＩｇＧ抗体活性，发现二者活性一样。Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ研 究了卵黄抗体和血清抗体出现的时间规律，静 脉免疫抗原后，第５天血清抗体开始出现，卵黄 抗体在血清抗体出现４天后才检测到。目前，我 国学者研究用于治疗禽病的主要有抗鸡新城 疫、鸡传染性法氏囊病、小鹅瘟、鸭肝炎、禽流感 一３５一 叩ｈ 椰 维普资讯 ＠中固采禽２００２年第２４－￣ｇ ２０期 等ＩｇＹ抗体。如万钧等用ＩＢＤ油乳剂灭活苗肌注１ 毫升／只，１０－１４天后进行二免，每只肌注３毫升， 二免后１０天三免，每只肌注５毫升，获得琼扩效 价１：２５６以上的高免卵黄抗体。 ３ ＩｇＹ抗体的提取和纯化 免疫球蛋白资源的开发一直没有重大进 展，国际上从７０年代末就开始研究从牛奶、乳 清、初乳和血液中提取免疫球蛋白的技术和工 艺，但由于资源不足，进展不大。直到近几十 年，各国学者开始研究从卵黄中提取免疫球蛋 白Ｉ ，鸡蛋成为提取免疫球蛋白的最佳资源， Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅ】称母鸡为高效率、高质量的抗体生 产厂。 鸡卵黄中含有水分４８．０％，蛋白质１７．８％和脂 肪３０．５％，其中大部分脂肪与蛋白质结合以脂蛋白 的形式存在。卵黄包括水溶性蛋白（ 一卵黄球蛋 白，ａ一卵黄球蛋白，１３一卵黄球蛋白， 一卵黄球蛋 白即为ＩｇＹ）；｝｝Ｉ各种脂蛋白，￣ＩＬＤＬ、ＨＤＬ等。所以 分离纯化ＩｇＹ的关键步骤是除去卵黄中高含量的 脂及脂蛋白。Ｉ 的分离纯化方法已有很多报道， 现介绍如下： ３．１ ＩｇＶ的分离提取 ＩｇＶ的初步提取有很多种方法，Ｊ￣［］ｐｏｌｓｏｎ１９８０ 年提出的ＰＥＧ法，卵黄用缓冲液稀释后，分别用终 浓度为３．５％和１２％的ＰＥＧ沉淀。１９８５年又对此方法 进行改进，与冷乙醇沉淀结合，提高了产量，ＩｇＶ 得率为４．９ｍｇ／ｍＬ，纯度是８９％。 Ｉｅｎｓｅｎｉｕｓ１９８１年提出硫酸葡聚糖法，卵黄稀 释后用１０％和１９％的硫酸葡聚糖沉淀，再与硫酸 钠沉淀结合，Ｉ 得率为７．５ｍｇ／ｍＬ，纯度是８７％。 Ｈａｊｉｍｅ １９９０年比较了多种天然胶沉淀脂蛋白制 备Ｉ ，结果表明入一角叉藻胶效果最好，其次是 黄原胶。用黄原胶去脂蛋白后，用硫酸钠两步沉 淀，ＩｇＶ得率是７．３ ｍｇ／ｎ￣，纯度为８９％。之后 Ａｋｉｔａ提出了水稀释法，将卵黄用水稀释１０倍后， 调ｐＨ值至５．２，４℃静置６１１，时以上，上清液经硫 酸钠沉淀、超滤等，ＩｇＶ得率是９．８ｍｇ／ｍＬ，纯度为 ９４％，Ａｋｉｔａ对以上四种方法在产量、纯度、简便性 等作了比较，结果表明，水稀释法产量高，去脂 效果好，且经济、简便易大规模生产。Ｂａｄｅ于１９８４ 年用冷丙二醇和丙酮多次沉淀提取ＩｇＹ，活性未 Ｃｈｉｎａ Ｐ０ Ｖｏ１．２４，Ｎｏ．２０．２００２ 损失。 １９９３年，Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ提出冷乙醇多步沉淀法，卵 黄用水稀释８倍，离心上清液分别经６０％、３０％、 ２５％冷乙醇沉淀即得到纯度＞９９％的ＩｇＶ，回收率 为４０％，比其它方法较低。 ３．２ ＩｇＶ的纯化 ＩｇＶ的进一步纯化主要采用层析技术。最常 用的是离子交换层析。Ｈａｔｔｅａ用ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｃｅｌ柱 层析纯化，用２０ｍＭ ｐＨ８．０磷酸缓冲液平衡，相同 的缓冲液清洗（２０倍柱体积），吸附的蛋白质用 ０．２Ｍ ｐＨ８．０缓冲液洗脱（５倍柱体积），Ｉ鸯Ｙ纯度达 ９８．３％，产率为７３％。Ａｋｉｔａ用水稀释法再经盐沉淀 后，上ＤＥＡＥ层析柱，纯度达９８％，产量为９．８ｍｇ／ ｍＬ卵黄。我国学者杨德用ＤＥＡＥ葡聚糖Ａ５０柱层 析，含０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１的０．０１５ｍｏｌ／Ｌ Ｔｉｓ—ＨＣ１缓 冲液分段洗脱ＩｇＹ，纯化方法简单且纯度较高。离 子交换层析之后如需更纯的ＩｇＹ可经凝胶过滤继 续纯化。 ‘ Ｈａｓｓｌ等用疏水层析和凝胶过滤提纯ＩｇＶ，样 品先经苯基琼脂糖ＣＬ一４Ｂ柱，用０．０１６Ｍ ＰＢＳ冲洗 出去未结合蛋白，用去离子水洗脱，收集洗脱蛋 白，然后加于用ＰＢＳ平衡的Ｓｅｐｈａｃｒａｙｌｓ一３００柱上， 再经Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ｓ一３００层析柱，收集ａ．ｎ１．ｕ．为１７５ｋｄ 的蛋白组分。 采用亲和层析纯化可得到纯度较高的特异 性ＩｇＹ，但是ＩｇＹ不与蛋白Ａ和蛋白Ｇ结合， Ｈａｎｓｅｎ使用亲硫作用层析纯化ＩｇＶ。这种亲硫层 析吸附剂中含有２一巯基乙醇与二乙烯砜反应 的活性支持物，称Ｔ一胶，能在高盐环境下选择 性地结合ＩｇＶ。Ｔ一胶的制备方法是：Ｓｅｐｈｒｏｓｅ— ＣＬ一４Ｂ用二乙烯砜在ｐＨ＝１２时活化６８，时，然 后在ｐＨ＝１１时与０．１Ｍ的２一巯基乙醇反应１小 时。这样制备出的胶对ＩｇＶ吸附作用强，ＩｇＶ回 收率为９９％。 １９９７年Ｇｒｅｅｎｅ等用固相金属离子亲和层析 纯化ＩｇＹ。用亚氨乙酰乙酸（ＩＤＡ）活化的琼脂糖 ６Ｂ装柱，然后用ＦｅＣｌ ・６Ｈ Ｏ将柱转化成ＩＤＡ— Ｆｅ 的形式，用５０ｍＭ ＭＥＳ平衡，ＩｇＶ提取液经Ｉ— ＤＡ－Ｆｅ 柱纯化，ＩｇＶ部分得到４个洗脱峰，ＩｇＹ分 成４个亚群。 ２０００年Ｖｅｒｄｏｌｉｖａ合成一种新的配基ＰＡＭ（模 仿蛋白Ａ，ＴＧ１９３１８），用这种配基的亲和层析柱 一
鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体的研制
２０１３年第１１期（总第２０２ 试验研究 鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体的研制 邹晓娟 （山东省乳山市徐家兽医站２６４５００） 摘要将鸭坦布苏病毒浓缩后制备灭活苗，免疫试验鸡制备卵黄抗体，鸡胚中和试验表明，第３次免疫后１５ｄ，卵黄 抗体中和效价为１：１０ 一，雏鸭攻毒保护试验结果表明，预防组和治疗组的保护率分别达到９０％和７８％，说明本试验制备的 卵黄抗体对鸭坦布苏病毒病有着显著的预防和治疗作用。 关键词鸭坦布苏病毒卵黄抗体中和效价预防与治疗。 中图分类号：￥８５２．矿３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７－１７３３（２０１３）１１－００１５－０２ 自２０１０年４月份，鸭坦布苏病毒病在我国浙江、福 建、广东、广西、江苏、山东、北京等主要养鸭地区陆 续出现，该病毒可感染产蛋鸭、育成鸭和商品肉鸭，产 蛋鸭发病表现为产蛋量严重下降，可从９０％以上降至１０％ 以内，严重的甚至绝产，患病后期出现神经症状，死淘 率升高，剖检感染鸭可见明显的卵泡出血和变性；育成 鸭和商品肉鸭发病出现神经症状，转圈，翻个站不起 来，淘汰率在１００／０－３０％，严重时可达到８０％，剖检可见 脑组织病变，脑膜水肿、充』ｎＬ。该病传播迅速、波及面 广，几乎席卷了整个养鸭密集地区，给我国养鸭业造成 了巨大损失【 ｌ２】。目前，本病尚无有效的预防和治疗措 施。高免卵黄抗体的治疗效果已在长期的临床实践中得 到了认可，特别在鸡传染性法氏囊、鸭病毒性肝炎等禽 病的治疗和预防中效果确实可靠，本试验尝试利用鸭坦 布苏病毒灭活疫苗免疫试验鸡，制备高免卵黄抗体来治 疗该病。通过雏鸭攻毒保护试验发现，本试验制备卵黄 抗体具有良好的预防与治疗作用。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１ 鸭坦布苏病毒 由山东省农科院家禽研究所分离 保存。 １．１．２ ＳＰＦ鸡胚 由山东省农科院家禽研究所提供。 １．Ｉ．３试验用鸡由山东省威海市某蛋鸡场提供。 １．２方法 １．２．１ 鸡胚半数致死量（ＥＬＤ５０）和鸡胚最小致死量平均死 亡时间（ＭＤＴ）的测定 将鸭坦布苏病毒分别做１０～、１Ｏ‘ 、１Ｏ一、ｌＯ一、１０一、ｌＯ。 六个稀释度，经尿囊腔接种ｌＯｄ 龄ＳＰＦ鸡胚，０．Ｉｍｌ／枚，各５枚，接种后７ｄｇＪ观察鸡胚死亡 情况，并用Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法计算其ＥＬＤ５ｏ。用灭菌生理盐 水将鸭坦布苏病毒分别做１０～、ｌ０一、ｌ０一、ｌ０～、ｌ０一、 因此，增加泌乳量对母羊和羔羊均有积极的作用。目前 对母羊泌乳不足的调理方法有很多，主要有通过饲养管 理、乳房的按摩刺激、激素控制、中药调理等，其中利 用中药调理母畜泌乳不足的研究有很多，中药成份种类 多，笔者选用民间常用２种配方，研究其对母羊泌乳的影 响，结果两种中药配方均能很好的促进母羊泌乳，提高 母乳喂养率。很多中药都有下乳的作用，如木通、王不 留行、穿山甲、通草等。养殖场，可结合本场情况，选 择合适中药组方，结合饲养管理，增加泌乳量。 ４结论 利用中药和结合饲养管理的方法可以促进小尾寒羊 的泌乳，提高羔羊成活率。是解决小尾寒羊产仔数多， 相对泌乳量不足的临床问题值得推广的好方法。 参考文献 【ｌ】侯海锋，任文社．中草药添加荆在畜禽生产中的作用及研发【Ｊ］．保 定职业技术学院学报．２０１０．Ｏ１． 【２】李盎，单安山．绿色饲料添加剂一中草药在畜牧生产中的应用研究 进展【Ａ】．饲料营养研究进展一第五届全国饲料营养学术研讨会论文 集［Ｃ】．２００６． ［３】陈小银．中药饲料添加剂在动物保健上的研究进展【Ｊ】．畜禽业． ２００８．０２． ［４】张淑云，王忠红，李德竹等．中草药饲料添加剂对奶牛泌乳性能的 影响［Ｊ］．河南畜牧兽医．２００４．０６． ［５】李苗云，葛长荣．中草药饲用添加剂应用于畜禽的研究叨．饲料研 究．２００３．０３． 【６】麻延蜂，王宏艳．中草药饲料添加剂提高奶牛产奶量效果研究【Ｊ】． 家畜生态学报．２００５．０２． ［７】赵旭．中草药饲料添加剂研究进展及其在动物生产中的应用【Ａ】． ２０１０ｆｌｌ东饲料科学技术交流大会论文集【Ｃ】．２０１０． （收稿日期：２Ｏ１３＿０７－０６）