激光共聚焦显微镜样品制备方法讲解

电子显微学报J.Chin.Eleetr.Microse.Soc.第29卷

图I气体CO:冷冻装置。

Fig.1Gas C02frozen equipment.

镜下操作后,置于干冰上(临时无干冰,也可置于一80℃冰箱,待冷冻完全后,将样品移至冷冻切片机中,温度平衡后,将样品从冷冻包埋模具中取出,进行冷冻切片。冷冻包埋模具见图2。

图2冷冻包埋模具。

Fig.2Frozen embedding mold.

液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些的组织块也可采用此方法冷冻。将组织块置于样品台的OCT中,为防止组织块爆裂,先在液氮中迅速浸提几次,时间

从1s开始逐渐增加,直至样品温度与液氮温度平衡,之后移至冷冻切片机中,使温度与切片机箱体温度一致,进行冷冻切片。

直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上,于冷冻切片机(箱体温度在一20℃以下中直接冷冻。

3冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从一80℃冰箱中取出,室温放置10min,待切片回温并干燥,浸于PBS中10min 洗去OCT,可以无需Triton处理,即可进行免疫荧光抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同口]。反应在避光湿盒中进行,反应结束时用无荧光封固剂封片,4oC保存。先用荧光显微镜观察,确认标记成功,移至激光共聚焦显微镜扫描成像。

4荧光染料及荧光蛋白

传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluoresein

isothiocyanate,FITC,ex490nm/em520 nm、四甲基异硫氰酸罗丹明

(TRITC,ex550nm//em 620am、罗丹明(Rhodamine,ex560nm/em540~ 660nnl、四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine, TMR,ex570nm/em595—600nm、德克萨斯红(Texas red,ex592nm/em610rim、氨甲基香豆素(Aminomethylcoumarin acetic

acid,AMCA,ex345 nm/em425am等,结合激光共聚焦显微镜技术的发展,这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。如Cyanine类荧光染料,其中Cy3 (ex554nm/em568nm的激发峰值更接近于新型固体561am激光器,且比TRITC等更亮、更稳定,已被广为应用于免疫荧光抗体标记旧1;Alexa Fluor系列荧光染料激发和发射光谱窄,可用于多重荧光标记而更少光谱重叠;ATTO系列荧光染料具有较强的光稳定性和热稳定性,已被应用于STED (Stimulated Emission Depletion受激发射损耗超高分辨率显微成像技术¨1;DyLigh、CF等更多新型荧光染料系列都将因其较高的激发效率、良好的光稳定性、宽泛的PH稳定性等优越的特性而被广泛的应用于组织及细胞免疫荧光标记。

组织切片的细胞核标记目前仍然采用DAPI(4, 6一联脒一2-苯基Ⅱ引

哚,ex359nm/em461am,其特点是专一性强、灵敏度高、稳定性好、毒性小,且可被

405am激光器有效地激发,获取明亮的核标记荧光图像。PI(碘化丙啶

ex536am/em617llm也可以用于核标记,因其可识别DNA和RNA,核染色前须进行适当的RNA酶处理。TOTO系列、YOYO系列荧光染料也可作为组织细胞核荧光染料。

表达荧光蛋白的组织经冷冻切片制样后,可直接封片,观察并扫描图像,也可配合使用其它荧光染料进行免疫荧光抗体标记和核染色。同时表达GFP和RFP荧光蛋白的组织切片,如还需作免疫荧光抗体标记,应选择可以被633am和405nm波长激光器激发的荧光染料,如CY5、Alexa fluor633和Alexa fluor405等。

5样品制备中相关实验方法

用于免疫荧光抗体标记组织切片的载玻片需

激光共聚焦显微镜样品制备方法(二——组织切片样品

作者:边玮, BIAN Wei

作者单位:中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海,200031

刊名:

电子显微学报

英文刊名:JOURNAL OF CHINESE ELECTRON MICROSCOPY SOCIETY

年,卷(期:2010,29(4

参考文献(5条

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