细菌药敏实验原理
纸片琼脂扩散实验报告
一、实验目的1. 了解纸片琼脂扩散法的原理和操作步骤。
2. 掌握纸片琼脂扩散法的应用，评估细菌对不同抗菌药物的敏感性。
3. 分析实验结果，为临床用药提供依据。
二、实验原理纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer法）是一种常用的细菌药敏试验方法。
其原理是将含有定量抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上，药物在琼脂中扩散，形成递减的浓度梯度。
当纸片周围的药物浓度低于细菌的最小抑菌浓度（MIC）时，细菌生长被抑制，形成无菌生长的透明圈，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物浓度和细菌敏感性呈负相关。
三、实验材料1. 细菌菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等。
2. 抗菌药物纸片：青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、庆大霉素等。
3. 琼脂培养基：水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton琼脂，MH琼脂）。
4. 无菌器械：接种环、镊子、酒精棉球等。
5. 环形量器、纸片分配器、计时器等。
四、实验步骤1. 准备工作：将MH琼脂培养基熔化，待冷却至约45℃时，倒入平板中，待凝固。
2. 接种：用接种环挑取适量细菌菌种，涂布于平板表面，均匀分布。
3. 贴药片：用纸片分配器或镊子将抗菌药物纸片贴于平板表面，纸片中心距离平板边缘不小于15mm，纸片间距不小于24mm。
4. 观察与记录：将平板放入37℃恒温箱中培养18-24小时，观察并记录抑菌圈的大小。
5. 结果分析：根据抑菌圈的大小，查阅药物敏感谱，判断细菌对不同抗菌药物的敏感性。
五、实验结果与分析1. 金黄色葡萄球菌：对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟均表现为敏感，抑菌圈直径分别为15mm、10mm、20mm；对庆大霉素表现为耐药，无抑菌圈形成。
2. 大肠杆菌：对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟均表现为耐药，无抑菌圈形成；对庆大霉素表现为敏感，抑菌圈直径为18mm。
3. 肺炎克雷伯菌：对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟均表现为耐药，无抑菌圈形成；对庆大霉素表现为敏感，抑菌圈直径为16mm。
根据实验结果，金黄色葡萄球菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟敏感，对庆大霉素耐药；大肠杆菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟耐药，对庆大霉素敏感；肺炎克雷伯菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟耐药，对庆大霉素敏感。
纸片法(KB)药敏实验原理及实际操作方法
纸片扩散药敏试验的原理：将含药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
药敏试验根据美国临床标准委员会 (NCCLS) 推荐的 K–B 琼脂法进行。
本实验通过纸片药敏试验法观察多酸化合物对细菌有无抑制作用，为试管二倍稀释法提供有效基础数据。
用无菌棉拭子蘸取已经校正的 0.5 麦氏比浊浓度的菌液，挤掉多余菌液。
用棉拭子涂布整个 MH 培养基表面，每次将平板旋转 60°，涂抹三次，最后沿周边擦绕两圈，以保证菌液涂抹均匀。
待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴含药纸片。
用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴后不可再拿起。
每个平板贴 5 张纸片，纸片间距不少于 24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于 15 mm。
在菌接种后 15 min内贴完纸片。
将平板反转，37℃恒温孵育 18~24 h 后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，由平板背面测量最接近的整数毫米数并记录，每个平板各设三个平行组平板，测量抑菌直径时，应取三个平板的平均值为最终结果。
抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
每次药敏试验用大肠杆菌ATCC25922 和金黄色葡萄球菌ATCC25923 做质控。
药敏判读标准根据 CLSI 标准 (2009 年) 所载受试药对质控菌的抑菌环直径范围作为实验质控标准（判读标准见表 5-2）[84]。
表5-2 纸片扩散法－用质控菌株抑菌环直径(mm)允许范围监测抗菌药物敏感性试验准确性Table 5-2 Disc diffusion test － according the admissible range of quality-control strain’s inhibition zone diameter to monitor the accuracy of antibioticssusceptibility test (mm)抗菌药物纸片含药量（µg）抑菌环直径(mm)S I R大肠埃希菌ATCC25922金黄色葡萄球菌ATCC25923KF 30 ≥1815–17 ≤1416–22 27–35 AMP 10 ≥1714–16 ≤1328–35 27–28 CIP 5 ≥2116–20 ≤1530–40 22–30 NOR 5 ≥1713–16 ≤1215–21 29–37 KF: 头孢噻吩；AMP: 氨苄西林；CIP: 环丙沙星；NOR: 诺氟沙星；S: 敏感；I: 中介；R: 耐药。
实验6：纸片扩散法测定微生物的药敏性
实验6 抗生素等对细菌的药敏性检测antimicrobial susceptibility testing in vitro（圆盘滤纸片法disc diffusion test）一、实验目的：1、了解抗生素及化学试剂对微生物生长的影响2、掌握不同化学试剂的作用原理、常用浓度及使用方法二、实验原理许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。
凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。
原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。
不同化学药品或同一化学药品对不同微生物的杀菌能力不同，此外，试剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。
应用前需进行试验，灵活选择。
三、实验器材1、菌种：培养24~28 h大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种。
2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液3、仪器与其他用品：无菌平皿，无菌吸管（1ml），酒精灯，接种环，涂布棒，无菌滤纸片，无菌镊子，记号笔, 消毒棉球和培养箱。
四、实验步骤（以金黄色葡萄球菌操作为例）（1）菌液制备：将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。
（2）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。
（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）（3）涂平板：无菌操作，用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）。
将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
第4章抗菌药物敏感试验
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
药敏试验科普
02
常规经验治疗 效果不佳或又 较高失败风险 时
03
对感染菌的耐 药性无法估计 时
04
需要了解微生 物耐药性变迁 时
二、药敏试验怎么做
纸片扩散法
原理：
一定药物含量的碟形抗生素纸片贴在 涂 布 一定浓度菌液的琼脂上，过夜培养后抗生素扩散 到纸片周围的琼脂中，形成一定浓度区域，越靠近纸片的浓度越高，反之越低。
合用药；或可选择泰利霉素等。 • 高浓度氨基糖苷类（S）：可用青霉素、氨苄青霉素或万古霉素与氨基糖苷类联合用药。 • 高浓度氨基糖苷类（R）：表示青霉素、氨苄青霉素或万古霉素与氨基糖苷类联合用药无效。
常见致病菌的药敏结果
肠杆菌科
药敏结果：一代头孢菌素类（S），氨基糖苷类（S）；一代（二代）头孢（R），氨基糖苷类（R），三代头孢（S）；三代 头孢（R），头孢西丁（S）；三代头孢（R），头孢西丁（R），亚胺培南（S）
当低到一定程度（MIC最低抑菌浓度以下）时药物无法抑制细菌生长，从而形成界限分明 的抑菌环
通过抑菌环大小与MIC值高低之间的统计学分布关系，经过回归处理可以求出细菌对某种 抗生素的MIC折点范围对应的抑菌环大小值。
药敏试验怎么做
稀释法
常量法：肉汤稀释法、琼脂稀释法
微量法：微量肉汤稀释法
参考方法常量法：将标准接种物加入含对倍稀释抗生素的MH肉汤管中，过夜培养。MIC即是能 抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所表示的浓度值。
缺点： 成本太高，常规试验 很难应用；局限性， 主要用于苛养菌和厌 氧菌
E-Test
三、药敏试验结果怎么看
敏感（S）
表示由该菌引起的感染可以用 常规剂量的该抗菌药物治疗， 禁忌症除外。
A B
第七章细菌对抗菌药物敏感性的检验
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3、菌量 待检菌液的浓度、接种量，取决于麦氏 比浊标准管的配制、保存和正确使用4、操作方 法 5、培养条件、温度和时间控制 6、抑菌环测量工具的精度及测量方法 7、质控标准菌株本身的药敏特性是否合格
谢谢！
一般选择有代表性的药物做药敏试验分首选次选等层次首选药是针对不同种类病原菌的最佳选择次选药只在病原菌对首选药物不敏感或病人对首选药过敏的情况下选用kkbb一原理一原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在己接种待检菌的琼脂平板上纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后借其分子扩散力不断向周围区域扩散随着距离的增加形成递减的浓度梯度在纸片周围抑菌浓度范围内被检菌的生长受抑制形成无菌透明的抑菌圈
二、实验材料
• 1．药敏纸片 • 2．培养基 • 3．菌液 • 1)药敏试验标准比浊管的制备:0.048m0l/L(1.175%) 氯化钡0.5m1加0.18m0l/L(1%)硫酸溶液99.5ml充分混 匀，其浊度为0.5麦氏比浊标准，分装试管，置室温下 暗处保存。使用前应充分混匀，每半年重配一次。 • 2)被检菌液的制备:用接种环挑取已分纯的被检菌菌落 4-5个，接种于3-5mlMH肉汤，35C培养4小时。链球 菌属和嗜血杆菌属需在5%羊血MH肉汤中培养过夜， 淋病奈瑟菌需在5%-7%C02条件下培养。用生理盐水 或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准，校正后的菌 液应在15分钟内接种。
三、药敏试验的常用方法
1、 纸片扩散法 2、稀释法 稀释法包括宏量肉汤稀释法(macrodilution test)、微 量肉汤稀释法(microdilution test)、琼脂稀释法(agar dilution test)。 3、E-test法
1.扩散法
• 1)方法：是将含有定量抗菌药物纸片(药敏纸片) 贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂 内向四周扩散，其浓度逐渐递减，使纸片周围 的敏感细菌在一定距离内的生长受到抑制，形 成抑菌圈，再测量抑菌圈的直径来判定待检菌 对被测药物的敏感程度。 2）其优点：是方法简单易行、价格便宜、药物 选择性灵活，适用对生长快的细菌进行药敏试 验。 3）缺点：是该方法操作时影响因素较多，需注 意控制。
细菌药敏试验报告
细菌药敏试验报告试验目的：本次试验旨在了解不同细菌对不同抗生素的敏感性情况，为制定治疗方案提供参考。
试验原理：通过对不同品种的细菌进行耐药性测试，可以确定其对各类抗生素的敏感性情况。
常用的药敏试验方法包括扩散法、碟扩散法、荧光染色法等。
本次试验采用了碟扩散法，将抗生素置于小型圆形纸片上，贴于培养基表面，观察形成的菌落周围的抑制圆来判断细菌对该抗生素的敏感性情况。
试验过程：1.准备工作：制备不同浓度的抗生素和培养基。
2.取样：将不同类型的细菌分别提取复制，并用增殖培养基培养。
3.打药敏试验：将抗生素置于小型圆形纸片上，贴于培养基表面。
4.观察结果：观察形成的菌落周围的抑制圆来判断该细菌对该抗生素的敏感性。
试验结果：根据本次试验结果，不同类型的细菌对不同抗生素的敏感性情况如下：菌种青霉素红霉素头孢菌素氯霉素大环内酯金黄色葡萄球菌敏感中度敏感抗性抗性中度敏感肺炎链球菌敏感中度敏感中度敏感抗性中度敏感大肠杆菌中度敏感抗性抗性敏感中度敏感沙门氏菌中度敏感抗性抗性敏感中度敏感结论：根据上述结果，我们可以得出以下结论：1.在治疗金黄色葡萄球菌时，不推荐使用头孢菌素或氯霉素，应优先考虑青霉素或红霉素。
2.肺炎链球菌对头孢菌素和氯霉素的反应不如青霉素，建议优先使用青霉素。
3.大肠杆菌和沙门氏菌对许多常见抗生素耐药，建议在治疗时注意综合考虑，选择适当的治疗方案。
提示：为保证试验结果准确可靠，建议在试验过程中注意以下事项：1.使用无菌器皿和工具，以免污染培养基和细菌样本。
2.制备完善、严格控制抗生素的浓度，避免因药效差致使结果不准确。
3.在选择抗生素和制定治疗方案时，应根据不同的病原菌和临床情况综合考虑。
抗菌药物敏感性试验与细菌耐药性检测
2.试验方法及结果判读
三、实验内容
1、实验材料
（1）药敏纸片： ① 用于G+c：红霉素、克林霉素、万古霉素、替考
拉宁、复方新诺明、新生霉素、头孢 西丁 ② 用于G-b：环丙沙星、亚胺培南、头孢曲松、 头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、 阿莫西林/棒酸
（2）菌株： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌标准菌株；
3、掌握葡萄球菌克林霉素诱导耐药（D试验） 的检测方法及结果判读。
二、实验原理
（一）抗菌药物敏感性试验检测
（二）细菌耐药表型检测
（一）抗菌药物敏感性试验
四种方法
1、纸片琼脂扩散法（K-B法） 2、稀释法 （1）肉汤稀释法 （2）琼脂稀释法 3、E-test法 4、联合药敏试验
纸片琼脂扩散法
1.基本原理
2、试验方法
MRS菌株的表型检测方法主要有头孢西丁 纸片扩散法、苯唑西林稀释法和苯唑西林盐 平板筛选试验，以头孢西丁纸片扩散法最常 用。
头孢西丁纸片扩散法解释标准
葡萄球菌克林霉素诱导耐药的检测 （D-test）
1.基本原理：
对大环内酯类耐药的葡萄球菌可能有天 然或诱导性对克林霉素的耐药，或只对大环 内酯类耐药。本试验可以测定诱导性的克林 霉素耐药。
2、什么叫D-test？该项检测有何意义？
2.试验方法
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3.结果判读
用游标卡尺量取抑菌环直径，根据CLSI标准， 报告细菌对该抗菌药物是敏感（S）、中介 （I）还是耐药（R）。
4.注意事项
（1）菌液浊度应配制成0.5麦氏单位； （2）菌液调配好后应在15min内接种完； （3）菌液涂布药敏琼脂后应放置3-5min再贴
药敏纸片； （4）贴完纸片后不能再移动纸片；
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验
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细菌药敏实验原理
细菌药敏实验是一种用于确定哪种抗生素对特定细菌最为有效的实验方法。
其原理基于以下几个方面：
1. 抗生素的作用机制：抗生素通过干扰细菌的代谢、细胞壁合成、蛋白质合成等过程来发挥杀菌或抑菌作用。
不同的抗生素作用于不同的靶点，因此对不同的细菌可能具有不同的效果。
2. 药敏试验的方法：药敏试验通常采用纸片扩散法、肉汤稀释法或 E-test 法等。
这些方法的基本原理是将含有抗生素的纸片、肉汤或纸条放置在涂有细菌的培养基上，观察抗生素对细菌生长的抑制作用。
3. 抑菌圈的大小：在纸片扩散法中，抗生素会从纸片中扩散到培养基中，形成一个抑菌圈。
抑菌圈的大小与抗生素的浓度和活性成正比，因此可以通过测量抑菌圈的直径来判断抗生素对细菌的敏感性。
4. 最低抑菌浓度（MIC）：在肉汤稀释法和 E-test 法中，通过稀释抗生素的浓度，可以确定抑制细菌生长所需的最低抗生素浓度，即最低抑菌浓度（MIC）。
MIC 越低，说明抗生素对细菌的敏感性越高。
5. 药敏试验结果的解读：根据药敏试验的结果，可以将细菌分为敏感、中介和耐药三类。
敏感细菌表示该细菌对抗生素敏感，使用该抗生素治疗效果较好；中介细菌表示该细菌对抗生素的敏感性较低，需要使用更高剂量的抗生素或联合使用其他抗生素；耐药细菌表示该细菌对抗生素具有耐药性，使用该抗生素治疗无效。
细菌药敏实验的原理是基于抗生素的作用机制和药敏试验的方法，通过观察抗生素对细菌生长的抑制作用，确定抗生素对细菌的敏感性，为临床医生选择合适的抗生素提供依据。